Name: Ovariële kanker detectie met Photoacoustic flow Cytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer fotoakoestische flowcytometrie voor detectie van circulerende eierstokkankercellen met behulp van gefoliumzuur-afgedekte koper sulfide nanopartikelen. Deze methode biedt een eenvoudig, kosteneffectief platform voor specifieke kankermarkerdetectie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Madeleine Howell graag erkennen voor haar hulp bij synthese, Matthew Chest voor zijn hulp bij het ontwerpen van het flow-systeem, en Ethan Marschall voor hulp bij SolidWorks.

1. synthese en Functionalisatie van nanodeeltjes
Opmerking: synthese van de FA-CuS NPs wordt bereikt met behulp van een One-pot synthesemethode aangepast uit een eerder gepubliceerde protocol21. Let op: alle synthese moet plaatsvinden in een geventileerde chemische rook afzuigkap.
<ol><li>Vóór de synthese, filter ongeveer 300 mL gedeïoniseerd (DI) water al een 0,2 μm steriele filter.</li>
	<li>Reinig een ronde bodem kolf van 250 mL met een wasmiddel oplossing en spoel af met DI-water. Voeg 0,0134 g CuCl2 toe aan 100 ml di water om een 1 mm oplossing te creëren.</li>
	<li>Voeg 0,015 g foliumzuur (FA) toe aan de CuCl2 -oplossing en roer gedurende ~ 5 minuten door middel van een magnetische roerstaaf.</li>
	<li>Voeg na2s · 9h2O (0,024 g in 100 μL di water) over ongeveer 10 s toe aan het reactiemengsel met behulp van een pipet van 200 μL. Opmerking: bij toevoeging van de na2S · 9h2O zal de oplossing van kleur veranderen van een licht geel naar een donker bruin.</li>
	<li>Dop de reactie en plaats in een oliebad, ingesteld op 90 °C, en Blijf roeren met een magnetische roerstaaf. Na ongeveer 15 minuten, of wanneer het oliebad 85 − 90 °C heeft bereikt, laat u de reactie gedurende een extra uur doorgaan. Uw mengsel moet geleidelijk aan een donker groene kleur te veranderen. Opmerking: Zorg ervoor dat u het systeem ontluchten tijdens het verwarmen van het reactiemengsel om druk ophoping te voorkomen.</li>
	<li>Verwijder het reactievat uit het oliebad en laat ongeveer 10 tot 15 minuten afkoelen bij kamertemperatuur voordat u overstapt op een ijsbad.</li>
	<li>Zodra het reactiemengsel onder de 20 °C is afgekoeld, past u de pH op 10 met 1M NaOH aan om het resterende foliumzuur op te lossen in oplossing.</li>
	<li>Reinig het FA-CuS-reactiemengsel met behulp van een 30 kDa-Centrifugeer kolom. Voeg oplossing toe in 15 mL batches aan de kolom en centrifugeer bij 3.082 x g gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Zodra al het reactiemengsel is geconcentreerd, de geconcentreerde fracties opnieuw combineren en 4x wassen met 15 mL pH 10 NaOH in de 30 kDa-Centrifugeer kolom.</li>
	<li>Voor massametingen neemt u 1/3 van de oplossing (~ 66 μL) en splitst u in drie glazen flesjes. Droog in een vacuüm oven 's nachts bij 40 °C onder een vacuüm van ~ 27 mmHg.</li>
	<li>Los de andere 2/3 geconcentreerde oplossing op in 250 μL PBS en bewaar deze bij 4 °C tot verder gebruik.</li>
	<li>Voorafgaand aan het gebruik van de FA-cus NPs, sonificeren ze voor 30 min in een bad sonicator op een hoge instelling.</li>
</ol>2. NP-karakterisering
<ol><li>Voer Dynamische lichtverstrooiing (DLS) toe 10 μL geconcentreerde FA-CuS NPS in PBS-oplossing van stap 1.1.14 tot 2 mL DI water. Voorafgaand aan de karakterisatie door DLS, soniceren de deeltjes gedurende 30 minuten in een bad-sonicator op een hoge instelling en filtreer door een 0,2 μm steriele filter om reststof te verwijderen.</li>
	<li>Voer transmissie Elektron microscopie (TEM): Voeg 10 μL geconcentreerde FA-CuS NPS in PBS-oplossing toe aan een stuk waspapier. Omkeren van een formvar gecoate koperen raster op de bovenkant van de druppel en laat zitten voor 2 min. Raak de rand van het raster met formvar gecoat aan op een stukje filtreerpapier om overtollige vloeistof te verwijderen. Laat de lucht drogen. Afbeelding van het koperen rooster met behulp van een elektronen microscoop bij een versnelde spanning van 80 kV. Opmerking: typische resultaten van de FA-CuS NPS-karakterisering worden weergegeven in Figuur 1.</li>
</ol>3. celcultuur
<ol><li>Dit protocol maakt gebruik van SKOV-3 cellen. Tenzij anders vermeld, cultuur SKOV-3 cellen in Mccoy's 5A medium aangevuld met 10% FBS, 100 U/mL penicillaire, en 100 μg/mL streptomycine, en onderhouden bij 37 °C in een bevoficeerde 5% CO2 incubator.</li>
</ol>4. fluorescerende tagging van FA-CuS NPS voor microscopie
