Bacteriële peptide weergave voor de selectie van nieuwe Biotinylating enzymen

Dit protocol biedt een zeer effectief bacterief vertoningssysteem voor isolatie van nieuwe varianten van BirA die specifieke biotinylation van inheemse proteïnen toestaat. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat het BirA varianten selecteert met behulp van hoge affiniteit streptavidin selectie. Dit zorgt ervoor dat inactieve klonen worden verwijderd, waardoor een zeer efficiënt selectieproces ontstaat.

Om te beginnen, in een plasmid editor, het ontwerp van de voorwaartse primer om de laatste 30 nucleotiden van de omgekeerde aanvulling van de peptide codering sequentie op te nemen, en voeg de plasmid bindende nucleotide sequentie aan zijn vijf-prime einde. Ontwerp de omgekeerde primer om de eerste 30 nucleotiden van de omgekeerde aanvulling van de peptide coderende sequentie op te nemen en voeg de plasmid binding nucleotide sequentie toe aan het vijfste priemeinde. Voeg vervolgens de reagentia toe in een dunwandige PCR-buis om een PCR-reactie van 20 microliter op te zetten.

Breng de buis over naar een thermische cycler en voer PCR uit volgens het manuscript. Voer vervolgens vijf microliters van de PCR-reactie uit op een 1%-agarosegel om de versterking van een PCR-product van zes kilobasis te bevestigen en ga verder volgens het manuscript. Nu, om de gemuteerde megaprimers te synthetiseren met BirA hexahistidine voorwaartse en omgekeerde primers, in een PCR-buis, voeg een nanogram pBAD-BirA-eCPX toe met de voorbereide doelpeptopvolgorde als sjabloon.

Stel 35 PCR-cycli in met een gloeiende temperatuur van 60 graden Celsius volgens de instructies van de fabrikant. Voer vervolgens vijf microliters van de versterkingsreactie uit op een 1%agarose gel om de versterking van een 984-base pair PCR-product te verifiëren. Zuiver het PCR-product van de resterende 45 microliters van de versterkingsreactie met behulp van een commerciële PCR-zuiveringskit en gebruik een spectrofotometer om de DNA-opbrengst te kwantificeren.

Voeg in een dunwandige PCR-buis de reagentia in de bereide gemuteerde megaprimers toe om de monsterreactie voor te bereiden. Breng het reactiemengsel over naar een thermische cycler en voer de PCR volgens het manuscript uit. Bewaar de versterkingsreactie op vier graden Celsius of op ijs.

Voeg vervolgens een microliter Dpn1-restrictieenzym direct toe aan de versterkingsreactie en meng zachtjes. Draai het reactiemengsel naar beneden en broed twee uur uit bij 37 graden Celsius. Na twee uur transformeer t7 Express lysY/Iq competente E.coli cellen in een buis met twee microliters van de Dpn1-reactie.

Ten eerste, inenting 100 milliliter LB met 1%glucose en 100 microgram per milliliter ampicilline met een milliliter bira bibliotheek, en incubaat 's nachts op 37 graden Celsius met schudden bij 200 rpm. Dan, inenting vijf milliliter LB met 1%glucose en 100 microgram per milliliter ampicilline met 100 microliter van de nachtelijke cultuur. Incubeer gedurende twee uur en 30 minuten of totdat de cultuur een OD600 van ongeveer 0,5 bereikt.

Vervolgens induceren eCPX en BirA expressie met 0,2% gewicht in volume L-arabinose, 100-micromolar IPTG, en 100-micromolar biotine. Schud de cultuur bij 200 rpm voor een uur bij 37 graden Celsius. Centrifuge de cultuur gedurende 10 minuten op 5.000 keer g, en verwijder de supernatant.

Resuspend de cellen in een milliliter ijskoude PBS, en centrifuge op 5,000 keer g gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de cellen in 400 microliter ijskoude PBS en bewaar cellen op ijs. Breng vervolgens 10 microliter van de opnieuw opgebouwde cellen over in een invoer met het label van 1,5 milliliter.

Bewaar op ijs. Vervolgens was 20 microliters van streptavidin magnetische kralen in een milliliter ijskoude PBS in een buis, en plaats de buis in een benchtop magnetische deeltjesscheidinger gedurende twee minuten, en verwijder voorzichtig de supernatant. Resuspend de streptavidin magnetische kralen in 20 microliter van ijskoude PBS, en breng de kraal oplossing aan de vorige bereide 390 microliterten van geresuspendeerde cellen.

