Name: Intrathecale afgifte van antisense oligonucleotiden in het centrale zenuwstelsel van de rat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Leer intrathecale aflevering van antisense oligonucleotiden in het centrale zenuwstelsel van de rat via katheterimplantatie. Deze veilige en kosteneffectieve methode ondersteunt onderzoek naar farmacokinetiek en therapeutische efficiëntie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen ionis Pharmaceuticals bedanken voor het leveren van de ASOs zoals beschreven in het artikel.

Alle in vivo procedures werden uitgevoerd onder het Biogen institutioneel Dierengebruiks-en zorg Comité (IACUC) goedgekeurde protocollen die de richtlijnen volgen die zijn uiteengezet door de National Institutes of Health Guide van de Verenigde Staten voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. voorbereiding van materiaal en instrumenten
<ol><li>Bereid de speciale gids cannulas.<ol>
<li>Gebruik een roterende tool met een afgesneden wiel (of een scherpe zaag) om de twee uiteinden van een 19 G-naald af te snijden, wat resulteert in een ~ 1,5 − 2 cm lange geleidecanule (Figuur 1AIII). Gebruik het slijpwiel van het roterende gereedschap om de twee uiteinden glad te strijken. Opmerking: als alternatief, premade en steriele gids canules kunnen worden gekocht bij een commerciële leverancier (tabel van materialen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de katheter/draad assemblage.<ol>
<li>Snijd een 8 cm lang stuk PE-10 tubing (polyethyleen buizen, diameter 0,011 inch) als de intrathecale katheter dienen. Maak een merkteken 2 cm van het ene uiteinde met een ethanol bestendige marker pen. Snijd een 11 cm lange gliderite draad van roestvrijstaal draad met polytetrafluorethyleen coating. Plaats de gliderite-draad (Figuur 1AII) in het lumen van de PE-10-katheter (Figuur 1AI). Opmerking: voor elk dier is een katheter/draad assemblage set (afbeelding 1AV) nodig. Als alternatief kunnen katheters en gliderite draden worden gekocht bij een commerciële leverancier (tabel van materialen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiden van levering katheter assemblage.<ol>
<li>Snijd een stukje PE-50 katheter (5 − 10 cm, polyethyleen buizen, diameter 0,023 inch) (Figuur 1bi). Aan één uiteinde van de PE50 katheter een 23 G slang adapter invoegen (Figuur 1BIV). Dit uiteinde wordt tijdens de operatie aangesloten op een spuit van 100 μL (tafel van materialen). Plaats een gemodificeerde 30 G naald met naaf afgesneden (Figuur 1biii) in een ongeveer 0,5 cm stuk PE-10 slang (Figuur 1bii) en verbind de PE-10 slang met het andere uiteinde van de katheter.</li>
		<li>De 30 G naald einde van de levering katheter assemblage (Figuur 1bv) zal worden aangesloten op het distale uiteinde van de geïmplanteerde PE-10 katheter in de rat tijdens de operatie. Opmerking: als alternatief kan de leverings katheter assemblage (afbeelding 1bv) worden gekocht bij een commerciële leverancier (tabel met materialen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de geleidecanule-naald assemblage (Figuur 1AVI) door een geleidecanule (Figuur 1AIII) over het uiteinde van een naald van 23 G te plaatsen.</li>
	<li>Steriliseren alle chirurgische instrumenten, waaronder de geleidecanule en de draad/katheter sets met behulp van een ethyleenoxide sterilisator voor 12 h. Opmerking: alle chirurgische instrumenten behalve de katheter kunnen worden autoclaved; katheter zal smelten op hoge temperatuur.</li>
</ol>2. chirurgie voorbereiding
Opmerking: deze procedure wordt routinematig uitgevoerd op mannelijke en vrouwelijke Sprague Dawley ratten met lichaamsgewicht tussen 200 g en 400 g. Er worden twee ratten per kooi ondergebracht onder een licht/donkere cyclus van 12 uur met gratis toegang tot voedsel en water.
<ol><li>Gewicht een rat en plaats het in een Isofluraan kamer voor het opwekken van anesthesie (1 − 5% Isofluraan in O2, getitreerd tot effect). Opmerking: de rat wordt vervolgens voortdurend verdoving met Isofluraan om diepe anesthesie via een neuskegel gedurende de hele procedure te handhaven. Een alternatieve anesthesie methode (bv. toediening van ketamine 100 mg/kg en xylazine 10 mg/kg) kan worden gebruikt zoals goedgekeurd door het IACUC.</li>
	<li>Wanneer de rat niet reageert op een teen knijpen, scheren haar terug van de staart naar de caudal thoracale wervelkolom en plaats de geschoren rat op de een steriele plaat gelegd bovenop een verwarmingskussen.</li>
	<li>Plaats een conische centrifugebuis van 50 ml onder de buik van de rat om de wervelkolom in het lumbale gebied te buigen (Figuur 2a) en breng oogheelkundige zalf aan op de ogen.</li>