<ol><li>Voeg Texas-Red-X succinimidyl Ester (0,2 mg opgelost in DMSO bij een concentratie van 10 mg/mL) aan een oplossing met 2 mg FA-CuS NPs in 1 mL 0,1 M NaHCO3 (pH ~ 9) buffer.</li>
	<li>Roer het reactiemengsel met behulp van een magnetische roerstaaf voor 1 uur, weg van het licht bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Concentreer het reactiemengsel in een 4 mL 30 kDa MWCO-Centrifugeer kolom door te spinnen op 4.000 x g gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Was de geconcentreerde oplossing 3x met 4 mL 0,1 M NaHCO3 buffer (pH ~ 9) in een centrifugeren kolom. Was vervolgens de geconcentreerde oplossing met 4 mL DI water 3x of totdat slechts een spoor hoeveelheid fluorescentie zichtbaar blijft in de doorstroom door UV-VIS.</li>
</ol>5. FA-CuS NPS opname door ovariële kankercellen
<ol><li>Voorafgaand aan de incubatie met FA-CuS NPs, incuberen SKOV-3 cellen in een T75 kolf met 8 − 15 mL foliumzuur vrije RPMI-1640 media met 10% FBS en 1% penicillaire/streptomycine gedurende ten minste 24 uur.</li>
	<li>Zaadcellen in 0,5 mL foliumzuur vrije RPMI-1640 complete groeimedia met een dichtheid van 0,1 x 106 cellen/ml in een 24-put.</li>
	<li>De volgende dag incuberen cellen met 400 μg/mL FA-CuS NPS in 0,5 mL foliumzuur vrije RPMI-1640 complete groeimedia voor 2 uur.</li>
	<li>Na deze incubatie, trypsinize de cellen met 0,5 mL 0,25% trypsine met EDTA. Voeg ten minste 1 mL foliumzuur vrije RPMI-1640 complete groeimedia toe om de trypsine te neutraliseren en centrifugeer de cellen bij 123 x g gedurende 6 minuten.</li>
	<li>Verwijder het supernatant, hervat de cellen in 2 mL PBS en centrifugeer bij 123 x g gedurende 6 min. Voer deze Wash stap 2x uit om ongebonden NPs te verwijderen.</li>
	<li>Respendeer de cellen in 1 − 2 mL PBS met 2% tween-oplossing.</li>
	<li>Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en trypan blauw. Verdere verdunde cellen als de celtellingen te hoog zijn. Verdun cellen in PBS met 2% tween naar de gekozen concentratie voor detectie.</li>
	<li>De cellen zijn nu klaar om te worden geanalyseerd door het PAFC-systeem.</li>
</ol>6. fluorescentiemicroscopie van FA-CuS NPS opname
<ol><li>Herhaal de stappen die worden vermeld in stap 5,1 en ga verder met het onderstaande protocol voor microscopie.</li>
	<li>Zaadcellen met een dichtheid van 0,1 x 106 cellen/mL in 0,5 ml foliumzuur vrije rpmi-1640 volledige groeimedia op glazen dekstroken in een 24-put.</li>
	<li>De volgende dag incureren de cellen met fluorescently gelabelde FA-CuS NPs in triplicaat, in concentraties van 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, en 400 μg/mL in 0,5 mL foliumzuur vrije r-1640 complete groeimedia.</li>
	<li>Incuberen de cellen met de NPs voor 2 uur in de 37 °C-incubator</li>
	<li>Na deze incubatieperiode was de cel 3x met PBS. Opmerking: Voeg voor alle wasstappen voorzichtig de oplossing aan de zijkant van de goed plaat toe om de cellen niet te storen. Na toevoeging, voorzichtig kantelen van de plaat en trek de oplossing van de zijkant van de put.</li>
	<li>Inbroed de cellen met 0,5 mL 3,7% Paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 15 minuten en breng de glazen dekstroken over naar een nieuwe 24-put. Let op: PFA is een bekend kankerverwekkend. Doe alle fixatie in een geventileerde chemische rook afzuigkap en draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen.</li>
	<li>Inincuberen de cellen in een oplossing van 3,7% PFA met 0,1% Triton-X in PBS gedurende 5 min.</li>
	<li>Was de cellen met 0,5 mL PBS 3x gedurende 5 minuten en breng de afdek stroken over naar een nieuwe plaat.</li>
	<li>Inbroed de cellen met 0,5 mL van een PBS-oplossing die DAPI bevat (20 μL/mL van een 0,5 mg/mL stamoplossing wordt gebruikt voor kleuring) gedurende 5 minuten, weg van het licht.</li>
	<li>Was de cellen met PBS 3x.</li>
	<li>Monteer de dekstroken op dia's met het afdekmedium na de laatste PBS-wassing.</li>
	<li>De cellen zijn nu klaar om te worden gefotografeerd door fluorescentiemicroscopie. Figuur 2 toont een voorbeeld van typische celkarakterisatie door fluorescentiemicroscopie.</li>
</ol>7. flow systeemarchitectuur
<ol><li>Stroom kamer constructie Opmerking: een SolidWorks bestand van een 3D printed flow tank kan worden gevonden in de aanvullende materialen.<ol>
