Name: Co-Culture-tests met hoge doorvoer voor het onderzoek naar microbiële interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Leer een high-throughput co-culture-methode voor microbiële interacties om antimicrobiële stoffen te ontdekken. Dit protocol identificeert remmende stammen en ondersteunt microbioomonderzoek efficiënt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Daniel May, Marc Chevrette en Don Hoang voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk, met inbegrip van de inspanningen van Cameron R. Currie, werd gesteund door de Universiteit van Wisconsin-Madison, kantoor van de vice-kanselier voor onderzoek en Graduate Education met financiering van de Wisconsin Alumni Research Foundation, financiering ook verstrekt door de National Institutes of Health Centers for Excellence voor translationeel onderzoek (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck werd gesteund door een nationale bibliotheek van geneeskunde opleiding subsidie aan de berekening en informatica in biologie en geneeskunde opleiding programma (NLM 5T15LM007359). De financiers hadden geen rol in studie ontwerp, gegevensverzameling en interpretatie, of de beslissing om het werk voor publicatie in te dienen.

Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de ouders van de donor en het Comité voor de menselijke proefpersonen van de Universiteit van Wisconsin-Madison keurde het onderzoek goed (institutioneel Beoordelingsbord [IRB] goedkeuringsnummer H-2013-1044).
1. monster cultuur
Opmerking: Deze procedure wordt hier gebruikt voor de studie van interacties tussen bacteriën isolaten uit de menselijke neusholte. In principe zijn de volgende methoden van toepassing op elke cultuur voorwaarde. Hersenen-hart-infusie Bouillon (BHI) wordt gebruikt voor algemene vermeerdering van nasale bacteriën. Alle platen worden met 1,5% agar gestijgd. Voor deze studie worden monsters genomen van een zoute oplossing die in de neus van een donor wordt gespoeld (nasale spoeling), overgebracht naar micro centrifugebuizen en bevroren bij-80 °C.
<ol><li>Gebruik standaard kweektechnieken om 100 μL van elk van de ontdooide spoeling monsters op BHI-platen te plaat.</li>
	<li>Inbroed de platen gedurende 1 week aëroob bij 37 °c.</li>
	<li>Na incubatie, selecteer ≥ 2 kolonies van elk afzonderlijk morfoype per plaat en doorgang de isolaten aëroob op BHI platen door het strepen van een kolonie van de eerste plaat op een nieuwe BHI plaat en het incuberen van de plaat bij 37 ° c. Herhaal dit tot de bacterieculturen zuiver zijn. Opmerking: Bacteriële isolaten kunnen worden geïdentificeerd door middel van kolonie morfologie, Gram-kleuring, 16S rRNA gensequencing, of een andere methode. Het is echter niet nodig de identiteit van de isolaat te kennen om het protocol voort te zetten.</li>
	<li>Cryopreserve alle bacteriële isolaten bij-80 °C na het combineren van 1 mL 50% glycerol met 1 mL bacteriële nachtelijke cultuur (zie rubriek 3) in cryotubes.</li>
</ol>2.3D Printing stempels
Opmerking: Polycarbonaat werd geselecteerd als het stem materiaal vanwege de hoge Glasovergangstemperatuur (147 °C) die de standaard autoclaaf temperaturen (121 °C) overschrijdt, waardoor de kans op vervorming na herhaald gebruik tot een minimum wordt beperkt.
<ol><li>Laad de 3D-printer met polycarbonaat filament.</li>
	<li>Breng witte school lijm (Polyvinyl acetaat) aan op het printbed om te helpen in de hechting en Minimaliseer het kromtrekken van het inoculatie stempel tijdens de afdruk.</li>
	<li>Laad de. STL-model bestand (aanvullend gegevensbestand) voor het inoculatie stempel (Figuur 1) in de 3D-printersoftware.</li>
	<li>Druk de inoculatie stempel af bij een 290 °C nozzle-temperatuur, 60 °C bed temperatuur en laag hoogte van 0,38 mm.</li>
	<li>Wikkel de stempel in de aluminiumfolie en steriliseren door Autoclaveren voor 1,5 h op een zwaartekracht cyclus met 15 min drogen. Opmerking: Hoewel polycarbonaat hygroscopisch is, behouden de postzegels slechts ongeveer 0,5% water gewicht na autoclaven.</li>
</ol>3. bereiding van de nachtelijke culturen
<ol><li>Pipetteer 3 mL steriele BHI-Bouillon in 14 mL kweek buizen met behulp van een serologische pipet.</li>
	<li>Gebruik een steriele 1 μL inoculerende lus en laat een bacterie kolonie in de Bouillon inenten. Zwenk de lus om ervoor te zorgen dat de klomp in de Bouillon verspreidt. Vortex de kweek buizen kort voor incubatie.</li>
	<li>Incuberen de kweek buizen bij 37 °C 's nachts (~ 16 uur) op een shaker bij 250 rpm.</li>
	<li>Vortex om de klonters van cellen te breken zodra de bacteriële culturen voldoende troebelheid bereiken (OD600 ≥ 1).</li>
</ol>4. bereiding van de bioassay platen
Opmerking: Bioassay platen worden bereid in een laminaire flow kap om de steriliteit te behouden.