	<li>Injecteer aanhoudende afgifte buprenorfine (1,0 mg/kg; Tabel met materialen) subcutaan bij de rat. Reinig de blootgestelde huid met afwisselend Povidon en alcohol Scrubs en herhaal dit drie keer. Opmerking: een alternatieve pijnverlichting kan worden gebruikt zoals goedgekeurd door het IACUC-protocol.</li>
	<li>Draperen het dier met een steriele transparante draperen die is fenestrated over de operatieplaats.</li>
</ol>3. chirurgie
<ol><li>Met de rat ondersteund door de 50 mL conische buis, Identificeer de twee natuurlijke putten tussen spieren boven het bekken (pijlen in Figuur 2A). Met één hand die die putten vasthoudt, gebruik de andere hand om zachtjes de wervelkolom van caudal naar rostrale migratoire richting te drukken en de eerste grote inkeping tussen wervels te vinden en dit is de tussen wervel ruimte tussen S1 en L6 wervels (Figuur 2B ).</li>
	<li>Verplaats een licht rozet om de volgende inspringing te bepalen, de tussen wervel ruimte tussen de L5 en L6 wervels en de injectieplaats (* in Figuur 2A). Gebruik een scalpel om een incisie niet meer dan 2 cm lang in de huid langs de middenlijn van rostrale migratoire naar caudal te maken, zodat de injectieplaats zich in het midden van de incisie bevindt (gestippelde lijn in Figuur 2a).</li>
	<li>Gebruik dissectie schaar om het bindweefsel te ontleden om de spierlaag te visualiseren. Maak vervolgens een incisie van 1 cm in de spier capsule onmiddellijk lateraal aan het ruggengraat proces van de L6 lumbale wervel. Opmerking: de botten van de L6 lumbale wervel kunnen op dit moment worden gevisualiseerd.</li>
	<li>Positioneer de geleidecanule-naald assemblage in de buurt van het voorste deel van de 6e lumbale wervel en duw het in de tussen wervel ruimte langs het voorste deel van de 6e wervel, zodat het uiteinde van de naald door het Ruggenmergkanaal dringt. Duw de geleidecanule op zijn plaats langs de naald en verwijder de 23 G naald die alleen de geleidecanule op zijn plaats laat staan. Opmerking: het is handig om de botte Tang te gebruiken om het rugproces van de L6 lumbale wervel te lokaliseren voordat u de naald insteekt. In het algemeen, CSF vloeistof kan worden gezien het invoeren van de naald hub (deze vloeistof kan worden getint met een vleugje bloed, maar dit geeft niet aan dat schade is gedaan of dat de naald niet correct is geplaatst). De auteurs hebben niet gezien grote hoeveelheid bloed of ernstige bloeden tijdens deze procedure. Als dit gebeurt, moet een dierenarts worden gecontacteerd om de juiste behandeling te bepalen en als de dieren moeten worden geëerd.</li>
	<li>Plaats de katheter-draad assemblage in de geleidecanule. Hoek naar beneden de katheter-draad assemblage op ongeveer een 45 ° hoek naar het Ruggenmergkanaal en forceer het einde ongeveer 0,3 cm in het Ruggenmergkanaal.</li>
	<li>Verwijder de geleidecanule en laat de katheter met de gliderite draad op zijn plaats. Verwijder de gliderite-draad ongeveer 2,5 cm van de intrathecale punt van de katheter en trek de katheter in het wervelkanaal totdat het 2 cm-teken zich bij de ingang van het kanaal bevindt (alleen zichtbaar onder de spier), zoals weergegeven in Figuur 1bvi. Opmerking: de ingevoegde katheter moet rostraal in de subarachnoïde ruimte worden verlengd. Succesvolle plaatsing moet het mogelijk maken voor vrij verkeer van de katheter in die ruimte.</li>
	<li>Volledig terugtrekken de gliderite draad, en CSF kan worden gezien het invoeren van de geïmplanteerde katheter.</li>
	<li>Verbind de lever katheter assemblage met het distale uiteinde van de geïmplanteerde katheter via de 30 G naald uiteinde (Figuur 1BV, VI).</li>
	<li>Laad 60 μL steriele zoutoplossing in een spuit van 100 μL (spoel spuit). Plaats een bolus van 30 μL van de teststof (bv. ASO-oplossing) in een tweede spuit (injectiespuit).</li>
	<li>Sluit de spoel spuit (geladen met zoutoplossing) aan op het uiteinde van de slang adapter van de katheter assemblage (Figuur 1bv). Injecteer 20 μL steriele zoutoplossing in de intrathecale ruimte (spuien vóór de injectie).</li>
	<li>Sluit de injectiespuit (geladen met teststof) aan op het uiteinde van de slang adapter van de katheter assemblage (Figuur 1bv). Injecteer 30 μL teststof in de intrathecale ruimte van meer dan 30 sec. Opmerking: het routinematige injectievolume ASO is 30 μL om een goede terugslag in het ruggenmerg en in de cortex te bereiken. Er is gemeld dat de injectievolumes kunnen invloed hebben op samengestelde distributie12, hoewel verschillende injectievolumes niet zijn getest. Indien een andere verbinding of volume wordt gebruikt, moeten de veiligheid en de werkzaamheid empirisch worden bepaald.</li>
	<li>Herhaal stap 3,10 en spoel de katheter met een andere 40 μL steriele zoutoplossing (na het spuien). Vervolgens loskoppelen van de levering katheter vergadering van de geïmplanteerde katheter. Opmerking: de pre en post-Injection Flush wordt gedacht om lokale vastlegging van de verbindingen te verminderen en verbeteren van hun distributie naar de rostrale migratoire structuren12.</li>
