3D-beeldvorming van zachte weefselmonsters met behulp van een X-Ray-specifieke kleurings methode en nanoscopische computertomografie

Ons nieuwe protocol stelt ons in staat om cellulaire structuren in 3D te visualiseren met behulp van x-ray computertomografie. En we doen dit door weefsel te bevlekken met eosine en op die manier het cytoplasma zichtbaar te maken. Naast medische toepassingen en onderzoek denken we ook dat onze methode kan worden toegepast in de biologie, zoals bijvoorbeeld zoölogisch onderzoek of ontwikkelingsbiologie.

De techniek is relatief eenvoudig, zeer snel, en ook geschikt voor grotere weefselmonsters. We denken dat onze aanpak in combinatie met x-ray micro computertomografie kan worden geïntegreerd in de klinische workflow en vervolgens daadwerkelijk helpen pathologen betere beslissingen te nemen. Begin met het fixeren van de zachte weefselmonsters.

Vul een 50 milliliter centrifugebuis met een fixatieve oplossing die 9,5 milliliter 4% formaldehyde en 0,5 milliliter glaciale azijnzuur bevat. Voeg het zachte weefselmonster toe aan de centrifugebuis en koel het gedurende 24 tot 72 uur. Na het koelen was je het zachte weefselmonster met DPBS-oplossing gedurende een uur.

Vlek het monster vervolgens door het in twee milliliter Eosin Y-kleuroplossing te plaatsen en het gedurende 24 uur op een horizontale schudplaat uit te broeden. Haal de volgende dag voorzichtig het zachte weefselmonster uit de monstercontainer en verwijder overtollig kleurstof met cellulosepapier. Plaats het in een conische container boven een ethanol damp fase voor opslag en verder gebruik.

Bereid een geschikte monsterhouder voor om het zachte weefselmonster volgens manuscriptaanwijzingen te monteren en zorg voor een strakke pasvorm om te voorkomen dat het monster tijdens de x-ray CT-metingen beweegt. Zodra de lijm is uitgehard en de monsterhouder klaar is voor gebruik, breng je de muisnier over in de intacte centrifugebuis die een paar druppels van 70% ethanol aan de onderkant bevat. Plaats het gemonteerde monster in de x-ray CT-scanner.

Nadat u het monster zorgvuldig hebt uitgelijnd, kiest u acquisitieparameters voor de beste beeldkwaliteit. Voor de gepresenteerde micro CT-gegevens, verwerven van de scan op een piekspanning van 50 kilovolt en een stroom van 3,5 watt met behulp van 1601 projecties gelijk verdeeld over 360 graden. Gebruik vervolgens de micro-CT-gegevens uit de overzichtsscan om het interessegebied te selecteren voor de CT-scan met hoge resolutie.

Bereid volumes van belang van het zachte weefsel monster door het te snijden in zeer kleine stukjes van ongeveer 0,5 millimeter randlengte met behulp van een scalpel en een stereomicroscoop. Bij gebruik van een muisnier, snijd het in twee helften langs de langste as. Neem de helft en bereid verschillende anatomische gebieden voor, zoals een nierschors en nierhertolla.

Breng de kleine stukjes naar een nieuwe petrischaal voor uitdroging. Dehydrateer de monsters met behulp van een reeks ethanol oplossingen volgens manuscript richtingen, het uitvoeren van elke uitdroging stap voor een uur. Breng de uitgedroogde monsters in de microporeuze capsule en sluit deze.

Houd de monsters te allen tijde in contact met 100%ethanol. Dan kritieke punt droog de kleine stukjes weefsel. Zodra de weefselmonsters zijn bereid, bewaar ze in een nieuwe petrischaal opgeslagen in een desiccator voorafgaand aan verder gebruik.

Monteer de weefselstukken op een geschikte monsterhouder die zorgt voor een strakke pasvorm. Voor een muis nier superlijm de stukken aan een monster houder met behulp van een stereo microscoop. Kies na zorgvuldige uitlijning van het monster acquisitieparameters voor de beste beeldkwaliteit.

Voor de gepresenteerde nano-CT-gegevens verwerven projecties bij een piekspanning van 60 kilovolt met 1599 projecties gelijk verdeeld over 360 graden en een voxel grootte van ongeveer 400 nanometer. Dit protocol werd gebruikt voor 3D-visualisatie van microscopischkleine weefselstructuren van een muizennier. Lage resolutie micro CT-metingen toegestaan voor een overzicht van het hele orgaan en hielp bij het identificeren van volumes van belang voor hoge resolutie metingen.

Dezelfde muisnier werd gebruikt om een hoge resolutie micro CT-gegevens te verkrijgen. Een meer gedetailleerde weergave van de anatomische structuren zoals de cortex, buitenste medulla, en innerlijke medulla onder anderen wordt bereikt. Een volume van de rente rendering toont de medulla regio en een virtuele sectie door het schip.

De nano-CT werd gebruikt om een gedetailleerd beeld van het niermonster op cellulair niveau te verkrijgen. Een klein stukje weefsel verkregen uit de hele muis nier werd gebruikt om beeld van de dikke opgaande ledematen van de lus van Henle met een voxel grootte van ongeveer 400 nanometer. Er werd een vergelijkende studie uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de nano-CT volledig compatibel is met histopathologie.

De multimodale beeldvormingsbenadering bevestigde de resultaten die met beide methoden werden verkregen. Tijdens de incubatiestap is het van cruciaal belang dat het monster volledig wordt omgeven door de kleuroplossing. Ook bij het uitvoeren van CT x-ray imaging, het belangrijkste feit is om monster stabiliteit te garanderen tijdens het verwerven van gegevens.

De weke delen monsters die zijn geanalyseerd met ons protocol kan verder worden geanalyseerd met behulp van standaard histologische techniek, zoals contrastaining hematoxylin. Ons kleuringsprotocol zal aanzienlijk bijdragen aan het bevorderen van 3D x-ray histologie. Medisch onderzoek zal vooral profiteren van deze niet-destructieve 3D-beeldvormingstechniek.