Name: Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Leer hoe migrastatische remmers de invasie van 3D-tumorsferoïden beïnvloeden met behulp van hoogresolutieconfocale microscopie. Deze methode verbetert het testen van geneesmiddelen in een realistischer tumormilieu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen professor Chris Jones bedanken voor het bijdragen aan de KNS42 Cell line. De Zeiss LSM880 confocale Microscoop met AiryScan die in dit werk wordt gebruikt, maakt deel uit van het Huddersfield Innovation and incubation project (HIIP) dat wordt gefinancierd door de Leeds City Region Enterprise Partnership (LEP) Growth deal. Krediet voor Microscoop-beeld afbeelding 3: Carl Zeiss Microscopy GmbH, Microscopy@zeiss.com.

1. generatie van Celsferioïden
Dag 1
<ol><li>Bereid het standaard kweekmedium voor zoals vereist door de onderzochte cellijn.</li>
	<li>Voer alle met weefselkweek samenhangende stappen uit in een weefselkweek afzuigkap met behulp van steriele behandelingstechnieken.</li>
	<li>Trypsinize en Tel kankercellen. Gebruik 20 mL celsuspensie per plaat. Houd de celsuspensies in duidelijk gelabelde steriele universele buizen.</li>
	<li>Voeg een vooraf bepaald aantal cellen toe aan elk goed. Zowel het aanvankelijke aantal cellen als de uiteindelijke grootte van de spheroid is afhankelijk van het proliferatie percentage van de cellijn dat wordt onderzocht. Opmerking: Voor gevestigde glioom cellijnen zoals U251 en KNS429,10, 5 x 103 cellen/ml zal na 4 dagen incubatie een microscopisch zichtbare spheroid (200 of 800 μm) produceren.</li>
	<li>Rebreng de cellen in universele buizen door zachte inversie om celklontering te voorkomen. Pipetteer 200 μL van de celsuspensie in elke put van een 96-well plaat. Als alle putjes niet nodig zijn, is het raadzaam om 200 μL 1x PBS aan elke lege put toe te voegen om verdamping te voorkomen.</li>
	<li>Incuberen de cellen in een incubator als normaal bij 37 °C. Opmerking: Cellijnen zoals glioom Cancer cellijnen vormen sferoïden binnen 24 uur. laat de 3D-cellulaire architectuur vorm geven door de spheroid voor 72 h te inbroed.</li>
</ol>Dag 2
<ol start="7"><li>Controleer cellen op helder-veld microscopie na 24 h. afhankelijk van de cellijn, cellen kunnen hebben gevormd een spheroid detecteerbaar in de bodem van de put. Opmerking: Opgezette glioom kanker cellijnen vormen gemakkelijk sferoïden binnen 24 uur. patiënten afgeleide glioom Cancer cellijnen kunnen tot 1-2 weken duren.</li>
</ol>2. collageen invasie test
Dag 3
<ol><li>Plaats collageen, 5x kweekmedium, 1 M NaOH en 1 20 mL Tube op ijs.</li>
	<li>Voeg voorzichtig en langzaam 10,4 mL koud collageen toe aan een gekoelde kweek buis. Vermijd bubbels. Deze hoeveelheid collageen is genoeg voor 1 96-goed plaat. Opschalen is mogelijk, maar het wordt aanbevolen dat 1 20 mL buis per plaat wordt bereid op een tijdstip.</li>
	<li>Voeg zachtjes 1,52 mL koud steriel 5x kweekmedium toe. Vermijd bubbels.</li>
	<li>Net voor gebruik, voeg voorzichtig 72 μL koude steriele 1 M NaOH toe. Houd de oplossing op ijs.</li>
	<li>Meng zachtjes door pipetteren. Vermijd bubbels. Efficiënte menging leidt tot een kleurverandering (van rood naar oranje-rood (pH 7,4) in het medium. Laat het mengsel op ijs staan tot het gebruik.</li>
	<li>Cruciale stap: Verwijder 190 μL supernatant van de 96-put die op dag 1 is bereid. Wees heel voorzichtig om de sferoïden die in de bodem van de put zijn gevormd niet te verstoren. Gebruik de pipet onder een hoek naar de zijkant, niet het midden, van de put.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 100 μL van de collageen mix toe aan elk goed. Pipetteer de Meng zijde van de put om een spheroid-verstoring te voorkomen. Vermijd bubbels. Bewaar elke overgebleven collageen mengsel in de tube van 20 mL bij kamertemperatuur om polymerisatie te beoordelen.</li>