Meng door zachtjes pipetten. Dan, incubeer gedurende 30 minuten op vier graden Celsius. Plaats een kolom met ferromagnetische bollen in een magnetische deeltjesafscheider en was met vijf milliliter ijskoude PBS.

Breng de cellen en streptavidin magnetische kralen van de buis in de kolom bevestigd in de separator. Zodra het kolomreservoir leeg is, wast u de kolom met een totaal volume van vijf milliliter ijskoude PBS bij 500 microliter per keer. Verwijder daarna de kolom uit de scheidingsafscheid en plaats deze in een buis van 1,5 milliliter.

Pipette een milliliter van de ijskoude PBS op de kolom, en gebruik de zuiger om de magnetisch gelabelde cellen te ontwijken. Plaats vervolgens de buis van 1,5 milliliter in een benchtop-scheidingsteken en was de magnetisch gelabelde cel met een milliliter ijskoude PBS. Voorzichtig resuspend de magnetisch gelabelde cellen in een milliliter van de ijskoude PBS.

Breng 10 microliter van de resuspensie over in een 1,5 milliliter buis met het label output. Inoculeren 100 milliliter LB met 1%glucose en 100 microgram per milliliter ampicilline met de magnetisch gelabelde cellen, en incubaat 's nachts bij 37 graden Celsius met schudden bij 200 rpm. De volgende dag, combineren 10 milliliter van de nachtcultuur in LB met glycerol tot een laatste concentratie van 15%en op te slaan bij min 80 graden Celsius om vriezer voorraden te maken.

Gebruik 100 microliters van de nachtcultuur voor de volgende selectieronde. Voeg nu 990 microliter ijskoude PBS toe aan zowel de input- als outputmonsters en label de buizen 10 aan de min twee en output 10 aan de min twee, respectievelijk. Maak 10-voudige seriële verdunningen van de twee monsters in ijskoude PBS tot een uiteindelijke verdunning van 10 tot min 10 is bereikt in het inputmonster en 10 tot de min vier in het uitgangsmonster.

Plaat 100 microliters van monsters van input 10 tot min zes, input 10 tot de min acht, input 10 tot de min 10, output 10 tot de min twee, output 10 tot de min drie, en output 10 tot de min vier op individuele LB-ampicilline platen, en incubate 's nachts bij 37 graden Celsius. In de ochtend, tel het aantal kolonies op de platen met duidelijk gescheiden kolonies. Vermenigvuldig het aantal kolonies met de verdunningsfactor om het aantal bacteriënconcentraties per 100 microliters te verkrijgen.

In dit protocol werd na het genereren van een willekeurig gemuteerde bibliotheek van BirA-varianten BirA- en eCPX-AP-expressie geïnduceerd. Bacteriën werden geïncubeerd met affiniteit reagens, niet-gebonden bacteriën werden weggegooid, en geselecteerde bacteriën werden versterkt. Westerse vlek van pBAD-BirA-eCPX-AP uitdrukken bacteriën geproduceerd een 22-kilodalton streptavidin-reagerende band in overeenstemming met het molecuulgewicht van eCPX in zowel niet-geïnduceerde als geïnduceerde culturen.

Ze waren echter niet aanwezig in BirA hexahistidine. De sterke oppervlaktebiotinylation in de eCPX-AP uitdrukkende bacteriën veroorzaakten aggregatie bij toevoeging van streptavidin magnetische kralen en de vorming van een korrel aan de onderkant van de buis, die niet werd waargenomen met eCPX met lysine tot alanine mutatie expressie bacteriën. Analyse van het neerslag van de streptavidin pulldown toonde een duidelijke 22-kilodalton streptavidin-reagerende en anti-hexahistidine band in de monsters van eCPX-AP culturen, maar niet eCPX-AP met lysine tot alanine mutatie culturen.

Ook was het aantal bacteriën dat gebonden is aan de streptavidinkralen aanzienlijk hoger in de eCPX-AP dan de eCPX-AP lysine aan alanine-mutatieculturen. De belangrijkste stap is een strenge wassen van streptavidin-gebonden bacteriën. Een strenge wasbeurt zorgt ervoor dat alleen bacteriën met biotine met oppervlakte worden geselecteerd.

Zodra een duidelijke verrijking van bacteriën wordt waargenomen, kunnen de geïsoleerde klonen verder worden gemuteerd en daardoor zeer actieve BirA-varianten ontwikkelen die specifieke biotinyleratie van inheemse eiwitten mogelijk maken.