<li>Met behulp van het meegeleverde SolidWorks bestand, 3D print de flow tank met ABS thermoplastisch of PLA plastic. Afmetingen worden hieronder gegeven als SolidWorks niet beschikbaar is. Figuur 3a toont een representatie van dit model. De carrosserie van de flow tank is 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. De uiterste uiteinden van de stroom tank omvatten gaten met een diameter van ongeveer 5 mm om de toevoer van slangen met het capillaire buisje mogelijk te maken. Opmerking: de stroom tank heeft een gat van 1 cm, loodrecht op de oriëntatie van de capillaire buis, voor de plaatsing van de ultrasone transducer. Een cilindrische extrusie met dezelfde binnendiameter als het gat strekt zich uit tot 6 mm in de tank. Voor real-time beeldvorming heeft de flow tank een sleuf van 1 mm x 3 mm direct onder de capillaire buis.</li>
		<li>Na het afdrukken van de 3D-stroom tank, reinig en monteer het systeem voor gebruik.</li>
		<li>Plaats glazen dekstroken over de 1 mm x 3 mm sleuf en het 1 cm gat in het stroomsysteem.</li>
		<li>Zorgvuldig afdichten met siliconen om lekkage te voorkomen.</li>
		<li>Monteer de capillaire buis in de siliconen uitgeharde buizen. Steek de buizen in de stroom kamer, maar de zijkant van de stroom tank zodanig dat het Glazen capillair zich direct boven en voor de 3 mm sleuf en het 1 cm gat bevindt.</li>
		<li>Sluit de slang met behulp van siliconen om lekkage te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Photoacoustic flow systeem instellen Opmerking: afbeelding 3B en afbeelding 3C geven een voorbeeld van de architectuur van het flow-systeem.<ol>
<li>Sluit de transducer aan op een ultrasone pulser/ontvanger. Vergroot het signaal met een 59 dB Gain.</li>
		<li>Sluit de uitgang van het filter aan op een multifunctionele, herconfigureerbaar oscilloscoop uitgerust met een ingebouwde veld programmeerbare Gate Array.</li>
		<li>Sluit een van de buizen van de stroom kamer aan op een T-splitsing, verbonden met twee spuit pompen in elke tak.</li>
		<li>Vul een van de spuit pompen met lucht en de andere pomp met het te analyseren monster. Stel de pomp met lucht in op een debiet van 40 μL/min en de pomp met het monster tot een debiet van 20 μL/min. De resulterende tweefasige stroming zal een monstervolume van 1 μL produceren. Bij deze stroomsnelheid zal het systeem ongeveer 6,4 samples per minuut testen. Opmerking: om een consistente verdeling van cellen te handhaven, licht Vortex elk monster onmiddellijk voordat het wordt getest. Draai de spuit bovendien om de paar minuten om te voorkomen dat de cellen in de oplossing gaan.</li>
		<li>Verbind de overblijvende buis die het stroomsysteem verlaat naar een container met 10% bleekwater, om cellen weg te gooien nadat ze het stroomsysteem hebben verlaten. Opmerking: Controleer vóór gebruik van het stroomsysteem op lekken, omdat deze de stroom kunnen beïnvloeden. De cellen moeten zich in een gesloten systeem bevinden om de biologische veiligheid tijdens de procedure te handhaven.</li>
		<li>Het ontwerp van de 3D-gedrukte tank zorgt voor consistente en reproduceerbare uitlijning tussen de transducer en het laserlicht met minimale kalibratie. Wanneer de kwarts capillaire buis op de juiste wijze in de aangepaste tank wordt geplaatst, zorgt hij ervoor dat de transducer en de laser direct worden uitgelijnd.</li>
		<li>Plaats de sectie van het kwarts capillair in de directe uitlijning met de transducer, in het gezichtsveld van de Microscoop, waardoor een zorgvuldige plaatsing van de optische vezel boven het monster, zodat het verlicht de gehele breedte van de buis.</li>
		<li>Bestraleren van het monster met behulp van een optische vezel channeling een diode-gepompt Solid State Laser die werkt op een golflengte van 1.053 nm. Het laserlicht incident op het monster en de transducer gebruikt voor het meten van het photoacoustic effect zijn beide ongericht.</li>
		<li>De energie van het Laser incident op het monster is ongeveer 8 mJ en de 10 Hz Laser snelheid is voldoende om elk monster meerdere keren te verlichten als het door het systeem gaat.</li>
		<li>Plaats het stroomsysteem bovenop een omgekeerde Microscoop en zorg ervoor dat zowel de laserpuls als het pad van het monster zichtbaar zijn terwijl het monster het stroomsysteem passeert. Record stroom met behulp van een op Microscoop gemonteerde camera.</li>
		<li>Neem de ultrasone overnames op met behulp van Data Acquisition software (Zie tabel met materialen). Trigger echografie en gepulseerde laser met behulp van de FPGA. Gebruik PBS met 2% tween en FA-CuS NPs bij een concentratie van 100 μg/mL in PBS 2% tween, als negatieve en positieve controles, respectievelijk.</li>