<ol><li>Bereid BHI-media met 1,5% agar en steriliseren door autoclaven volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Koel na autoclaven de BHI-media af tot 55 °C in een waterbad met temperatuurregeling.</li>
	<li>Pipetteer met behulp van een serologische pipet 3 mL gesmolten BHI-media in elk van de 12 putjes op een 12-putplaat. Zorg ervoor dat de putten zo exact en zelfs mogelijk zijn. Een liter media zal ~ 27 bioassay platen opleveren.</li>
	<li>Laat de agar 's nachts instellen.</li>
</ol>5. inoculerende bioassay platen met het test organisme
Opmerking: Een testorganisme verwijst naar het organisme waarvoor de productie van remmende activiteit (bijv. antibiotica productie) wordt bepaald met behulp van de co-Culture interaction assay. Voor dit experiment zijn de testorganismen Actinobacteria geïsoleerd uit nasale lavages monsters.
<ol><li>Beënt het testorganisme op een bioassay plaat door een steriele 10 μL inoculerende lus in de nachtelijke kweek te plaatsen en een kweek druppel over het linker derde deel van een plaat goed te strepen. Opmerking: Het wordt aanbevolen om slechts een derde van de put te streak, als overmatige groei van de goed verbiedt later inoculatie van doelorganismen.</li>
	<li>Herhaal dit totdat alle 12 putjes op de plaat met het testorganisme zijn inocculeerd.</li>
	<li>Incuberen de platen gedurende 7 dagen op de juiste temperatuur. Bij hogere temperaturen (≥ 37 °C) of in drogere klimaten, bewaar de platen in een vochtige verpakking om te voorkomen dat de platen uitdrogen.</li>
</ol>6. bereiding van doelorganismen
Opmerking: Een doelorganisme verwijst naar het organisme waarvan de inhibitie status wordt bepaald met behulp van de co-Culture interaction assay. Voor dit experiment zijn de doelorganismen Staphylococcus spp. geïsoleerd uit nasale lavages monsters.
<ol><li>Nadat de bioassay-platen gedurende 6 dagen zijn gebroed, bereidt u de nachtelijke culturen van de gespecificeerde doelorganismen voor, zoals hierboven is gedaan (zie rubriek 3).</li>
</ol>7. doelorganisme-inoculatie
Opmerking: Na een nachtelijke incubatie, zorg ervoor dat de culturen troebel zijn (OD600 ≥ 1). Sommige bacteriële culturen kunnen vlokken aan de onderkant van de cultuur buis. Vortex de cultuur buizen om klonters te dispergeren en de cultuur troebelheid te beoordelen.
<ol><li>Bereid de doelplaat voor door elke put van een lege 12-put plaat te vullen met 1,8 mL BHI en 200 μL van de beoogde nachtelijke kweek.</li>
	<li>Wikkel en plaats een steriel inoculatie stempel in de doelplaat. Zwenk de culturen zachtjes rond in de putten en zorg ervoor dat de culturen de naburige putten niet besmetten.</li>
	<li>Til de inoculatie stempel en zorg ervoor dat er een druppel van de verdunde doel cultuur op elke postzegel punt zit.</li>
	<li>
Maak een monocultuur controle plaat door het inoculatie stempel op een niet-inocculeerde bioassay plaat te plaatsen en de stempel voorzichtig te rocken, zodat een kweek druppel elk goed inoculseert. Zodra het inoculatie stempel is verwijderd, moet een druppel van cultuur zichtbaar zijn in de putjes van de bioassay plaat.
	<ol>
<li>Als er geen putjes zijn geënt met de inoculatie stempel als gevolg van oneffen media, spot dan 3 μL van de verdunde overnachtings cultuur aan de rechterkant van de putjes met behulp van een pipet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beënt de bioassay platen zoals hierboven gedaan (zie stap 7.4.1), maar lijn de stempel zo uit dat de uiteinden uitgelijnd zijn met de rechterkant van de 12 goed plaat. Zorg ervoor dat de postzegel geen contact met de bestaande bacteriële kolonie bij het inoculeren van de putten.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de stempel en plaats deze terug in de doelplaat.</li>
	<li>Herhaal de inoculatie voor elke bioassay-plaat totdat alle platen zijn inocculeerd.</li>
	<li>Incuberen de bioassay platen gedurende 7 dagen op de juiste temperatuur.</li>
</ol>8. scoren
<ol><li>
Na de co-culturing van de test en doelorganismen gedurende 1 week, scoor de interacties op basis van de volgende visuele beoordeling:
	<ol>
<li>Scoor de putten met de groei van het doelorganisme die de groei vertoont die niet te onderscheiden is van de monocultuur controle als "0" (geen remming) (Figuur 2A, B).</li>
		<li>Scoor de putten met het doelorganisme dat verminderde groei vertoont ten opzichte van de controle als "1" (zwakke remming) (Figuur 2C).</li>
		<li>Scoor de putjes waar het doelorganisme niet opgroeit als "2" (sterke remming) (Figuur 2D).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Communities%3A+Interactions+to+Scale%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Communities: Interactions to Scale.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234(2016).</li>
<li>Green, J., Bohannan, B. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+scaling+of+microbial+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Spatial scaling of microbial biodiversity.</a> Trends in Ecology & Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).</li>