	<li>Incubeer de plaat in de incubator gedurende ten minste 10 min om het collageen te laten polymeriseren. Als een richtlijn, als de overgebleven collageen heeft ingesteld, steeds halfvaste en spons-achtige, de sferoïden zijn klaar om te worden behandeld met remmer.</li>
	<li>Voeg de geneesmiddelen of remmers bij 2x de concentratie toe aan het kweekmedium. Voeg het medium zachtjes toe aan elk goed (100 μL per put). Pipetteer het medium aan de zijkant van de put om spheroid-verstoring te voorkomen.</li>
	<li>Observeren en beeld elke spheroid door helderveld microscopie soms T = 0 h, 24 h, 48 h, en 72 h om drug activiteit te beoordelen. Breng vervolgens de plaat terug naar de incubator. Opmerking: Afhankelijk van het invasieve gedrag van de cellijn kan de migratie weg van de oorspronkelijke spheroid-kern vanaf 24 uur worden waargenomen.</li>
</ol>3. bereiding van met collageen ingesloten spheroïden en migratie cellen voor confocale microscopie
<ol><li>Plaats de plaat in een weefselkweek kapje en verwijder voorzichtig het supernatant (200 μL). Nogmaals, zorg dat u de spheroid niet verstoort en Vermijd het aanraken van het collageen, omdat dit de collageen plug kan verstoren.</li>
	<li>Vervang de supernatant met 100 μL 1x PBS. Herhaal deze Wash stap 3x.</li>
	<li>Verwijder de laatste wassing en vervang met 4% formaldehyde in 1x PBS (100 μL per put). Let op: Formaldehyde is een potentieel kankerverwekkend. Behandel met zorg in overeenstemming met de gezondheids-en veiligheidsrichtlijnen.</li>
	<li>Plaats de 96-put plaat op een labbank, dek af met folie en laat 24 uur op kamertemperatuur liggen.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de formaldehyde en vervang deze door 1x PBS. Herhaal deze 1x PBS Wash 3x.</li>
	<li>Maak 0,1% Triton X-100 klaar in 1x PBS. Verwijder de 1x PBS Wash en vervang met 100 μL van de Triton X-100 oplossing. Inincuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen de blokkerende oplossing met 1x PBS en 0,05% mageremelkpoeder en meng grondig.</li>
	<li>Verwijder Triton X-100 en was 3x met 1x PBS. Voeg 100 μL blokkerende oplossing toe aan elk goed en incuberen gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Verdun het vereiste primaire antilichaam in de blokkerende buffer bij de vooraf bepaalde concentratie. Hier, gebruik anti-muis IgG geacetseerd tubuline antilichamen (1:100).</li>
	<li>Centrifugeer de primaire antistofblokkerende buffer mix gedurende 5 minuten bij 15.682 x g. Verwijder voorzichtig de blokkerende oplossing en voeg de supernatant (25 − 50 μL) toe aan elk goed. Inincuberen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.</li>
	<li>Verwijder de antilichaam oplossing en was 3x met 1x PBS (100 μL per put).</li>
	<li>Verdun het secundaire antilichaam in de blokkerende buffer bij de aanbevolen of vooraf bepaalde concentratie, naast eventuele extra fluorescerende vlekken. Hier, gebruik 1:500 anti-muis fluorophore-488 geconjugeerd antilichaam, phalloidin-594 (1:500) voor actine kleuring, en de DNA vlek (DAPI).</li>
	<li>Centrifugeer nogmaals de secundaire antilichaam oplossing gedurende 5 minuten bij 13.000 tpm.</li>
	<li>Verwijder de blokkerende oplossing van elke put en voeg 25 − 50 μL van het secundaire antilichaam/phalloidine/DAPI-mengsel toe. Inincuberen in het donker voor 1,5 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder secundaire antistof oplossing en was 3x met 1x PBS (100 μL per put).</li>
	<li>Til individuele collageen pluggen voorzichtig op met een plastic pipet (200 μL) op het midden van een hoge kwaliteit glijbaan van glas.</li>
	<li>Voeg een druppel van een geschikte inbedmiddel toe aan de collageen plug, zodat de stekker volledig bedekt is. Vermijd bubbels.</li>
	<li>Breng de afdekfolie van de optimale dikte aan voor de Microscoop doelstelling die zal worden gebruikt voorbeeld vorming en laat 's nachts instellen. Bewaar de glaasjes bij kamertemperatuur in het donker.</li>
</ol>4. fluorescentiemicroscopie
<ol><li>Vang fluorescerende beelden met behulp van een geschikte confocale Microscoop.</li>
</ol>