		<li>Met behulp van een Microscoop gemonteerde camera, opnemen zowel het afvuren van de laser en de passage van monsters al het stroomsysteem. Deze opnames worden gebruikt om het akoestische signaal dat door de transducer is opgenomen te correleren met het afvuren van de laser. Als de monsters voor het afvuren van de laser passeren, kan het signaal worden gecorreleerd aan het resulterende foto-akoestische signaal voor analyse. Bij een samplingfrequentie van 10 Hz zal de laser elke stekker meerdere malen verlichten.</li>
	</ol></li>
</ol>8. nabewerking
<ol><li>Bereken voor elke signaal overname, s (t), de Hilbert-transformatie, H [s (t)], om een analytisch signaal te creëren.</li>
	<li>Creëer een complexe envelop, se(t), door de grootte van het analytische signaal te berekenen, zodanig <img src="/files/ftp_upload/60279/60279eq1.jpg"> dat en integreer de envelop om het totale signaal dat voortvloeit uit elke overname te meten. Vergelijk de signalen van elke testgroep (d.w.z. PBS, gelabelde cellen, FA-CuS NPs, cellen alleen) met behulp van een t-toets in R statistische software. RAW-photoacoustic-signalen en hun Hilbert-transformaties worden weergegeven in Figuur 4.</li>
	<li>Voorbeeld reconstructie Normaliseer de complexe envelop op basis van de maximale piek over de hele run. Als u een reeks uitvoeringen vergelijkt, normaliseert u de complexe envelop met de maximale piek over de gehele reeks. Na normalisatie converteert u elke overname naar een reeks pixelwaarden. Representeren elke reeks pixelwaarden als een kolom in de reconstructie van de afbeelding. Representatieve reconstructies van PBS en de FA-CuS NPs-signalen worden weergegeven in Figuur 5, waar beide afbeeldingen zijn genormaliseerd met behulp van de maximale piek over beide uitvoeringen.</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+global+cancer+incidence+and+mortality+in+2018%3A+GLOBOCAN+sources+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods.</a> International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer+and+their+clinical+value+as+a+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis.</a> PLoS One. 10 (6), e0130873(2015).</li>
<li>Guo, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+value+of+HE4%2B+circulating+tumor+cells+in+patients+with+suspicious+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer.</a> Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).</li>
<li>Lianidou, E., Hoon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((9+-+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Principles+and+Applications+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA.</a> Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+escape+from+EpCAM-based+detection+due+to+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition.</a> BMC cancer. 12 (1), 178(2012).</li>
<li>Galanzha, E., Zharov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+detection+and+capture+by+photoacoustic+flow+cytometry+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo.</a> Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).</li>
<li>Nedosekin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+noninvasive+analysis+of+graphene+nanomaterial+pharmacokinetics+using+photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).</li>
<li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+flow+cytometry%3A+principle+and+application+for+real-time+detection+of+circulating+single+nanoparticles%2C+pathogens%2C+and+contrast+dyes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optic%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo.</a> Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).</li>
<li>Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic micropipette.</a> Applied Physics Letters. 113 (26), 264103(2018).</li>
<li>Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrauterine+photoacoustic+and+ultrasound+imaging+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe.</a> Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).</li>
<li>Galanzha, E. I., Zharov, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic flow cytometry.</a> Methods. 57 (3), 280-296 (2012).</li>