<li>Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Antibacterial+Action+of+Cultures+of+a+Penicillium%2C+with+Special+Reference+to+their+Use+in+the+Isolation+of+B.+influenz%C3%A6%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ.</a> British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226(1929).</li>
<li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+from+Lethal+Bacterial+Competition+through+Coupled+Activation+of+Antibiotic+Resistance+and+a+Mobilized+Subpopulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation.</a> PLoS Genetics. 11 (12), e1005722(2015).</li>
<li>Zipperer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+commensals+producing+a+novel+antibiotic+impair+pathogen+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization.</a> Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).</li>
<li>Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungus-growing+ants+use+antibiotic-producing+bacteria+to+control+garden+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites.</a> Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).</li>
<li>Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+in+vitro+evaluating+antimicrobial+activity%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).</li>
<li>Heatley, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+assay+of+penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">A method for the assay of penicillin.</a> The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).</li>
<li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Performance+standards+for+antimicrobial+disk+susceptibility+tests%3B+approved+standard+-11th+ed.+CLSI+document+M02-A11%22">Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11</a>. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, Pennsylvania. (2012).</li>
<li>Adnani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coculture+of+Marine+Invertebrate-Associated+Bacteria+and+Interdisciplinary+Technologies+Enable+Biosynthesis+and+Discovery+of+a+New+Antibiotic%2C+Keyicin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin.</a> ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).</li>
<li>Nichols, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+iChip+for+high+throughput+in+situ+cultivation+of+%26%2334%3Buncultivable%26%2334%3B+microbial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of iChip for high throughput in situ cultivation of &#34;uncultivable&#34; microbial species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).</li>
<li>Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGonzalez%2C+DJ+%22Microbiology+%28Reading%2C+England%29%22">Microbiology (Reading, England)</a>. 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).</li>
<li>Hoefler, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+resistance+to+the+lipopeptide+surfactin+as+identified+through+imaging+mass+spectrometry+of+bacterial+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).</li>
<li>Hoefler, B. C., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry%2C+Metabolism%2C+and+New+Views+of+the+Microbial+World%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Products+Analysis%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World.</a> Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).</li>
<li>Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+metabolic+exchange+with+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry.</a> Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).</li>
<li>Stubbendieck, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+among+Nasal+Bacteria+Suggests+a+Role+for+Siderophore-Mediated+Interactions+in+Shaping+the+Human+Nasal+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).</li>
<li>Winkelmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+siderophore-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Microbial siderophore-mediated transport.</a> Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).</li>
<li>Chevrette, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+potential+of+Streptomyces+from+insect+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes.</a> Nature Communications. 10 (1), 516(2019).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Antibiotica en andere secundaire metabolieten die microbiële interacties bemiddelen, zijn nuttig voor een veelheid aan toepassingen, waaronder het opsporen van geneesmiddelen. Hierin wordt een protocol voor co-Culture-assays gepresenteerd om grote aantallen microbiële interacties te beoordelen. Deze co-cultuur interactie assays zijn een eenvoudige, betaalbare, schaalbare en hoge doorvoer middelen om te onderzoeken veel Pairwise combinaties van micro-organismen in tandem. Doelorganismen worden naast testorganismen in een ...