<ol><li>Gandalovičová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs%3A+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li>
<li>Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+in+glioblastoma%3A+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062(2016).</li>
<li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333(2017).</li>
<li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics+Technologies%22%5BJournal%5D)">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li>
<li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82(2018).</li>
<li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microwell-mesh%3A+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253(2018).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li>
<li>Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPont%C3%A9n%2C+J+%22Human+Tumor+Cells+in+Vitro%22">Human Tumor Cells in Vitro</a>. , Springer US. Boston. 175-206 (1975).</li>
<li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line%2C+KNS-42%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologica+Medico+Chirurgica%22%5BJournal%5D)">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li>
<li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li>
<li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li>
<li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors%2C+a+promising+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li>
<li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li>
<li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+preparation+from+hanging+drops%3A+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li>
<li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29(2012).</li>
<li>Härmä, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426(2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Een nieuwe manier om kankercel sferoïden te maken voor de identificatie van de activiteit van migraine met behulp van hoge-resolutie confocale microscopie wordt beschreven. Het gebruik van lage hecht platen over andere technieken, zoals hangende druppels15, heeft een middel vergemakkelijkt om reproduceerbare en uniforme sferioïden te genereren voor gebruik in de collageen migratie en invasie testen. De kritische punten in dit protocol zijn de verwijdering van het groeimedium van de 96-put voor de ...

Driedimensionale spheroid-technologieën voor preklinische geneesmiddelen ontdekking en de ontwikkeling van potentiële kankergeneesmiddelen worden in toenemende mate begunstigd op conventionele drugs schermen; Er is dus meer ontwikkeling van migraine — migratie en invasie voorkomen — drugs. De achterliggende gedachte achter deze ontwikkelingen in de behandeling van kanker is duidelijk: 3D-spheroid-assays vormen een realistischer benadering voor het screenen van potentiële anti-kanker drugs, omdat ze de 3D-tumor architectuur meer getrouw nabootsen dan de monolaag-culturen van cellen, even drug-tumor interacties (kinetiek) nauwkeuriger, en toestaan de karakterisering van drug activiteit in een tumor-gerelateerde setting. Bovendien is de opkomst van resistentie tegen chemotoxische geneesmiddelen in vele soorten kanker en hoge sterftecijfers onder kankerpatiënten als gevolg van metastasen versterkt door het vermogen van kankercellen te migreren naar verre tumor sites ondersteunt de opname van chemotherapeutische agenten gericht op het migratie potentieel van kankercellen als adjuvante behandeling in toekomstige klinische kanker onderzoeken1. Dit is met name het geval bij zeer invasieve kankers, zoals high-grade glioblastomas (GBM). GBM-beheer omvat chirurgie, radiotherapie en chemotherapie. Echter, zelfs met combinatiebehandeling, de meeste patiënten recidief binnen 1 jaar van de initiële diagnose met een mediane overleving van 11-15 maanden2,3. Er zijn de afgelopen jaren enorme vooruitgang geboekt op het gebied van 3D-technologie: rotatieve systemen, micro fabricaat structuren en 3D-steigers, en andere individuele testen worden voortdurend verbeterd om routinematige tests op grote schaal4mogelijk te maken, 5,6,7. De resultaten van deze testen moeten echter op een zinvolle manier worden geanalyseerd, omdat gegevens interpretatie vaak wordt belemmerd door pogingen om 3D-gegenereerde gegevens te analyseren met 2D-beeldanalyse systemen.
Ondanks de voorkeur in termen van beeld acquisitie snelheid en verminderde foto-toxiciteit, blijven de meeste breedveldsystemen beperkt door resolutie8. Zo, afgezien van de gegevens lezen-outs met betrekking tot de werkzaamheid van het geneesmiddel, gedetailleerde effecten van drug actie op 3D cellulaire structuren van migrerende cellen zijn onvermijdelijk verloren als afbeelding gemaakt met behulp van een breed-veld systeem. Omgekeerd, confocale laser scanning microscopie (CLSM) vangt hoge kwaliteit, optisch verdeelde beelden die kunnen worden gereconstrueerd en gerenderd in 3D na overname met behulp van computer software. CLSM is dus gemakkelijk toepasbaar op Imaging complexe 3D cellulaire structuren, waardoor ondervraging van de effecten van anti-migrastatic remmers op 3D structuren en diepgaande analyses van de cel migratie mechanismen. Dit zal ongetwijfeld leiden tot toekomstige migrastatic drug ontwikkeling. Hier wordt een gecombineerde workflow van spheroid-generatie, medicamenteuze behandeling, kleurings protocol en karakterisering door confocale microscopie met hoge resolutie beschreven.