<li>O'Brien, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+of+circulating+tumor+cells+using+photoacoustic+flowmetry+and+two+phase+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221(2012).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+flow+cytometry+for+single+sickle+cell+detection+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Cellular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo.</a> Analytical Cellular Pathology. 2016, 11(2016).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+enrichment%2C+photoacoustic+diagnosis%2C+and+photothermal+purging+of+infected+blood+using+multifunctional+gold+and+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles.</a> PLoS One. 7 (9), e45557(2012).</li>
<li>Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indocyanine+green-loaded+photoacoustic+nanodroplets%3A+dual+contrast+nanoconstructs+for+enhanced+photoacoustic+and+ultrasound+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging.</a> ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).</li>
<li>Kim, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+plasmonic+assemblies+of+gold+nanoparticles+with+multimodal+function+for+targeted+cancer+theragnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17327(2017).</li>
<li>Ku, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+sulfide+nanoparticles+as+a+new+class+of+photoacoustic+contrast+agent+for+deep+tissue+imaging+at+1064+nm%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm.</a> ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).</li>
<li>Parker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor+expression+in+carcinomas+and+normal+tissues+determined+by+a+quantitative+radioligand+binding+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay.</a> Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).</li>
<li>Cheung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+folate+receptor+alpha+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Targeting folate receptor alpha for cancer treatment.</a> Oncotarget. 7 (32), 52553(2016).</li>
<li>Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theranostic+CuS+nanoparticles+targeting+folate+receptors+for+PET+image-guided+photothermal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy.</a> Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).</li>
<li>Lusk, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+Flow+System+for+the+Detection+of+Ovarian+Circulating+Tumor+Cells+Utilizing+Copper+Sulfide+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+value+of+circulating+tumor+cells+%28CTCs%29+captured+by+microfluidic+device+in+patients+with+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer.</a> Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).</li>
<li>Blassl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+single+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer-Establishment+of+a+multi-marker+gene+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel.</a> Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+living+circulating+tumor+cells+in+patients+by+immunomagnetic+negative+enrichment+coupled+with+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry.</a> Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).</li>
<li>Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+capture+of+breast+cancer+cells+with+photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007(2016).</li>
<li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+monitoring+of+circulating+single+cancer+cells+and+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents.</a> Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liquid+biopsy+using+Cytophone+platform+for+photoacoustic+detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma.</a> Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857(2019).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+early+malaria+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis.</a> Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+enrichment+and+multiplex+photoacoustic+detection+of+circulating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells.</a> Nature Nanotechnology. 4 (12), 855(2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol is een eenvoudige methode voor de detectie van ovariële Ctc's met behulp van PAFC en een gerichte CuS contrastmiddel. Er zijn veel methoden onderzocht voor de detectie van ovariële ctc's, waaronder microfluïdische apparaten, RT-PCR en fluorescentie flow cytometrie23,24,25. Deze variëren in complexiteit, kosten en nauwkeurigheid, waardoor hun effectiviteit in klinische instellingen wordt beperkt. PAFC introduceert ve...