	<li>Aseptisch knippen en verwarmen van de geïmplanteerde katheter: plaats een paar steriele dissectie Tang in een kraal sterilisator totdat ze erg heet zijn en klem de slang vervolgens met het hete uiteinde van de Tang aan. Opmerking: deze actie smelt de katheter. Zo wordt het gat in de buis ingestort en alle zijden aan elkaar kleven, de slang op aseptische wijze afdichten en vervolgens in de subcutane ruimte worden geplaatst.</li>
	<li>Gebruik absorbabel monofilament hechtingen om de resterende hitte dichte katheter aan het bindweefsel te beveiligen. Gebruik vervolgens niet-absorbabele monofilament hechtingen om de huid te sluiten over de beveiligde, met hitte verzegelde katheter. Opmerking: wond clips kunnen ook worden gebruikt zoals goedgekeurd door het IACUC-protocol. De techniek is compatibel met herhaalde injecties al is het alleen gebruikt voor eenmalige injecties in onze handen. De haalbaarheid van herhaalde injecties moet met de goedkeuring van het IACUC empirisch worden geëvalueerd.</li>
	<li>Gebruik gaas en zoutoplossing om elk bloed van de huid te wassen en laat het dier zich herstellen van de anesthesie in een verwarmde incubator tot het mobiel is, waarna het terugkeert naar zijn huis kooi (twee ratten per kooi). Opmerking: bij het uitvoeren van operaties op meerdere ratten op dezelfde dag, schoon gereedschap met behulp van water om bloed te verwijderen en opnieuw te steriliseren met behulp van een verwarmde droge kraal sterilisator (voor ten minste 20 s, met tijd om te koelen) tussen dieren. Elke 5 dieren wordt een nieuwe set instrumenten gebruikt.</li>
	<li>Bewaak de dieren dagelijks gedurende ten minste 3 dagen na de operatie en blijf de dieren wekelijks volgen na het herstellen van een operatie volgens het IACUC-protocol. Opmerking: als er complicaties optreden (urineretentie, incisie infecties, neurologische aandoening zoals inbeslagneming of verlamming), moet een dierenarts worden gecontacteerd om de juiste behandeling te bepalen en als dieren moeten worden geëuseerd. Als de aanhoudende afgifte buprenorfine niet wordt gebruikt, dient pijnbestrijding dagelijks na de operatie te worden gegeven volgens het IACUC-protocol.</li>
</ol>4. evaluatie van weefsel specifieke knockdown na injectie
<ol><li>Twee weken na de bolusinjectie van Aso's, verzamel verschillende hersengebieden (d.w.z. cerebrale cortex, striatum en cerebellum), evenals verschillende segmenten van het ruggenmerg (d.w.z. baarmoederhals, thoracale en lumbale). Extractie van totaal weefsel RNA met behulp van een commerciële RNA-extractie-Kit en uitvoeren van cDNA synthese reactie zoals eerder beschreven13. Opmerking: standaard reagentia werden gebruikt voor qPCR met de volgende assays: Rat Malat1 en rat GAPDH. De relatieve transcriptie niveaus werden berekend met behulp van de 2-δδCT - methode (CT = drempel cyclus).</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CNS+barriers%3A+evolution%2C+differentiation%2C+and+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).</li>
<li>Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+modulation+of+the+blood+brain+barrier%3A+CNS+delivery+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Tight junction modulation of the blood brain barrier: CNS delivery of small molecules.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1138017(2016).</li>
<li>Daneman, R., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Brain barriers in health and disease.</a> Neurobiology of Disease. 107, 1-3 (2017).</li>
<li>Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%3A+an+overview%3A+structure%2C+regulation%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications.</a> Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).</li>
<li>Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+the+blood-brain+barrier%3A+molecular+anatomy+and+possible+investigation+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches.</a> Brain Research Reviews. 64 (2), 328-363 (2010).</li>
<li>Larsen, J. M., Martin, D. R., Byrne, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+delivery+through+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in delivery through the blood-brain barrier.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (9), 1148-1160 (2014).</li>
<li>Brinker, T., Stopa, E., Morrison, J., Klinge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+look+at+cerebrospinal+fluid+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">A new look at cerebrospinal fluid circulation.</a> Fluids Barriers CNS. 11, 10(2014).</li>