<table><tbody><tr><td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>voor glioma invasie assay; dit wordt door veel distributeurs/fabrikanten aangeboden en moet worden bepaald voor zowel het type beoogde assay als de gebruikte cellijnen. Voor glioma kankercellijnen is Collagen rat tail type 1 (bijv. Corning) de voorkeurskeuze. Collageen moet worden bewaard bij 4 &deg;C, in het donker, totdat het nodig is. Het is niet raadzaam om collageen uit verschillende batches te mengen, omdat dit de consistentie van het gepolymeriseerde collageen kan beïnvloeden.&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>various</td><td>various</td><td>voor microscopisch beeld</td></tr><tr><td>DMEM poeder</td><td>Sigma</td><td>D5648</td><td>nodig bij 5x concentratie voor collageen oplossing voor glioma invasie assay;&nbsp; dit kan worden gekocht in poedervorm, gemaakt in dubbel gedestilleerd water en, afhankelijk van de uiteindelijke samenstelling van het groeimedium, worden aangevuld met alle vereiste toevoegingen. De volledige 5x oplossing moet vóór gebruik worden gefilterd door een spuitfiltersysteem (0,22 &mu;m).</td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>Sigma</td><td>F7524-500ML</td><td>nodig voor celkweek van glioma cellijnen</td></tr><tr><td>Glijbanen</td><td>various</td><td>various</td><td>voor microscopisch beeld</td></tr><tr><td>High glucose DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>nodig voor celkweek van glioma cellijnen</td></tr><tr><td>Remmer</td><td>Tocris</td><td>various</td><td>various - volgens experimenteel ontwerp; remmers kunnen worden gekocht bij fabrikanten zoals Selleckchem en Tocris. Deze fabrikanten bieden een gedetailleerde beschrijving van remmerkenmerken, links naar geassocieerde referenties en suggesties voor werkconcentraties. Zoals bij alle remmers, kunnen ze mogelijk giftig zijn en moeten ze worden behandeld volgens gezondheids- en veiligheidsrichtlijnen. Remmers worden bereid als stapoplossingen zoals aanbevolen door de fabrikant. Als voorbeeld gebruikten we de migrastatische remmer MI-192 om het gebruik van dergelijke remmers te demonstreren. We hebben een reeks migrastatische remmers op deze manier getest met vergelijkbare resultaten.</td></tr><tr><td>Montant</td><td>various</td><td>various</td><td>voor microscopisch beeld</td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td><td>various&nbsp;</td><td>various</td><td>NaOH kan worden gekocht bij de vereiste molairiteit of bereid uit vaste vorm. De bereide oplossing moet worden gefilterd gesteriliseerd met behulp van een spuitfiltersysteem. Een M NaOH is corrosief en voorzichtigheid is geboden bij de bereiding van de oplossing.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&nbsp;</td><td>various</td><td>various</td><td>voor het fixeren van sferoïden en cellen; maak op 4%, let op gezondheidsrisico, zorg ervoor dat de gezondheids- en veiligheidsvoorschriften worden nageleefd voor collageenoplossing voor invasie assay</td></tr><tr><td>Pastettes (gegradueerde pipet, 3 mL)</td><td>various</td><td>various</td><td>voor invasie assay, oplossing verwijderen</td></tr><tr><td>PBS, steriele voor weefselkweek</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML&nbsp;&nbsp;</td><td>nodig voor celkweek van glioma cellijnen en wasbeurten voor kleuring</td></tr><tr><td>Pen/strep (antibiotica)</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>nodig voor celkweek van glioma cellijnen</td></tr><tr><td>Primaire antilichaam, secundair antilichaam, DAPI, Phalloidin</td><td>various</td><td>various</td><td>er zijn veel fabrikanten van deze reagentia, voor secundair gelabelde antilichamen raden we Alexa Fluor aan (Molecular Probes). Hier gebruikten we voor primaire antilichamen muis anti-acetyleerde tubuline antilichaam (1/100, Abcam). Voor secundaire antilichamen gebruikten we 1/500 anti-muis Alexa Fluor 488 geconjugeerd antilichaam, Molecular Probes. Voor nucleaire kleuring gebruikten we DAPI (veel fabrikanten) en de actinekleuring Phalloidin (veel fabrikanten), beide gebruikt bij aanbevolen verdunning van 1/500.</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>nodig voor collageenoplossing voor glioma invasie assay bij 5x concentratie</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td>nodig voor collageenoplossing voor glioma invasie assay bij 5x concentratie</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>voor trypsinisatie</td></tr><tr><td>Ultra laag adherente platen</td><td>Sigma/Nunc</td><td>CLS7007-24EA</td><td>voor glioma invasie assay; een laag adherente plaat is vereist, met 96-well platen bij voorkeur om grootschalige screening van onderzochte verbindingen mogelijk te maken. Er zijn verschillende laag adherente platen commercieel verkrijgbaar; het is raadzaam om een verscheidenheid aan platen te testen voor optimale sferoïdegeneratie. In onze ervaring werkt Costar Ultra Low Cluster met deksel, ronde bodem, het beste voor de generatie van sferoïden uit glioma kankercellen in termen van 100% sferoïdevorming en reproduceerbaarheid. Deze platen werden ook met succes gebruikt voor de generatie van glioma sferoïden uit patiënt-afgeleid materiaal, blaas- en eierstokkankercellen in ons laboratorium. Bovendien kunnen stam- of voorloperspheroiden in deze platen worden gebruikt om de generatie van gestandaardiseerde neurosfeer-sferoïden te vergemakkelijken</td></tr><tr><td>Stripettes (serologische pipetten, steriele, 5 mL en 10 mL)</td><td>various e.g. Costar</td><td>CLS4488-50; CLS4487-50</td><td>voor weefselkweek en collageenbereiding</td></tr><tr><td>Verschillende multikanaals (50 - 250 &mu;L) en enkelkanaals pipetten (10 &mu;L, 50 &mu;L, 200 &mu;L 1 mL)</td><td>various</td><td>various</td><td>voor cel- en sferoidebehandeling</td></tr><tr><td>Widefield microscopie</td><td>various&nbsp;</td><td>various</td><td>voor observatie van sferoidegeneratie en sferoidebeeldvorming; hier werden wide-field fluorescentiebeelden vastgelegd met behulp van een EVOS FL cell imaging systeem (Thermo Fisher Scientific)</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 CLSM uitgerust met een Plan Apochromat 63x 1.4 NA olie objectief</td><td>Zeiss</td><td>citaat van fabrikant</td><td>Confocale beelden werden vastgelegd met behulp van een Zeiss LSM 880 CLSM uitgerust met een Plan Apochromat 63x 1.4 NA olie objectief. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline en HeNe 594nm lasers werden gebruikt om respectievelijk Phalloidin 594, Alexa Fluor 488 en DAPI te exciteren. Voor elke afbeelding werd een enkele representatieve optische sect

karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3d-tumor spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Het opsporen en ontwikkelen van geneesmiddelen in kankeronderzoek wordt steeds meer gebaseerd op medicijn schermen in 3D-formaat. Nieuwe remmers gericht op het migratie-en invasief potentieel van kankercellen, en bijgevolg de gemetastaseerde verspreiding van ziekten, worden ontdekt en beschouwd als complementaire behandelingen in zeer invasieve kankers zoals gliomas. Dus, het genereren van gegevens waardoor de gedetailleerde analyses van cellen in een 3D-omgeving na de toevoeging van een medicijn is vereist. De hier beschreven methodologie, het combineren van spheroid invasie testen met hoge resolutie beeldopname en data-analyse door confocale laser scanning microscopie (CLSM), ingeschakeld gedetailleerde karakterisering van de effecten van de potentiële anti-migratie remmer MI-192 op glioom cellen. Spheroids werden gegenereerd uit cellijnen voor invasie testen in laagaanhandig 96-goed platen en vervolgens voorbereid voor CLSM-analyse. De beschreven workflow had de voorkeur boven andere veelgebruikte spheroid-genererende technieken vanwege zowel gemak als reproduceerbaarheid. Dit, in combinatie met de verbeterde beeldresolutie bereikt door confocale microscopie in vergelijking met conventionele breedveld benaderingen, liet de identificatie en analyse toe van verschillende morfologische veranderingen in migratie cellen in een 3D-omgeving na behandeling met de migrastatic drug MI-192.