Ovariële kanker is een van de dodelijkste gynaecologische maligniteiten en resulteerde in een geschatte 184.800 sterfgevallen wereldwijd in 20181. Meerdere studies hebben aangetoond dat de correlatie tussen ovariële kanker progressie (d.w.z. metastasen) en de aanwezigheid van ctc's2,3,4. De meest gebruikte methode voor detectie en isolatie van Ctc's maakt gebruik van het Cellsearch systeem, dat de EpCam receptor5richt. EpCam expressie, echter, is gedowngereguleerd in epitheliale naar mesenchymale overgang, die is betrokken bij kanker metastasen6. Ondanks vooruitgang, huidige klinische technologieën nog steeds lijden aan lage nauwkeurigheid, hoge kosten, en complexiteit. Vanwege deze nadelen, nieuwe technologieën voor de ontdekking en opsomming van ovariële Ctc's is uitgegroeid tot een belangrijk gebied voor onderzoek.
Onlangs ontstond pafc als een effectieve methode voor de niet-invasieve detectie van kankercellen, analyse van nanomaterialen en identificatie van bacteriën7,8,9. PAFC verschilt van traditionele fluorescentie flow cytometrie door het detecteren van analyten in stroming door gebruik te maken van photoacoustics. Het photoacoustic-effect wordt gegenereerd wanneer laserlicht wordt geabsorbeerd door een materiaal dat thermoelastische expansie veroorzaakt, wat een akoestische Golf produceert die kan worden gedetecteerd door een ultrasone transducer10,11. Voordelen van pafc over traditionele Flowcytometrie methoden zijn eenvoud, eenvoudig vertalen naar klinische instellingen, en de detectie van ctc's op ongekende diepten in patiënt monsters12,13. Recente studies hebben gebruikt pafc systemen voor de detectie van cellen met behulp van endogene en exogene contrast14,15. In de buurt van infrarood (NIR) lichtabsorberende contrastmiddelen zoals indocyanine Green Dye en Metal NPs (bijv. goud en cus) zijn gebruikt voor het selectief labelen van cellen en weefsels in combinatie met foto akoestische beeldvorming16,17,18. Als gevolg van de verbeterde penetratie diepte van NIR-licht binnen biologische weefsels, kan fotoakoestische detectie van absorbers worden uitgevoerd op grotere diepten voor klinische toepassingen. Vanwege het grote potentieel voor gebruik in de kliniek heeft de combinatie van gerichte NIR contrastmiddelen met PAFC aanzienlijke belangstelling voor de opsporing van Ctc's opgeleverd.
PAFC in combinatie met gerichte contrastmiddelen biedt een verbeterde aanpak voor analyses met een hoge doorvoer van patiënt monsters met verbeterde nauwkeurigheid en gerichte detectie van Ctc's. Een van de belangrijkste detectie strategieën voor Ctc's is de specifieke targeting van membraan eiwitten die aanwezig zijn op de cel van belang. Een opmerkelijk kenmerk van ovariële ctc's is de overexpressie van folaat receptoren gelegen op hun buitenste membraan19. Folate receptor targeting is een ideale strategie voor de identificatie van ovariële Ctc's in het bloed omdat endogene cellen, die een hogere expressie van foliumzuur receptoren hebben, over het algemeen luminal zijn en beperkte blootstelling aan de bloedbaan20. Koper sulfide NPs (cus NPS) zijn onlangs erkend voor hun vermogen om te richten folaat receptoren uitgedrukt op kankercellen21. Gecombineerd met hun biocompatibiliteit, het gemak van synthese en de absorptie diep in de NIR, maken deze NP-contrast agenten een ideale targetingstrategie voor de detectie van ovariële Ctc's die gebruikmaken van PAFC.