In de natuur bestaan micro-organismen zelden geïsoleerd; Dientengevolge, ze zijn voortdurend interactie met andere organismen. Daarom is het essentieel om een veelheid van microbiële gedragingen te begrijpen1, om te bestuderen hoe micro-organismen met elkaar omgaan. Microbiële interacties kunnen mutualistisch, commensaal of antagonistisch zijn. Deze in teractions kan invloed hebben op niet alleen de micro-organismen zelf, maar ook de omgevingen en hosts die de micro-organismen koloniseren1,2.
Veel wetenschappers bestuderen microbiële interacties om nieuwe antimicrobiële moleculen te identificeren. Een van de eerste klinisch belangrijke antimicrobiële moleculen werd gevonden door de studie van microbiële interacties. Sir Alexander Fleming observeerde een contaminerend Penicillium spp. isolaat dat de groei van een Staphylococcus -stam inhiemde, wat leidde tot de ontdekking van de veelgebruikte antibiotica penicillaire3. Karakterisering van de mechanismen die micro-organismen gebruiken om hun concurrenten te antagoniseren blijft een vruchtbare bron voor de ontdekking van antimicrobiële moleculen. Bijvoorbeeld, het werd onlangs aangetoond dat Streptomyces SP. stam Mg1 produceert antibioticum linearmycinen, die hebben een lytische en degradatieve activiteit tegen Bacillus subtilis4.
Verder werd een niet-ribosomaal gesynthetiseerd peptide, genaamd lugdunin, onlangs ontdekt na de constatering dat de nasale commensale Staphylococcus Lugdunensis Staphylococcus aureus5remt. Studies hebben ook aangetoond dat mutualistische interacties tussen micro-organismen even krachtig zijn als antagonistische interacties voor de ontdekking van antimicrobiële moleculen. Bijvoorbeeld, veel schimmel-landbouw mieren in de stam attini haven symbiotische bacteriën genoemd pseudonocardia op hun exoskelet die schimmelwerende moleculen produceert voor de remming van een verplicht pathogeen van hun schimmel gewas6. Omdat de studie van microbiële interacties gunstig is geweest voor het ontdekken van antimicrobiële moleculen, kan het gebruik van hoge doorvoer schermen resulteren in de ontdekking van nieuwe antimicrobiële moleculen.
Met betrekking tot de kosten en het gemak van de prestaties, de methoden die worden gebruikt voor het bestuderen van microbiële interacties variëren van eenvoudig tot complex. Een agar-plug assay is bijvoorbeeld een goedkope en eenvoudige methode die kan worden gebruikt om antagonisme tussen meerdere micro-organismen7te onderzoeken. Een agar-plug assay is echter geen efficiënte procedure en kan arbeidsintensief zijn voor veel Pairwise-combinaties. Om de effecten van microbieel geproduceerde producten op doel isolaten van belang in een hoge doorvoer manier te beoordelen, gebruiken veel laboratoria schijf diffusie testen8. Deze assays zijn gemakkelijk en goedkoop en kunnen schaalbaar zijn tot hogere aantallen monsters7. Deze bepaling vereist echter het opwekken van microbiële extracten en kan misleidende resultaten opleveren voor bepaalde combinaties van doelorganismen en antibiotica, zoals salmonella en cefalosporinen9.