<li>Standifer, K. M., Chien, C. C., Wahlestedt, C., Brown, G. P., Pasternak, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loss+of+delta+opioid+analgesia+and+binding+by+antisense+oligodeoxynucleotides+to+a+delta+opioid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective loss of delta opioid analgesia and binding by antisense oligodeoxynucleotides to a delta opioid receptor.</a> Neuron. 12 (4), 805-810 (1994).</li>
<li>Wahlestedt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligodeoxynucleotides+to+NMDA-R1+receptor+channel+protect+cortical+neurons+from+excitotoxicity+and+reduce+focal+ischaemic+infarctions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antisense oligodeoxynucleotides to NMDA-R1 receptor channel protect cortical neurons from excitotoxicity and reduce focal ischaemic infarctions.</a> Nature. 363 (6426), 260-263 (1993).</li>
<li>Wahlestedt, C., Pich, E. M., Koob, G. F., Yee, F., Heilig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+anxiety+and+neuropeptide+Y-Y1+receptors+by+antisense+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides.</a> Science. 259 (5094), 528-531 (1993).</li>
<li>Mazur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple%2C+rapid%2C+and+robust+intrathecal+catheterization+method+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 280, 36-46 (2017).</li>
<li>Wolf, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+dual-isotope+molecular+imaging+elucidates+principles+for+optimizing+intrathecal+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Dynamic dual-isotope molecular imaging elucidates principles for optimizing intrathecal drug delivery.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (2), e85311(2016).</li>
<li>Becker, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+reduction+of+ataxin-2+extends+lifespan+and+reduces+pathology+in+TDP-43+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Therapeutic reduction of ataxin-2 extends lifespan and reduces pathology in TDP-43 mice.</a> Nature. 544 (7650), 367-371 (2017).</li>
<li>Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+noncoding+RNA+Malat1%3A+Its+physiological+and+pathophysiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">The long noncoding RNA Malat1: Its physiological and pathophysiological functions.</a> RNA Biology. 14 (12), 1705-1714 (2017).</li>
<li>Crooke, S. T., Witztum, J. L., Bennett, C. F., Baker, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Targeted+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">RNA-Targeted Therapeutics.</a> Cell Metabolism. 27 (4), 714-739 (2018).</li>
<li>DeVos, S. L., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+intraventricular+delivery+of+drugs+to+the+rodent+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. (75), e50326(2013).</li>
<li>McCampbell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotides+extend+survival+and+reverse+decrement+in+muscle+response+in+ALS+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3558-3567 (2018).</li>
<li>Schoch, K. M., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+Oligonucleotides%3A+Translation+from+Mouse+Models+to+Human+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Antisense Oligonucleotides: Translation from Mouse Models to Human Neurodegenerative Diseases.</a> Neuron. 94 (6), 1056-1070 (2017).</li>
<li>Lane, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Antisense+Technology+into+a+Treatment+for+Huntington%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Translating Antisense Technology into a Treatment for Huntington's Disease.</a> Methods in Molecular Biology. 1780, 497-523 (2018).</li>
<li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotides+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Neurological+Disorders%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotides in neurological disorders.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li>
<li>Haché, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+Injections+in+Children+With+Spinal+Muscular+Atrophy%3A+Nusinersen+Clinical+Trial+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Child+Neurology%22%5BJournal%5D)">Intrathecal Injections in Children With Spinal Muscular Atrophy: Nusinersen Clinical Trial Experience.</a> Journal of Child Neurology. 31 (7), 899-906 (2016).</li>
<li>Goodkey, K., Aslesh, T., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nusinersen+in+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nusinersen in the Treatment of Spinal Muscular Atrophy.</a> Methods in Molecular Biology. 1828, 69-76 (2018).</li>
<li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nusinersen+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Neurological+Disorders%22%5BJournal%5D)">Nusinersen for spinal muscular atrophy.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li>
</ol>