Driedimensionale spheroid-technologie vordert het begrip van interacties tussen geneesmiddelen en tumoren, omdat het meer representatief is voor de kankerspecifieke omgeving. De generatie van sferoïden kan op verschillende manieren worden bereikt; lage hechting 96-put platen werden gebruikt in dit protocol. Na het testen van verschillende producten van verschillende fabrikanten, werden de hier gebruikte platen gekozen omdat ze consequent het beste presteerden in termen van succesvolle sph...

De effecten van migraine remmers op glioom kanker Celmigratie in driedimensionale (3D) invasie testen met behulp van een histon deacetylase (HDAC) inhibitor worden gekenmerkt door een hoge resolutie confocale microscopie.

Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Dit protocol toont aan dat we nu het effect van migrastatische remmers in detail kunnen bepalen in 3D-kankermodellen. Het belangrijkste voordeel is het gemak en de alles-in-één aanpak waarmee deze techniek kan worden uitgevoerd. Deze techniek maakt het mogelijk de beoordeling van migrastatische geneesmiddelen in kankeronderzoek in een 3D-omgeving, waardoor het testen van geneesmiddelen in een meer tumor-omgeving-relevante omgeving.Deze methode kan worden toegepast op het testen van cytotoxische geneesmiddelen bij kanker of bijvoorbeeld op het beoordelen van het effect van straling op de proliferatie van kanker en celmigratie. Het is nuttig om de medium verwijdering stap en collageen vervanging met gewone 96-well platen te oefenen om vertrouwen te krijgen. Ook is training op een confocale microscoop essentieel.Visuele demonstratie van deze techniek is van cruciaal belang voor onderzoekers om de vereiste delicate behandeling van de sferoïden en het gebruik ervan in confocale microscopie te begrijpen. Op de eerste dag van experimenteren, hebben de standaard cultuur medium, in dit geval, U251, klaar voor de juiste cellijn. In een weefselkweekkap, voeg 0,5 milliliter trypsine in de cultuur om de kankercellen trypsinize.Tel de kankercellen op een hemocytometer, en verdun tot een concentratie van vijf keer 10 tot de derde cellen per milliliter. Bewaar de celsuspensies in duidelijk gelabelde, steriele universele buizen. Resuspend de cellen door zachte inversie om celklonteren te voorkomen.Gebruik een pipet om 200 microliters van de celcultuur toe te voegen aan elke put in een 96-put plaat. Voeg 200 microliter 1x PBS toe aan elke lege put om verdamping te voorkomen. Broed de cellen in een couveuse op 37 graden Celsius.Controleer de cellen na 24 uur op een helderveldmicroscopie. Cellijnen zoals glioom kanker cellijnen vormen sferoïden in de bodem van de put binnen 24 uur. Incubeer de sferoïden nog 48 uur om een 3D cellulaire architectuur te vormen.Op de derde dag, plaats collageen, 5X cultuur medium, een-kies natriumhydroxide, en een 20-milliliter buis op ijs. Voeg voorzichtig en langzaam 10,4 milliliter koud collageen toe aan de gekoelde kweekbuis. Vermijd bubbels.Voeg vervolgens voorzichtig 1,52 milliliter koud steriel 5X-kweekmedium toe. Vermijd bubbels. Voeg vlak voor gebruik voorzichtig 72 microliters koude steriele natriumhydroxide met één molaire eenkiewijn toe en houd de oplossing op ijs.Meng zachtjes door pipetten en het vermijden van bubbels. Efficiënt mengen leidt tot een kleurverandering van rood naar oranjerood in het medium. Laat het mengsel op ijs tot gebruik.Vervolgens, om 190 microliter van supernatant te verwijderen uit de 96-goed plaat bereid op dag een, gebruik dan een pipet in een hoek naar de zijkant van de put. Wees heel voorzichtig niet te verstoren de sferoïden die gevormd in de bodem van de put. Voeg voorzichtig 100 microliter van de collageenmix toe aan elke put, pipet langs de zijkant van de put.Vermijd bellen en eventuele sferoïde verstoring. Bewaar de resterende collageenmix in de buis van 20 milliliter bij kamertemperatuur om polymerisatie te beoordelen. Incubeer de plaat in de couveuse gedurende ten minste 10 minuten om het collageen te polymeriseren.Wanneer het overgebleven collageen semisolid en sponsachtig wordt, zijn de sferoïden klaar om te worden behandeld met een remmer. Voeg de remmers bij 2X concentratie toe aan vijf milliliter cultuurmedium. Pipette 100 microliter van het medium zachtjes langs de zijkant van elke put om sferoïde