De voorgaande benaderingen zijn afhankelijk van geïsoleerde componenten om een reactie te lokken in een doelorganisme, in plaats van het toestaan van micro-organismen om met elkaar te communiceren. Dit is van merk, omdat de interacties tussen microben kan de productie van "cryptische" antimicrobiële moleculen die niet worden geproduceerd in monocultuur ontlokken. Bijvoorbeeld, het werd onlangs aangetoond dat de antimicrobiële keyicin alleen wordt geproduceerd door een Micromonospora SP. Wanneer co-gekweekte met een Rhodococcus SP. dat is geïsoleerd van dezelfde spons microbiome10. Complexere interactie methodieken omzeilen deze potentiële monocultuur belemmering. De iChip is bijvoorbeeld handig voor het isoleren van zeldzame en moeilijk te kweken bacteriën uit milieu monsters en maakt het mogelijk om microbiële interacties te observeren door middel van groei in situ11. Om interacties in detail te onderzoeken, kan matrix geassisteerde Laser desorptie/ionisatie time-of-Flight Imaging Mass spectrometrie (MALDI-TOF-IMS) worden gebruikt. Deze aanpak biedt gedetailleerde informatie over de samenstelling en distributie van kleine moleculen en peptiden geproduceerd door het interageren van microbiële kolonies met een hoge ruimtelijke resolutie. MALDI-tof-IMS is ook gebruikt in meerdere studies van bacteriële interacties om de mechanismen van de competitie te karakteriseren12,13,14,15. Echter, MALDI-TOF-IMS vereist vaak bewerkelijk monstervoorbereiding, gespecialiseerde expertise om de apparatuur te bedienen, en dure en gespecialiseerde massaspectrometers. Om deze redenen is het een moeilijke techniek om te gebruiken voor studies met een hoge doorvoer. Dus, een eenvoudige, schaalbare en co-cultuur test met hoge doorvoer voor microbiële interacties die veel beperkingen van de bovenstaande benaderingen overkomt, zou gunstig zijn.
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een hoge doorvoer van microbiële co-cultuur. Deze test is eenvoudig en gemakkelijk te integreren in reeds bestaande onderzoeken naar microbiële interacties. In tegenstelling tot veel veelgebruikte methoden voor de studie van microbiële interacties, onze methode is eenvoudig, goedkoop, en is vatbaar voor onderzoek naar grote aantallen interacties. Deze testen zijn niet alleen gemakkelijk uit te voeren, maar de materialen zijn op grote schaal verkrijgbaar bij de meeste laboratorium leveranciers of openbare bronnen (bijv. bibliotheken en makerspaces). Bijgevolg is deze test voordelig als een eerste onderzoekslijn om interessante patronen te identificeren en te parseren tussen vele combinaties van micro-organismen, die vooral nuttig kunnen zijn voor het onderzoek naar microbiële ecologie.

