Verrijking van Pachyteen spermatocyten en spermatiden van muis testes met behulp van Standaard laboratoriumapparatuur

De eenvoudige en goedkope methode die we MDR noemen, stelt u in staat om verrijkte populaties pachytene spermatocyten, ronde spermatids en langwerpige spermatids van muisteelballen te isoleren. Het belangrijkste voordeel van de MDR-methode is de eenvoud. U hebt alleen standaard laboratoriumapparatuur nodig die beschikbaar is in de meeste biomedische onderzoekslaboratoria.

Het MDR-protocol is ideaal voor onderzoekers die functionele studies doen over mannelijke kiemcellen. Bijvoorbeeld, groepen die spermatogenese bestuderen, factoren die de mannelijke vruchtbaarheid beïnvloeden, evenals vaderlijke epigenetische overerving. Voor de MDR-methode is minimaal uitgangsmateriaal vereist.

En in feite verkrijgen we routinematig een goede hoeveelheid cellen met slechts één volwassen mannelijke muis. Begin met het opzetten van de benodigde apparatuur en reagentia. Stel een waterbad op 37 graden Celsius en een cel cultuur incubator de 34 graden Celsius, 5% kooldioxide en 95%vochtigheid.

Plaats een buis rotator in de couveuse. Bereid en label de juiste hoeveelheid microscopie glazen glijbanen, teken dan een ring van ongeveer een centimeter in diameter met een vetpen, en laat het vet drogen. Wanneer klaar om het dier te ontleden, spray de ventrale buik van de muis met 70% ethanol en gebruik schaar om een V-vorm opening in de buik bekkenholte te maken.

Trek aan het epididymale vetpad met tangen, lokaliseer de teelballen en verwijder ze met een schaar, om te voorkomen dat de tunica albuginea wordt verstoord. Plaats de teelballen op een petrischaaltje van zes centimeter met daarin 1X KREBS. Decapsule de teelballen en gooi de tunica albuginea weg en verspreid vervolgens de halfniferous tubuli lichtjes door ze voorzichtig uit elkaar te plagen met tangen.

Breng ze in een 50 milliliter conische buis met twee milliliter vers bereide collagenase oplossing. Incubeer de tubuli in de 37 graden Celsius waterbad voor drie minuten, roeren ze zachtjes door schommelen. Voeg vervolgens ten minste 40 milliliter warme 1X KREBS toe en laat de tubuli op kamertemperatuur sedimenteren.

Verwijder de supernatant en herhaal de was nogmaals. Voeg 25 milliliter vers bereide trypsineoplossing toe. Plaats de buis op de rotator in de celcultuur incubator, en laat het daar voor 15 tot 20 minuten, draaien op ongeveer 15 rpm.

Controleer sporadisch de tubuli. Zodra de oplossing troebel wordt en slechts kleine stukjes van de tubuli overblijven, plaats de buis op ijs en ga naar de volgende stap. Filtreer de oplossing door een 40 micrometer celzeef in een nieuwe 50 milliliter conische buis op ijs.

Dan centrifugeren op 600 x g gedurende vijf minuten op vier graden Celsius om de cellen pellet. Giet voorzichtig de supernatant uit en tik op de celpellet om de cellen in de rest van de 1X KREBS opnieuw op te stellen. Voeg ten minste 40 milliliter koude 1X KREBS toe aan de geresuspendeerde cellen en herhaal de centrifugatie.

Resuspend de cellen door te tikken op de buis. Monteer vervolgens een pipetpunt op een pipet van één milliliter en snijd deze zo door dat het diafragma ongeveer drie millimeter in diameter is. Voeg maximaal drie milliliter van 0,5% BSA in KREBS.

Resuspend de cellen door pipetting op en neer, ervoor te zorgen om bubbels te voorkomen. Filtreer de celsuspensie door een zeef van 40 micrometer en ga onmiddellijk verder met het laden van de cellen op het BSA-verloop. U moet een homogene eencellige suspensie verkrijgen voordat u de cellen op het verloop laadt.

Geklonterde cellen zal sediment sneller, het verstoren van uw gradiënt en het vervuilen van de fracties. Zet een 50 milliliter buis verticaal op ijs, ervoor te zorgen dat het mogelijk is om een kant van de buis te zien. Snijd vervolgens ongeveer vijf tot tien millimeter van het puntje van een tien milliliter serologische pipet en monteer het op een pipetcontroller.