Dit werk beschrijft de voorbereiding van FA-CuS NPs en het gebruik ervan voor de detectie van ovariële kankercellen in een photoacoustic flow-systeem. CuS NPs worden gemodificeerd met foliumzuur specifiek doelwit ovariële Ctc's en uitzenden van een photoacoustic signaal wanneer gestimuleerd met een 1.053 nm laser. De resultaten duiden op de succesvolle detectie van ovariële kankercellen geïnhaleerd met deze fotoakoestische contrastmiddelen binnen het PAFC-systeem. Deze resultaten tonen de detectie van ovariële kankercellen tot concentraties van 1 cel/μL, en fluorescentiemicroscopie bevestigt succesvolle opname van deze deeltjes door SKOV-3 ovariële kankercellen22. Dit werk biedt een gedetailleerde beschrijving van de FA-CuS NPs synthese, voorbereiding van monsters voor fluorescentiemicroscopie, de bouw van het photoacoustic flow-systeem, en de photoacoustic detectie van ovariële kankercellen. De gepresenteerde methode toont een geslaagde identificatie van ovariële Ctc's in de stroom met behulp van FA-CuS NPs. toekomstig werk zal zich concentreren op de klinische toepassing van deze technologie op de vroegtijdige opsporing van ovariële kanker metastasen.

<table><tbody><tr><td>0.025% Trypsin With EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro;m 1,000 mL Vacuum Filtration Unit</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td>Voor het filteren van grotere volumes DI-water.</td></tr><tr><td>0.2 &micro;m steriele spuitfilter</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3D Printed Tank</td><td></td><td>Op maat gemaakt</td><td></td></tr><tr><td>Acquisition Card</td><td>National Instruments</td><td>PXIe-5170R</td><td>250 MS/s, 8-kanaals, 14-bits</td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985-1.8KG</td><td>Detergens gebruikt voor het reinigen van glaswerk.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hematocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Copper(II) Chloride</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>206532500</td><td></td></tr><tr><td>Coupling Objective</td><td>Thorlabs</td><td>LMH-10x-532</td><td>Om gepulseerd licht aan optische vezel te koppelen.</td></tr><tr><td>Coupling Stage</td><td>Newport</td><td>F-91-C1-T</td><td>Trap voor het koppelen van gepulseerd licht aan objectief. Houdt FP-1A en LMH-10x-532 vast</td></tr><tr><td>CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath</td><td>Fisherbrand</td><td>Model CPX3800</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition software</td><td>National Instruments</td><td>NI LabVIEW 2017 (32-bit)</td><td>LabVIEW gebruikt om laserpulsen te synchroniseren met data-acquisitie.</td></tr><tr><td>Data Processing Software</td><td>Mathworks</td><td>Matlab R2016a</td><td>Reconstructies en grafieken geproduceerd met Matlab-software.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Chuck</td><td>Newport</td><td>FPH-DJ</td><td>Gebruikt om de blote vezel vast te houden.</td></tr><tr><td>Fiber Coupler</td><td>Newport</td><td>FP-1A</td><td>3-As-trap voor het positioneren van fiber chuck en optische vezel op het focuspunt van het objectief.</td></tr><tr><td>Folic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7876-10G</td><td></td></tr><tr><td>Formvar Coated TEM Grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FCF300-CU-SB</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96420-14</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2007</td><td></td></tr><tr><td>Norm-Ject 10 mL Syringes</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>4100-X00V0</td><td></td></tr><tr><td>Optical Fiber</td><td>Thorlabs</td><td>FG550LEC</td><td>Gebruikt om monster bloot te stellen aan gepulseerd licht.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62036</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pulsed Laser</td><td>RPMC Lasers Inc</td><td>Quantus-Q1D-1053</td><td>Gepulseerde laserbron met specificaties 1053 nm, 8 ns puls, 10 Hz maximum.</td></tr><tr><td>Pulser/Receiver</td><td>Olympus</td><td>5077PR</td><td>Ontvangt, filtert en versterkt fotoakoestische signalen. Werkt met 59 dB versterking.</td></tr><tr><td>Quartz Capillary Tube</td><td>Sutter Instrument</td><td>QF150-75-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free</td><td>Gibco</td><td>27016-021</td><td></td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Momentive Performance Materials, Inc.