<table><tbody><tr><td>1 &mu;L disposable polystyrene inoculating loops, blue</td><td>VWR</td><td>12000-806</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;L disposable polystyrene inoculating loops, yellow</td><td>VWR</td><td>12000-810</td><td></td></tr><tr><td>12-well cell culture plate, sterile with lid</td><td>Greiner bio-one</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100 mm 2style, nonpyrogenic, sterile</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile</td><td>USA scientific</td><td>1420-9710</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serological pipet</td><td>Cell Treat</td><td>229225B</td><td></td></tr><tr><td>Agar, bacteriological</td><td>VWR</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion Broth</td><td>Dot Scientific</td><td>DSB11000-5000</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate filament, white, 3 mm diameter</td><td>Keene Village Plastics</td><td>12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>School Glue</td><td>Elmer's</td><td>EPIE304</td><td></td></tr><tr><td>Taz 6 3D printer</td><td>Lulzbot</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

co-culture-tests met hoge doorvoer voor het onderzoek naar microbiële interacties

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

De studie van interacties tussen micro-organismen heeft geleid tot tal van ontdekkingen, van nieuwe antimicrobiële stoffen tot inzichten in microbiële ecologie. Veel benaderingen die worden gebruikt voor de studie van microbiële interacties vereisen gespecialiseerde apparatuur en zijn duur en tijd intensief. Dit artikel presenteert een protocol voor co-cultuur interactie testen die goedkoop, schaalbaar zijn tot grote sample-nummers, en gemakkelijk aanpasbaar aan tal van experimentele ontwerpen. Micro-organismen worden samen gekweekt, waarbij elk goed één paarsgewijze combinatie van micro-organismen vertegenwoordigt. Een testorganisme wordt aan één zijde van elk goed gekweekt en eerst geïnineerd in monocultuur. Vervolgens worden doelorganismen gelijktijdig op de tegenoverliggende zijde van elke put geënt met behulp van een 3D-gedrukte inoculatie stempel. Na co-cultuur worden de voltooide testen gescoord voor visuele fenotypes, zoals groei of remming. Deze testen kunnen worden gebruikt om fenotypes te bevestigen of patronen te identificeren tussen isolaten van belang. Met deze eenvoudige en effectieve methode kunnen gebruikers combinaties van micro-organismen snel en efficiënt analyseren. Deze co-cultuur aanpak is van toepassing op antibiotica ontdekking, evenals op cultuur gebaseerde microbiome onderzoek en is al met succes toegepast op beide toepassingen.

Co-cultuur interactie testen kunnen worden gebruikt om microbiële interacties te begrijpen, patronen van belang te identificeren en microbiële isolaten met intrigerende activiteiten te ontdekken. In deze onderzoeken is een testorganisme monocultureerd aan één zijde van een 12 well agar-plaat en gedurende 7 dagen geïnpoleerd. Vervolgens wordt een doelorganisme naast het testorganisme gespot en werden de twee microben gedurende 7 dagen vóór het scoren voor het groei fenotype van het doelorg...

De co-cultuur interactie testen gepresenteerd in dit protocol zijn goedkoop, hoge doorvoer, en eenvoudig. Deze testen kunnen worden gebruikt om microbiële interacties in co-cultuur te observeren, interactie patronen te identificeren en het remmende potentieel van een microbiële stam van belang tegen menselijke en milieu pathogenen te karakteriseren.

Co-Culture-tests met hoge doorvoer voor het onderzoek naar microbiële interacties

