Bepaling van zelf- en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in abrikoos die handbestuiving, microscopie en genetische analyses combineren

Deze methode kan helpen bij het bepalen van bestuivingsvereisten bij verschillende soorten en het tot stand brengen van onverenigbaarheidsrelaties tussen cultivars. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is dat het mogelijk maakt om verschillende onverenigbaarheid onder laboratoriumomstandigheden te evalueren. Het vermijden van de vele problemen die kunnen optreden in experimenten uitgevoerd onder veldomstandigheden.

Dit maakt identificatie mogelijk samen met toewijding van een aantal cultivar aan de overeenkomstige onverenigbaarheidsgroepen. Het bepalen van de intercompatibiliteitsrelatie tussen cultivars. Deze aanpak kan ook nuttig zijn om zelf-onverenigbaarheid en onverenigbaarheid relatie in andere fruitboom gewassen zoals kersen of pruim te bepalen.

Begin met het proeven van de bloemen in het veld. Verzamel de bloemen op ballonstadium, die overeenkomt met fase 58 op de BBCH-schaal voor abrikoos om eerdere bestuiving te voorkomen. In het laboratorium, verwijder de anthers van de bloemen en leg ze op een stuk papier te drogen bij kamertemperatuur.

Na 24 uur zeef je de stuifmeelkorrels met een fijn gaas van 26 millimeter. Emasculate een groep van 30 bloemen op dezelfde ballon ontwikkelingsfase voor elke zelf-en kruisbestuiving en plaats de pistolen op bloemist schuim in water 24 uur na emasculatie en bestuiven de pistolen met behulp van een verfborstel met stuifmeel van bloemen van dezelfde cultivar. Bestuiven een andere set pistolen van elke cultivar met stuifmeel van bloemen van een compatibele bestuiver als een controle.

Na 72 uur, verwijder de pistolen van de natte bloemist schuim en bevestig de pistolen in een fixatieve oplossing van 3:1 ethanol tot azijnzuur voor ten minste 24 uur op 4 graden Celsius. Gooi vervolgens de fixatieve en voeg 75% ethanol, ervoor te zorgen dat monsters volledig worden ondergedompeld in de oplossing. Monsters kunnen worden opgeslagen in de ethanol op 4 graden Celsius tot gebruik.

Verstrooi de stuifmeelkorrels van dezelfde cultivars die worden gebruikt voor de bestuivingen in gestold stuifmeelkiemingsmedium en observeer ze na 24 uur onder de microscoop. Bereid de pistolen voor microscopie door ze 3 keer te wassen met gedestilleerd water gedurende een uur per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, laat ze in 5% natriumsulfaat op 4 graden Celsius voor 24 uur.

Dan autoclave ze op een kilogram per centimeter kwadraat gedurende 10 minuten in natriumsulfaat om het weefsel te verzachten. Plaats de autoclaved pistolen over een glazen glijbaan en gebruik een scalpel om de trichomen rond de eierstok te verwijderen. Dan squash het pistool met een coverglass.

Breng een druppel anilineblauw over de preparaten aan om eeltige afzettingen te bevlekken tijdens de groei van de pollenbuis en observeer de pollenbuizen langs de stijl met een microscoop volgens de handschriftaanwijzing. Gebruik een commerciële kit om genomisch DNA te extraheren uit jonge bladeren verzameld in het voorjaar. Stel pcr vervolgens in door reagentia te combineren volgens de handbeschrijvingen van het manuscript.

Vortexing de reactie mix en verdelen onder de putten in de PCR plaat. Voeg 1 microliter van de DNA-verdunning toe aan elke put en voer PCR uit met behulp van het thermo-cycling programma dat in het manuscript wordt beschreven. Zodra de reactie is voltooid, analyseren van de resultaten met behulp van capillaire elektroforese of agarose gel elektroforese.

Voor capillaire elektroforese voeg 1 microliter van het PCR-product toe in de put van de lezerplaat, samen met 1 druppel minerale olie om verdamping van water te voorkomen. Bereid vervolgens de scheidingsplaat voor door scheidingsbuffer toe te voegen. Gebruik de commerciële software voor de genanalyzer om een nieuwe monsterplaat te maken en sla de monsternamen op voor alle putten op de plaat.

Selecteer vervolgens de analysemethode en voeg de twee platen in de genanalyzer. Vul de capillaire array met gedestilleerd water. Laad de lineaire polyacrylamide gel en klik op run.

Als het analyseren van de PCR resultaten met gel elektroforese, bereiden een 1%agarose gel door het oplossen van agarose in elektroforese lopende buffer volgens manuscript richtingen. Voeg vervolgens 4 microliter nucleïnezuurvlek toe aan de gel en meng zachtjes. Zet een gel lade met een kam en vertragen giet de gel in het midden zorgen om bubbels te voorkomen.

Laat de gel op kamertemperatuur tot volledig gestold, ongeveer 30-45 minuten. Zet dan in de elektroforese kamer. Verwijder de kam en bedek deze met een 1x TAE buffer.

Laad de gel met de DNA-ladder, gevolgd door de PCR-producten gemengd met ladingkleurstof. Voer vervolgens de gel op 90 volt gedurende 60-90 minuten tot de blauwe kleurstof lijn is op ongeveer 75% van de gel lane. Zodra de run is voltooid, visualiseren van de gel met behulp van een transilluminator.

Pollen buis groei in zelf-en kruisbestuivingen werd waargenomen door fluorescentie microscopie om zelf (in)compatibiliteit voor elke cultivar te bepalen. Cultivars werden beschouwd bij zelf-onverenigbaar toen de groei van de stuifmeelbuis werd gearresteerd en zelf-compatibel toen minstens één stuifmeelbuis de basis van de stijl bereikte. 5 primers paar combinaties werden gebruikt om S-alleles te identificeren met behulp van PCR in combinatie met capillaire of gel elektroforese.

Ten eerste werden de S-alleles geïdentificeerd door de versterking van de eerste S-RNase intron met behulp van de SRc primer pair. Vervolgens werd de tweede intron van de RNase versterkt met drie primer sets om S6, S9, S1 en S7 allelen te onderscheiden. En de V2 en HVB variabele regio's van het SFB-gen werden versterkt met de AprFBC8 primer ingesteld op de Sc en S8 allelen te identificeren.

Zodra de S-allelen zijn geïdentificeerd, kunnen verschillende onverenigbaarheidsgroepen met de genotypen die onderling onverenigbaar zijn, worden vastgesteld. Het is belangrijk om te onthouden om controle te gebruiken bij capillaire elektroforese, omdat ze een automatisch fragmentanalysesysteem gebruiken dat kan rapporteren als meer verschillen in fragmentgrootte waardoor onnauwkeurige allel-identificatie wordt veroorzaakt. De combinatie van microscopie-waarnemingen en genetische analyse heeft geleid tot een zeer nuttige benadering om zelf-onverenigbaarheid in abrikoos te bepalen en de onverenigbaarheidsrelaties tussen cultivars vast te stellen.

Zelf-incompatibiliteit is nu de link naar de lokale bevolking in abrikoos. De bepaling van factoren lijkt te zijn betrokken. Toekomstige inspanningen moeten gericht zijn op de genetische opbouw van deze cultivar in abrikoos.

De combinatie van deze documentaire benadering resulteert in waardevolle informatie voor de juiste selectie van cultivars in commerciële boomgaarden en patroongenotypes in abrikozenfokprogramma's. Een soortgelijke aanpak kan worden gebruikt in andere houtachtige meerjarige gewassen.