De auteurs zijn alle medewerkers van Biogen, Inc. of ionis Pharmaceuticals. De auteurs ontvangen de antisense oligonucleotiden beschreven in het artikel van ionis Pharmaceuticals.

Het huidige artikel toont een krachtige methode om therapeutische agenten rechtstreeks in de rat CNS. In theorie kan een vergelijkbare techniek ook worden uitgevoerd bij muizen, maar vanwege de kleinere grootte kan de methode uitdagender zijn. Daarom, onze groep voert intracerebroventriculaire (ICV) injecties in muizen voor het CZS drug delivery, die dezelfde doelen bereiken via een andere toedieningsroute. Deze methode is beschreven in een andere studie16.
Het voordeel...

Het vasculaire systeem van het centrale zenuwstelsel (CNS) heeft zich ontwikkeld als een kritische regulator van homeostase, beheersing van het verkeer van moleculen, leveren van voedingsstoffen en het wegwerken van afval. Dit systeem is ook de eerste verdedigingslinie tegen aanvallen van externe pathogenen, dankzij een dichte verdeling van krappe knooppunten langs de wanden van de endotheelcellen. Deze strakke knooppunten vormen één aspect van de bloed-hersen barrière (BBB). Terwijl de BBB toelaat het transport van moleculen die nodig zijn om te voldoen aan voedings-en energiebehoeften (bijv., ionen, glucose), het ook selectief beperkt de passage van pathogenen evenals giftige chemicaliën1,2,3.
Ironisch genoeg is dezelfde beschermende functie van de BBB die de passage van pathogenen en giftige chemicaliën beperkt, ook het belangrijkste obstakel voor ons vermogen om gemakkelijk toegang te krijgen tot het CZS met therapeutische behandelingen na systemische toediening aan het organisme2, 4,5. Deze rol van de BBB heeft de ontwikkeling van een overvloed aan nieuwe drug distributietechnologieën en benaderingen6.
Een manier om dit obstakel te overwinnen is om de drugs rechtstreeks in de cerebrospinale vloeistof (CSF) die voortdurend perfuses zowel de hersenen en het ruggenmerg7,8,9,10injecteren. In dit artikel beschrijven we een methode om met succes agenten in de lumbale intrathecale ruimte te leveren door het inwendige uiteinde van de katheter volledig in de Cauda equina-ruimte van de rat-wervelkolom te plaatsen. Een beschrijving van deze procedure werd eerder gepubliceerd door Mazur et al. elders11.
Het protocol is zeer effectief en produceert een groter dan 90% slagingspercentage van antisense oligonucleotide (ASO) levering aan het CZS bij beoordeling door kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) analyse van doel gen knockdown8. De procedure veroorzaakt een minimaal ongemak voor de dieren, aangezien 100% van de ratten de operatie overleeft en minimale zwelling rond de chirurgische wond vertoont en geen tekenen van nood (bijv. hyperactiviteit, uitdroging, cirkelen, verlies van balans, verminderde voedselinname, en Dehydratie) tijdens post-op observatie. Een ander voordeel van de hier beschreven methode is dat het geen dure apparatuur of speciale gereedschappen vereist.

<table><tbody><tr><td>3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture</td><td>3M</td><td></td><td>1020</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Decon Laboratories, Inc</td><td></td><td>8416-160Z</td></tr><tr><td>Alcohol swab sticks</td><td>Dynarex</td><td></td><td>NO 1204</td></tr><tr><td><a href="https://punchout.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-syringes-5/22124967?crossRef=BD%20302830#?keyword=BD+302830">BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip</a></td><td>BD</td><td>1ml TB Luer-Lok tip</td><td>BD 302830</td></tr><tr><td>BD Intramedic PE Tubing</td><td>BD</td><td>Polyethyleen buiswerk PE50 Diameter 0,023 inch</td><td>BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) of 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P)</td></tr><tr><td>BD Intramedic PE Tubing</td><td>BD</td><td>Polyethyleen buiswerk PE10 Diameter 0,011 inch</td><td>BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) of 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B)</td></tr><tr><td>BD Intramedic PE Tubing Adapters</td><td>BD</td><td>23 gauge intramedic luer stub adapter</td><td>BD 427565 of Fisher Scientific 14-826-19E</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G</td><td>BD</td><td></td><td>BD 305128</td></tr><tr><td>Buprenorphine Sustained Release-lab</td><td>ZooPharm</td><td>Recept vereist</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleen oxide sterilisator</td><td>Andersen Sterilizer INC.</td><td>AN 74i, gas sterilisator</td><td>AN 74i</td></tr><tr><td>Guide cannula</td><td>BD</td><td>19G x 1 WT (1,1 mm x 25mm) naald</td><td>BD 305186</td></tr><tr><td>Hamilton-spuit 100ul</td><td>Hamilton company</td><td>Hamilton-spuit 100ul</td><td></td></tr><tr><td>Hot bead sterilisator</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>STERILIZER MODELNO FST 250</td></tr><tr><td>Oogzalf</td><td>Dechra veterranery product</td><td></td><td>17033-211-38</td></tr><tr><td>Pocket Pro Pet Trimmer</td><td>Braintree Scientific</td><td></td><td>CLP-9931 B</td></tr><tr><td>Povidone scrub</td><td>PDI</td><td></td><td>S48050</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>Natriumchloride 0,9% Intraveneuze Infusie BP 50ml</td><td>FE1306G</td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Feather</td><td>wegwerp schaar</td><td>Nr. 10</td></tr><tr><td>Kleine dieren verwarmingsmat</td><td>K&amp;H Manufacturing</td><td></td><td>Model # 1060</td></tr><tr><td>Stylet draad</td><td>McMaster-Carr</td><td>1749T14</td><td>LH-36233780</td></tr><tr><td>Chirurgische handdoek</td><td>Dynarex</td><td></td><td>4410</td></tr><tr><td>Chirurgische schaar en pincetten</td><td>FST en Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hechtdraad</td><td>Ethicon</td><td></td><td>4-0 of 5-0</td></tr><tr><td>Gereedschap om de Guide cannula te maken</td><td>Grainger</td><td>Roterend gereedschap (Dremel)</td><td>14H446 (Fabrikant: EZ456)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>EZ lock afsnijwiel</td><td>1PKX5 (Fabrikant: 3000-1/24)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Slijpschijf, Aluminiumoxide</td><td>38EY44 (Fabrikant: EZ541GR)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>EZ lock mandrel</td><td>1PKX8 (Fabrikant: EZ402-01)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Diamantschijf voor vloertegels</td><td>3DRN4 (Fabrikant: EZ545)</td></tr><tr><td>Alternatieve bron voor voorgefabriceerde en gesteriliseerde materialen voor deze procedure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doseringskathetersysteem</td><td>SAI Infusion Systems</td><td></td><td>RIDC-01</td></tr><tr><td>Guide cannula</td><td>SAI Infusion Systems</td><td></td><td>RIDC-GCA</td></tr><tr><td>Interne katheters</td><td>SAI Infusion Systems</td><td></td><td>RIDC-INC</td></tr><tr><td>Stylet draad</td><td>SAI Infusion Systems</td><td></td><td>RIDC-STY</td></tr></tbody></table>

intrathecale afgifte van antisense oligonucleotiden in het centrale zenuwstelsel van de rat