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Ons protocol biedt een hoge doorvoermethode voor het screenen van een groot aantal paarswise microbiële interacties in tandem om interacties van belang te identificeren die microbioomonderzoek en antimicrobiële ontdekking kunnen helpen. Deze methode is gemakkelijk toepasbaar op het bestuderen van microbiële interacties in verschillende systemen, zolang de micro-organismen beminnelijk zijn voor cultuur onder laboratoriumomstandigheden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gebruikers in staat stelt om een groot aantal microbiële interacties scherm in een relatief korte periode van tijd.Nieuwe gebruikers van deze techniek moeten de tijd nemen, vooral bij het inenten van de bioassay platen, want het is cruciaal om voorzichtig te zijn om begroeiing of verontreiniging te minimaliseren. Visuele demonstratie van deze techniek is van cruciaal belang, omdat het inenten van de bioassay platen precisie vereist om ervoor te zorgen dat de organismen de putten niet overwoekeren, en dat de co-culturen niet besmet zijn. Begin met het voorbereiden van nachtelijke culturen.Gebruik een serologische pipet om drie milliliter BHI bouillon toe te voegen in 14-milliliter kweekbuizen. Gebruik dan een steriele een microliter inenting lus om een bacteriële kolonie in de bouillon inenten. Draai de lus om ervoor te zorgen dat de klomp zich verspreidt in de bouillon.Kort vortex de cultuur buizen, en incubeer ze 's nachts op 37 graden Celsius op een shaker op 250 RPM. Zodra de bacteriële culturen bereiken een OD 600 boven een, vortex hen te breken de klonten van cellen. Bereid PHI-media voor met 1,5% agar en steriliseer deze door autoclaving.Koel vervolgens de media af tot 55 graden Celsius in een temperatuurgecontroleerd waterbad en doseer drie milliliter gesmolten BHI-media in elk van de 12 putten op een bord, zodat de putten zo gelijkmatig mogelijk zijn. Laat de agar dan 's nachts instellen. Inenting het testorganisme op een bioassay plaat door het inbrengen van een steriele 10-microliter inenting lus in de nachtelijke cultuur, en strepen de cultuur druppel over de linker derde van een plaat goed.Herhaal dit totdat alle 12 putten op de plaat zijn ingeënt. De platen zeven dagen ondersteboven incubeer maken bij de juiste temperatuur. Als uitbroeden bij temperaturen hoger dan of gelijk aan 37 graden Celsius, of in drogere klimaten, bewaar de platen in een vochtige container om te voorkomen dat ze uitdrogen.Bereid na de zesdaagse incubatie van de bioassayplaat 's nachts culturen van het doelorganisme voor zoals eerder beschreven. Bereid de doelplaat door het vullen van elke put van een lege 12-put plaat met 1,8 milliliter BHI, en 200 microliters van de doelgroep 's nachts cultuur. Plaats een steriele inentingstempel in de doelplaat.Draai voorzichtig de culturen rond de putten, zodat ze niet kruis-besmetten naburige putten. Til de inentingstempel op en zorg ervoor dat er een druppel van verdunde doelcultuur op elke stempeltip staat. Plaats de inentingsstempel op een niet-gecultiveerde bioassayplaat en wieg de stempel zachtjes zodat de kweekdruppel elk goed inent.Zodra de stempel is verwijderd, moet een druppel cultuur zichtbaar zijn in de putten. Als er geen putten zijn ingeënt met de inentingstempel, spot dan drie microliters van verdunde nachtcultuur op de putten met behulp van een pipet. Inenting vervolgens de bioassayplaten zoals eerder beschreven, maar lijn de stempeltips uit met de rechterkant van de 12-putplaat, zodat de stempel geen contact maakt met de bestaande bacteriële kolonie.Verwijder de stempel voorzichtig en plaats deze terug in de doelplaat. Als de agar ongelijk in de putten is gestold, wieg dan voorzichtig de stempel heen en weer, maar wees voorzichtig om de stempel niet in de groei van het testorganisme te verschuiven. Herhaal de inenting voor elke bioassayplaat totdat alle platen zijn ingeënt en vervolgens zeven dagen op de juiste temperatuur uitbroeden bij de juiste temperatuur.Na het co-culturing van de test en doelorganisme voor een week, score de interacties op basis van visuele beoordeling. Scoor de putten met de doelorganismegroei die niet te onderscheiden groei van de monocultuur als nul vertoont. Score de putten met verminderde groei als een, en geen groei als twee.De hier beschreven co-kweektesten werden gebruikt om de remmende activiteit van de actinobacteria testorganismen te beoordelen in de richting van de staphylococcus soorten doel organismen geïsoleerd uit de menselijke neusholte. In totaal werden 812 paarswise combinaties getest. Met name Corynebacterium propinquum sterk geremd coagulase negatieve staphylococci, met name in vergelijking met andere Corynebacteriën die ofwel zwak geremd coagulase negatieve staphylococcen of had geen remmende effecten.Door het gebruik van vergelijkende genomics werd een biosynthetisch gencluster voor de productie van siderophore geïdentificeerd in het Corynebacterium propinquum genoom. Co-cultuur interactie testen met behulp van standaard en ijzer-aangevuld BHI medium vastgesteld dat de remming fenotype tussen Corynebacterium propinquum en coagulase negatieve staphylococci was in feite ijzer-afhankelijk. Het is belangrijk om voorzichtig te zijn bij het stempelen van de plaat.Controleer elke put na het stempelen en zorg ervoor dat de inentingsstempel correct is uitgelijnd om besmetting te voorkomen. Na het identificeren van interacties van belang, latere studies met behulp van microbiële genetica en genomics, natuurlijke productisolatie en karakterisering, of imaging massaspectrometrie kan worden gebruikt om mechanismen die ten grondslag liggen aan deze interacties te karakteriseren. Dit protocol is onlangs gebruikt om siderophore-gemedieerde concurrentie tussen de menselijke nasale microbiota bloot te leggen, en geholpen bij de ontdekking van een nieuwe schimmeldodende molecuul genaamd cyphomycine.