verstoring te voorkomen.Observeer en beeld elke sferoïde door helder-veld microscopie op momenten van nul uur, 24 uur, 48 uur en 72 uur om de activiteit van geneesmiddelen te beoordelen. Breng de plaat vervolgens terug naar de couveuse. Plaats nu de plaat in een weefselkweekkap en vervang de supernatant voorzichtig door 100 microliter van 1X PBS.Zorg ervoor dat u de sferoïde niet verstoort en vermijd het aanraken van het collageen. Herhaal deze wasstap nog drie keer. Verwijder de laatste wasbeurt in elke put en vervang deze door 100 microliter van 4% formaldehyde in 1X PBS.Plaats de 96-put plaat op een lab bank, dek af met folie, en laat gedurende 24 uur op kamertemperatuur. De volgende dag, verwijder voorzichtig de formaldehyde, en vervangen door 1X PBS. Herhaal deze wasbeurt nog drie keer.Vervang vervolgens de 1X PBS-wasbeurt door 100 microliter vers bereide Triton X-100-oplossing. Incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Bereid ondertussen de blokkeeroplossing voor met 50 milliliter 1X PBS en 05% magere melkpoeder in een buis van 50 milliliter en meng grondig.Verwijder na 30 minuten de Triton X-100 en was drie keer met 1X PBS. Voeg 100 microliter van de blokkeeroplossing toe aan elke put en broed gedurende 15 minuten uit. Vervolgens verdun anti-muis IgG acetylated tubuline antilichaam in de blokkeringsbuffer bij een verhouding van 1 tot 100.Centrifugeren de primaire antilichaam-blokkeren buffer mix gedurende vijf minuten op 15, 682 keer g. Verwijder voorzichtig de blokkerende oplossing in elke put en voeg 25 tot 50 microliter van de antilichaamblokkeringsbuffer supernatant uit de buis toe. Broeden in het donker bij kamertemperatuur gedurende een uur.Verwijder vervolgens de antilichaamoplossing uit elke put en was drie keer met 100 microliter 1X PBS. Verdun secundair antilichaam in de blokkeerbuffer bij de aanbevolen concentratie naast eventuele extra fluorescerende vlekken. Nogmaals, centrifugeren de secundaire antilichaam oplossing gedurende vijf minuten op 15, 682 keer g.Verwijder de blokkerende oplossing van elke put en voeg 25 tot 50 microliter van het secundaire antilichaam supernatant toe. Incubeer in het donker gedurende 1 1/2 uur bij kamertemperatuur. Verwijder de secundaire antilichaam kleurstof oplossing, en was drie keer met 1X PBS, 100 microliter per put.Til de afzonderlijke collageenpluggen voorzichtig op door zuigkracht met een plastic pipet van 200 microliter op het midden van een glazen glijbaan. Voeg een druppel van een geschikte mountant om de collageen plug te dekken. Plaats een coverslip bovenop het monster en bewaar de dia op kamertemperatuur in het donker.Driedimensionale sferoïde technologie bevordert het begrip van drug-tumor interacties omdat het meer representatief is voor de kanker-specifieke omgeving. In deze studie werden potentiële anti- of pro-migratieeffecten gedetecteerd. Dit is vooral merkbaar in KNS42 met schijnbaar geen migratie in de controle of behandelde sferoïden.Celdood werd waargenomen bij de hoogste remmerconcentratie van 10 micromolar. Nucleaire fragmentatie en migrerende cellen waren duidelijk zichtbaar in U251 cellen. U251 cel sferoïden had spikes uitstralen weg van de oorspronkelijke sferoïde, met toenemende cel afronding in cellen duidelijk met toenemende remmer concentratie.In KNS42 werden ingestorte microtubuli en nucleaire fragmentatie waargenomen. Bladachtige uitsteeksels met enkele celpieken geven KNS42-migratie aan. Bij de laagste remmerconcentratie werd dit fenotype uitgesproken, maar ging verloren met een toenemende remmerconcentratie.Het is van cruciaal belang om alle reagentia op ijs te laten staan tot ze klaar zijn. Anders begint het collageen te polymeriseren voordat het allemaal is toegevoegd aan de sferoïden. Er is ruimte om de beelden die door confocale microscopie worden gegenereerd te kwantificeren om de effecten van bijvoorbeeld migrastatische geneesmiddelen op celmorfologie te beoordelen.Het stelde ons in staat om voor het eerst het effect van de migrastatische remmer MI-192 op microtubuliacetylatieniveaus te bevestigen en dit verder te onderzoeken in termen van celmigratie. Extra zorg moet worden genomen bij de behandeling van formaldehyde voor de fixatie stap. De gebruikelijke gezondheids- en veiligheidsrichtlijnen zijn van toepassing.