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

De bloed-hersen barrière (BBB) is een belangrijke verdediging tegen de ingang van potentieel toxische of pathogene agentia uit het bloed in het centrale zenuwstelsel (CNS). Echter, het bestaan ervan ook drastisch verlaagt de toegankelijkheid van systemisch toegediende therapeutische middelen naar het CZS. Een methode om dit te overwinnen, is om te injecteren die agenten rechtstreeks in de cerebrospinale vloeistof (CSF), dus het omzeilen van de BBB. Dit kan worden gedaan via implantatie van een katheter voor continue infusie met behulp van een osmotische pomp, of voor een enkele bolus afgifte. In dit artikel beschrijven we een chirurgisch protocol voor de levering van CNS-targeting antisense oligonucleotiden (ASOs) via een katheter die rechtstreeks in de Cauda equina-ruimte van de volwassen rat wervelkolom wordt geïmplanteerd. Als representatieve resultaten tonen we de werkzaamheid van een enkele bolus ASO intrathecale (IT) injectie via dit catheterisatie systeem bij het kloppen van het doelwit RNA in verschillende regio's van de rat CNS. De procedure is veilig, effectief en vereist geen dure apparatuur of chirurgische hulpmiddelen. De hier beschreven techniek kan ook worden aangepast om geneesmiddelen in andere modaliteiten te leveren.

Met behulp van de hier beschreven methode hebben we twee groepen volwassen vrouwelijke ratten geïnjecteerd (250 − 300 g; n = 10/groep) met ofwel een enkele bolus fosfaat-gebufferde zoutoplossing PBS of 300 μg ASO gericht op de lange non-coding (Linc) RNA Malat1; in ons lab gebruiken we routinematig de Malat1 ASO als een gereedschaps verbinding, omdat Malat1 alomtegenwoordig en op hoog niveau in alle weefsels14wordt uitgedrukt, inclusief de hersenen en het ruggenmer...

Hier beschrijven we een methode voor het leveren van geneesmiddelen aan het centrale zenuwstelsel van de rat door het implanteren van een katheter in de lumbale intrathecale ruimte van de wervelkolom. We richten ons op de levering van antisense oligonucleotiden, hoewel deze methode ook geschikt is voor de levering van andere therapeutische modaliteiten.

Intrathecale afgifte van antisense oligonucleotiden in het centrale zenuwstelsel van de rat