Pipette vijf milliliter van de 5%BSA oplossing in de bodem van de 50 milliliter buis. Raak het oppervlak van de 5%-oplossing voorzichtig aan met de snijpunt van de pipet en leg langzaam vijf milliliter 4%BSA-oplossing bovenop de 5%-oplossing. Herhaal deze procedure met andere BSA-oplossingen om een verloop van 5% tot 1% BSA te verkrijgen.

Tussen de lagen moet een duidelijke lijn zichtbaar zijn. Laad vervolgens voorzichtig de eencellige vering bovenop het verloop zonder deze te storen. Laat de cellen anderhalf uur door de gradiënt.

Met behulp van een gesneden pipet tip, zorgvuldig verzamelen van de een milliliter fracties in aparte 1,5 milliliter buizen en bewaar ze op ijs, ervoor te zorgen dat de buizen nummer in de volgorde dat ze werden verzameld. Centrifugeren de kiemcelfracties op 600 x g gedurende tien minuten bij vier graden Celsius. Zorg er dan voor dat de pellet niet wordt verstoord, gooi het grootste deel van de supernatant weg en zet de cellen opnieuw op door met de buis te vegen.

Voeg een milliliter ijskoude 1X KREBS buffer toe aan elke buis en herhaal de centrifugatie. Gooi het grootste deel van de supernatant, waardoor ongeveer 100 microliters en resuspend de cel pellet zorgvuldig. Om de celfracties te analyseren, begin met het pipetten van 20 microliters van 4%paraformaldehyde in elke vetpenring op een genummerde microscopieschuif.

Voeg onmiddellijk twee microliter van de geresuspendeerde cellen van de overeenkomstige fractie toe. Droog vervolgens de glijbanen op kamertemperatuur gedurende ten minste een uur. Spoel de glijbanen één keer af met PBS en gebruik een montagemedium met DAPI om de dia's te monteren.

Analyseer elke dia onder een fluorescentiemicroscoop om te schatten welk bepaald kiemceltype in elke fractie wordt verrijkt. Zodra een monster van elke fractie is genomen voor microscopie, voeg een milliliter ijskoude 1X KREBS aan elke fractie en centrifugeren de cellen naar beneden op 600 tot 13000 x g gedurende tien minuten op vier graden Celsius. Verwijder en gooi de supernatant weg en ga verder met de gewenste downstream-analyse.

Dit protocol werkt bijzonder goed voor het verrijken van ronde spermatids. Verrijking boven 90% werd bereikt in de fracties twee, drie en vier. Langwerpige spermatids hebben de neiging om op de top van de helling te blijven en werden verzameld met de eerste fractie.

Door hun grote omvang, pachytene spermatocyten sediment sneller en werden als laatste verzameld. Verrijking was ongeveer 75%in fracties 14 en 15. Het totale RNA verkregen uit de meerderheid van de fracties varieerde van 0,5 tot 2,5 microgram, genoeg voor downstream RNA-analyses.

De hoeveelheid eiwit verkregen uit elke fractie varieerde meestal van 20 tot 140 microgram, wat voldoende is voor verschillende westerse vlekken. In dit protocol was 10% van de eiwitlysaten afkomstig van enkele fracties voldoende om DDX4, PIWIL1 en PIWIL2 eiwitten duidelijk te detecteren op een standaard westerse vlek. De hoeveelheid eiwit in één fractie was ook voldoende voor immunoprecipitatie met behulp van een antilichaam tegen PIWIL1 en voor de detectie van co-immuunepiwil2.

Zelfs voor een eerste timer werkt dit protocol heel goed, zolang je ervoor zorgt dat de voorbehandeling van je cellen goed is en niets je gradiënt verstoort tijdens de sedimentatie. Vanuit één muis krijg je sterk verrijkte cellen, die kunnen worden gebruikt voor verschillende downstream-analyses zoals RT-PCR, RNA-sequencing, immunoprecipitatie en westerse blotting. Hoewel MDR niet de enige methode is voor het verrijken van mannelijke kiemcellen, is het een zeer handig hulpmiddel omdat het geen gespecialiseerde apparatuur of uitgebreide training vereist.