characterization-effects-migrastatic-inhibitors-on-3d-tumor-spheroid

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

Modellen van de tumorcel invasie in drie-dimensionale extracellulaire matrix beter aansluiten bij...

Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

Source: Guyon, J., et al. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)The video demonstrates the generation of a three-dimensional spheroid model of tumor cell invasion. Spheroids are formed from human brain tumor cells and embedded in a collagen matrix. The tumor cells at the spheroid periphery adopt an invasive phenotype, secreting proteases to degrade the collagen and advancing to invade the surrounding matrix.

Generation of a Three-Dimensional Spheroid Model of Tumor Cell Invasion

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

Het doel van dit protocol is te evalueren van het effect van de factoren van de pro - en anti - migratory op cel migratie binnen een driedimensionale fibrine-matrix.

Karakterisering van cel migratie binnen driedimensionale In Vitro wond omgevingen

De processen die blaas kanker invasie vertegenwoordigen mogelijkheden voor biomerker en therapeutische ontwikkeling. Hier presenteren we een blaas kanker invasie model waarin 3D-cultuur tumor spheroïden, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie. Deze techniek is handig voor het definiëren van de kenmerken van de invasieve proces en voor het screenen van therapeutische agenten.

3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker

Tumor microenvironment is een essentieel onderdeel van kankergroei en invasie. Om kanker progressie na te bootsen, is een biologisch relevante menselijke matrix nodig. Dit protocol introduceert een verbetering voor de drie-dimensionale sferoïde invasie assay in vitro door het toepassen van een menselijke leiomyoma-gebaseerde matrix. Het protocol introduceert ook een computer-based cel invasie analyse.

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Het doel van dit protocol is om een 3D in vitro model te vestigen om de differentiatie van met kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) in een tumor bulk-achtige omgeving te bestuderen, die kan worden aangepakt in verschillende analysesystemen, zoals immunofluorescentie, transcriptionele analyse en Life Cell Imaging.

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Hier beschrijven we een gebruiksvriendelijke invasietest voor glioblastoom. Deze test is geschikt voor glioblastoom stamcellen-achtige cellen. Een Fiji macro voor eenvoudige kwantificering van invasie, migratie en proliferatie wordt ook beschreven.

Een 3D Spheroid Model voor Glioblastoom

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de fabricage van een sferoïde beeldvormingsapparaat. Dit apparaat maakt dynamische of longitudinale fluorescentiebeeldvorming van kankercelsferoïden mogelijk. Het protocol biedt ook een eenvoudige beeldverwerkingsprocedure voor de analyse van kankercelinvasie.

Time-Resolved Fluorescentie Beeldvorming en analyse van kankercelinvasie in het 3D Spheroid Model

Leer hoe migrastatische remmers de invasie van 3D-tumorsferoïden beïnvloeden met behulp van hoogresolutieconfocale microscopie. Deze methode verbetert het testen van geneesmiddelen in een realistischer tumormilieu.

Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie (Video) | JoVE Journal

Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie

Meer video's verkennen