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Dit protocol maakt de directe levering van therapieën in het centrale zenuwstelsel van de rat om de farmacokinetiek, farmacodynamica en werkzaamheid van nieuwe therapieën in rattenziektemodellen te evalueren. Deze procedure is veilig, effectief en vereist geen dure apparatuur of chirurgische hulpmiddelen. Het aantonen van de procedure zal Yi Chen en Yi Luo, onderzoekers van mijn laboratorium.Om de speciale geleide canules voor te bereiden, gebruikt u een roterend gereedschap met een afgesneden wiel om beide uiteinden van een naald van 19 meter af te snijden om een ongeveer anderhalve tot twee centimeter lange geleidekanule te verkrijgen. Gebruik vervolgens het slijpwiel van het draaigereedschap om beide uiteinden glad te strijken. Ter voorbereiding van de katheter draad assemblage, snijd een acht centimeter lang stuk van 011 inch diameter PE10 slang om te dienen als de intrathecal katheter voor elk dier.Gebruik een ethanolbestendige stiften om twee centimeter van het ene uiteinde van elk stuk buizen te markeren. Voor elk dier, steek een 11 centimeter lange stylet draad gesneden uit polytetrafluorethyleen bekleed roestvrij staaldraad in het lumen van de acht centimeter PE10 katheter. Om de levering katheter assemblage voor te bereiden, snijd een stuk van vijf tot 10 centimeter 023 inch diameter PE50 katheter en steek een 23 meter buizenadapter in een uiteinde van de katheter.Steek vervolgens een naald van 30 meter met een naaf afgesneden in een stuk PE10-buizen van ongeveer 0,5 centimeter en sluit de PE10-slang aan op het andere uiteinde van de katheter. Om een geleide canule-naaldassemblage voor te bereiden, plaatst u een geleidekanule over het einde van een naald van 23 meter. Voordat u met de operatie begint, plaatst u een verwarmingskussen op de operatietafel en bedek het pad met een steriel laken.Plaats een 50mL conische centrifuge buis op het blad en bevestig een gebrek aan reactie op teen knijpen in de verdoofde experimentele rat. Scheer na het wegen van het dier de rug van de staart naar de caudale thoracale wervelkolom en plaats de geschoren rat op het steriele vel in de gevoelige positie. Plaats de 50mL buis onder de buik om de wervelkolom in het lumbale gebied te buigen en breng oogheelkundige zalf op de ogen.Vervolgens, onderhuids injecteren een milligram per kilogram aanhoudende release Buprenorfine en reinig de blootgestelde huid met sequentiële povidone en alcohol scrubs. Drapeer het dier met een fenestrated steriele transparante plaat. Voor de plaatsing van de katheter en injectie van de verbinding, identificeer de twee natuurlijke kuilen tussen de spieren boven het geschoren bekken, en met de ene hand die de kuilen vasthoudt, gebruik de andere hand om de wervelkolom voorzichtig te drukken en te voelen van de staart naar de rostral-richting om de eerste grote inkeping tussen de wervels te lokaliseren.Na het identificeren van de tussenwervelruimte tussen de S1- en L6-wervels beweegt u enigszins rostrally om de tussenwervelruimte tussen de L5- en L6-wervels te identificeren. Gebruik een scalpel om een niet meer dan twee centimeter lange incisie in de huid en spiercapsule op deze site langs de middellijn van de rostral naar caudal richting te maken, zodat de injectieplaats in het midden van de incisie zal zijn. Gebruik dissectie schaar om weg te ontleden het bindweefsel totdat de spierlaag kan worden gevisualiseerd.Maak een incisie van een centimeter in de spiercapsule onmiddellijk laterale aan de dorsale spinale proces van de L6 lendenwervel. Plaats de geleide canule naaldassemblage in de buurt van het voorste aspect van de zesde lendenwervel en duw de assemblage in de tussenwervelruimte langs het voorste aspect van de zesde wervel, zodat het einde van de naald het ruggenmergkanaal binnendringt. Gebruik stompe tangen om het ruggenmergproces van de L6-lendenwervel te lokaliseren en duw de naald vervolgens langs het voorste aspect van de zesde wervel in de ongewerveldebrataruimte.Duw de geleide canule op zijn plaats langs de naald, verwijder de naald en steek de katheterdraadassemblage in de geleide canule. Hengel de katheter in een hoek van ongeveer 45 graden naar het ruggenmergkanaal, forceer het einde van de katheter ongeveer 0,3 centimeter in het kanaal. Verwijder de stylet draad ongeveer 2,5 centimeter van de intrathecale punt van de katheter en vooraf de katheter in het wervelkanaal tot de twee centimeter markering op de katheter is gewoon zichtbaar onder de spier.Wanneer de katheter op zijn plaats is, verwijder de geleidekanule om de katheter en stylet draad op zijn plaats te laten. Ga de katheter in het ruggenmergkanaal tot de twee centimeter merk is bij de ingang van het kanaal en volledig trekken de stylet draad. Cerebrale spinale vloeistof kan worden gevisualiseerd het invoeren van de geïmplanteerde katheter.Sluit vervolgens de leveringskatheterassemblage aan op het distale uiteinde van de geïmplanteerde katheter via het 30-meter naaldeinde. Laad vervolgens 60 microliter steriele zoutoplossing in een spuit van 100 microliter en laad een bolus van 30 microliter van de testverbinding in een tweede spuit. Sluit de zoutspuit aan op het uiteinde van de vuladapter van de leveringskatheterassemblage en spoel 20 microliter steriele zoutoplossing door in de intrathecale ruimte.Wanneer alle zoute is gespoeld, vervang de zoutspuit met de bolus geladen spuit en injecteer 30 microliter van de testverbinding in de intrathecal ruimte over een periode van 30 seconden. Wanneer alle bolus is geleverd, vervang de bolus geladen spuit met een andere zout beladen spuit en spoel de katheter door met nog eens 40 microliter zout. Wanneer het tweede volume van zout is geleverd, los de levering katheter assemblage van de geïmplanteerde katheter en gebruik een paar zeer hete warmte-gesteriliseerde dissectie tangen vast te klemmen op de slang te aseptisch snijden en warmte-afdichting van de geïmplanteerde katheter.Gebruik opneembare monofilament hechtingen om de warmteafgesloten katheter vast te zetten aan het bindweefsel en gebruik vervolgens niet-bevattende hechtingen om de huid te sluiten. Gebruik vervolgens gaas en zout om bloed van de huid te wassen en plaats de rat in een verwarmde couveuse met monitoring tot volledige weervermogen. In dit representatieve experiment, zeer goede knockdown werd verkregen in alle regio's verzameld na enkele bolus antisense oligonucleotide levering zoals aangetoond.Echter, een zekere mate van regionale variabiliteit werd gemeten met het ruggenmerg vertonen van het hoogste percentage van knockdown. Na een succesvolle injectie van de antisense oligonucleotide, of andere therapieën, in een geschikt model, kan men de farmacokinetiek, farmacodynamica en werkzaamheid van de therapieën evalueren.

intrathecal-delivery-antisense-oligonucleotides-rat-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Chen, Y., et al. Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the delivery of a test compound into the cerebrospinal fluid (CSF) through a catheter implanted in the lumbar spinal column of a rat model. The compound circulates along the CSF to the brain and spinal cord, enters neurons, and offers therapeutic potential.