high-throughput-co-culture-assays-for-investigation-microbial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Ali, I., et al. High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates a high-throughput fluorescent assay to evaluate how gut bacteria affect stress resilience in Caenorhabditis elegans. By tracking blue fluorescence from ruptured gut granules, the assay reveals earlier death signals in worms exposed to test bacteria.

High-Throughput Fluorescent Assay to Study Microbe-Worm Interactions

Source: Temkin, M. I. et al. High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates an in vitro assay to study microbial interactions between Corynebacterium propinquum and Staphylococcus in a co-culture.

An In Vitro Assay to Study Microbial Interactions in Co-Culture

Bacteriën produceren uitgescheiden verbindingen die het potentieel heeft om de fysiologie van hun microbiële buren beïnvloeden. Hier beschrijven we een coculture scherm dat de opsporing van dergelijke chemisch gemedieerde interspecies interacties door het mengen bodemmicroben met fluorescerende transcriptionele reporter stammen van Bacillus subtilis op vaste media toelaat.

Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Dit live-bacteriële celbeeldvormingsprotocol maakt visualisatie mogelijk van interacties tussen meerdere bacteriële soorten op het eencellige niveau in de tijd. Time-lapse imaging maakt het mogelijk om elke bacteriesoort in monocultuur of cocultuur te observeren om interspecies interacties te ondervragen in bacteriële gemeenschappen met meerdere soorten, waaronder individuele celmotiliteit en levensvatbaarheid.

Kinetische visualisatie van single-cell interspecies bacteriële interacties

In dit methodedocument presenteren we een screeningsstrategie met hoge doorvoer om chemische verbindingen, zoals osmolyten, te identificeren die een aanzienlijke impact hebben op de bacteriële persistentie.

High-throughput screening van chemische verbindingen om hun effecten op bacteriële persistentie op te helderen

Gistgroei fenotypes worden nauwkeurig gemeten door middel van zeer parallelle time-lapse beeldvorming van geïmmobiliseerde cellen die uitgroeien tot microkolonnies. Tegelijkertijd kunnen stresstolerantie, eiwitexpressie en eiwitlokalisatie worden gemonitord, waardoor geïntegreerde datasets worden gegenereerd om te bestuderen hoe omgevings- en genetische verschillen, evenals genexpressie heterogeniteit tussen isogene cellen, de groei moduleren.

Live imaging met hoge doorvoer van microkolonnies om heterogeniteit in groei en genexpressie te meten

Hier beschrijven we een methode voor de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten met behulp van een reeks compatibele vectoren, gevolgd door de conventionele pulldown-technieken om eiwitcomplexen te bestuderen die niet in vitro kunnen worden samengevoegd.

Pulldown-test in combinatie met co-expressie in bacteriecellen als een tijdefficiënt hulpmiddel voor het testen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties

Dit protocol biedt een uitgebreide richtlijn voor het opzetten en kwantitatief monitoren van co-culturen, inclusief fotoautotrofe suikerafscheidende cyanobacteriën en heterotrofe gisten.

Assemblage en kwantificering van co-culturen die heterotrofe gist combineren met fototrofe suikerafscheidende cyanobacteriën

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Leer een high-throughput co-culture-methode voor microbiële interacties om antimicrobiële stoffen te ontdekken. Dit protocol identificeert remmende stammen en ondersteunt microbioomonderzoek efficiënt.

Co-Culture-tests met hoge doorvoer voor het onderzoek naar microbiële interacties

Meer video's verkennen