Intrathecal Delivery of a Test Compound to the Rat Central Nervous System

Source: Li, D., et al. Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for the intrathecal injection of adeno-associated viruses (AAV) into the cerebrospinal fluid (CSF) of an awake mouse, covering syringe preparation, spinal alignment, and precise needle insertion. This method validates targeted gene delivery, supporting its potential for CNS therapies.

Intrathecal Delivery of Viruses in a Mouse Model for Treating Central Nervous System Diseases

We beschrijven een werkwijze om drugs te richten op het centrale zenuwstelsel door of implanteren van een katheter of het uitvoeren van een bolus injectie in de rechter laterale ventrikel in muizen. Wij richten ons specifiek op de levering van antisense oligonucleotiden. Deze techniek gemakkelijk aanpasbaar aan andere drugs en ratten.

Directe Intraventriculaire levering van drugs aan het knaagdier centrale zenuwstelsel

Dit rapport beschrijft een eenvoudige en snelle techniek van intrathecale naaldpunctuur voor een gelokaliseerde transfectie van siRNA in de lumbale ruggenmerg muis onder kortdurende lichte verdoving.

In Vivo SiRNA Transfection en Gene Neerhalen in Spinal Cord via Rapid invasieve lumbale Intrathecale injecties in Muizen

Methoden voor een grootschalige centrale zenuwstelsel gene levering in de rat vallen. In dit voorbeeld is het doel om na te bootsen van een ziekte die het hele ruggenmerg aantast. De wijdverbreide transductie kan worden gebruikt voor een therapeutische eiwitten naar het CNS van een eenmalige, perifere administratie.

Methoden en Tips voor intraveneuze toediening van Adeno-associated Virus voor ratten en evaluatie van het centrale zenuwstelsel transductie

Hier presenteren we een directe intrathecale injectietechniek gebruik van 1% lidocaïne waterstofchloride in een virale oplossing om te zorgen voor efficiënte adeno-associated virus levering aan kleine dieren en een scoresysteem te voorspellen transductie efficiëntie in het midden zenuwstelsel volgens de graad van tijdelijke zwakte veroorzaakt door lidocaïne.

Directe intrathecale injectie van recombinante Adeno-geassocieerde virussen in volwassen muizen

Hier presenteren we een protocol met behulp van een muis positionerings apparaat dat de juiste plaatsing van muizen mogelijk maakt voor de intranasale toediening van een hersen gerichte peptide-siRNA-formulering die effectieve gen-uitschakeling in het centrale zenuwstelsel toelaat.

Een positionerings apparaat voor de plaatsing van muizen tijdens intranasale siRNA levering aan het centrale zenuwstelsel

Het huidige protocol schetst stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van intrathecale injecties bij neonatale muizen voor genbewerking en medicijnafgifte.

Intrathecale injectie van pasgeboren muis voor genoombewerking en medicijnafgifte

Een chirurgische ingreep wordt beschreven om injecties uit te voeren in de lumbale stortbak van de jonge rat. Deze benadering is gebruikt voor de intrathecale toediening van gentherapievectoren, maar er wordt verwacht dat deze benadering kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan therapieën, waaronder cellen en medicijnen.

Intrathecale vectortoediening bij jonge ratten via lumbale stortbakinjectie

Een lumbale intrathecale injectie vertegenwoordigt een translationeel relevante toedieningsweg voor het toedienen van gentherapie aan het centrale zenuwstelsel. Dit uitgebreide gestandaardiseerde protocol voor lumbale intrathecale injecties bij neonatale, juveniele en volwassen muizen en ratten is bedoeld om onderzoekers te begeleiden bij het toepassen van deze techniek voor preklinische gentherapiestudies.

Lumbale intrathecale injectie van gentherapievectoren voor targeting van het centrale zenuwstelsel bij muizen en ratten

Dit artikel beschrijft intrathecale toedieningsmethoden voor op het CNS gerichte therapieën bij volwassen muizen, met de nadruk op protocolprecisie en het mogelijk maken van herhaalde injectie. Het bevat bevindingen uit een validatiestudie waarbij antisense-oligonucleotiden de expressie van mutant SOD1 verminderden in SOD1-ALS-modelmuizen, wat het nut van deze aanpak ondersteunt in preklinisch onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten.

Lumbale intrathecale injectie van SOD1-ASO's voor precieze CNS-targeting en voorspellende effectiviteit bij menselijke SOD1-G93A ALS-muizen

Leer intrathecale aflevering van antisense oligonucleotiden in het centrale zenuwstelsel van de rat via katheterimplantatie. Deze veilige en kosteneffectieve methode ondersteunt onderzoek naar farmacokinetiek en therapeutische efficiëntie.

Intrathecale afgifte van antisense oligonucleotiden in het centrale zenuwstelsel van de rat

Meer video's verkennen