</td><td>GE284</td><td></td></tr><tr><td>SKOV-3 Cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Beads</td><td>BDH</td><td>BDH9292-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Sulfide Nonahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431648-50G</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pumps</td><td>New Era Pump Systems Inc</td><td>DUAL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X-Succinimydl ester</td><td>Invitrogen</td><td>1949071</td><td></td></tr><tr><td>Transducer</td><td>Olynmpus</td><td>V214-BB-RM</td><td>Ultrasone detector met centrale frequentie van 50 MHz en -6 dB fractionele bandbreedte van 82%.</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution 0.4%</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasound Gel</td><td>Parker Laboratories Inc.</td><td>Aquasonic 100</td><td>Ultrasone gel voor transducerkoppeling</td></tr></tbody></table>

ovariële kanker detectie met photoacoustic flow cytometrie

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Veel studies suggereren dat de opsomming van circulerende tumorcellen (Ctc's) belofte als een prognostisch instrument voor ovariële kanker kan tonen. De huidige strategieën voor de detectie van Ctc's omvatten Flowcytometrie, microfluïdische apparaten en real-time polymerase kettingreactie (RT-PCR). Ondanks recente vooruitgang, methoden voor de detectie van vroege ovariële kanker metastasen nog steeds ontbreekt de gevoeligheid en specificiteit die nodig zijn voor klinische vertaling. Hier wordt een nieuwe methode gepresenteerd voor de detectie van ovariële circulerende tumorcellen door photoacoustic flow cytometrie (PAFC) met behulp van een aangepast driedimensionaal (3D) gedrukt systeem, met inbegrip van een stroom kamer en spuitpomp. Deze methode gebruikt foliumzuur-afgetopte koper sulfide nanodeeltjes (FA-CuS NPs) om SKOV-3 ovariële kankercellen te targeten door PAFC. Dit werk toont de affiniteit van deze contrastmiddelen voor ovariële kankercellen. De resultaten tonen NP-karakterisering, PAFC-detectie en NP-opname door fluorescentiemicroscopie, waardoor het potentieel van dit nieuwe systeem om ovariële Ctc's op te sporen op fysiologisch relevante concentraties wordt aangetoond.

Figuur 1a toont een typische tem-afbeelding van de gesynthetiseerde nanodeeltjes. De gemiddelde grootte van het typische nanodeeltjes is ongeveer 8,6 nm ± 2,5 nm. Het meten van nanodeeltjes werd uitgevoerd in ImageJ. Er werden drempel-en waterloods functies toegepast om de deeltjes voor de meting te scheiden. De horizontale en verticale diameters van elk deeltje werden loodrecht op elkaar gemeten en verder gemiddeld. Voor DLS wordt een repres...

Een protocol wordt gepresenteerd voor het detecteren van circulerende ovariële tumorcellen met behulp van een op maat gemaakte photoacoustic flow systeem en gerichte foliumzuur-afgetopte koper sulfide nanodeeltjes.

Ovariële kanker detectie met Photoacoustic flow Cytometrie

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Huidige klinische eierstokkanker detectie maatregelen zijn niet-specifieke en gebrek aan zorg detectie van circulerende tumorcellen. Ons fotoakoetische stroomsysteem maakt het mogelijk om patiëntmonsters te testen op specifieke eierstokkankermarkers in de bloedstroom. Deze procedure biedt een unieke platformtechnologie met verbeteringen ten opzichte van de huidige technieken op het gebied van eenvoud, lage kosten, veelbelovende detectielimieten en het vermogen om te worden toegepast op brede toepassingen.Door middel van dit werk, streven we ernaar om af te bouwen van onze gerichte nanodeeltjes systeem voor eierstokkanker om ex vivo patiënt monsters te testen voor CTC's. Dit zeer veelzijdige PAFC-systeem is in staat om uit te breiden voor klinisch gebruik, het testen van de aanwezigheid van een breed scala van biomarkers in het bloed. Een goede optische uitlijning is van cruciaal belang voor de detectie van doelen binnen het fotoakoetische stroomcytometriesysteem.Zorg er bovendien voor dat er geen bellen tussen de glazen schuif en de transducer zitten om een goede akoestische koppeling te garanderen. Vanwege de aangepaste aard van het stroomsysteem en de componenten ervan, is visualisatie van de methode gunstig voor nauwkeurige reproductie. In een geventileerde chemische rookkap, filter ongeveer 300 milliliter gedeïoniseerd water door een steriel 0,2 micrometer filter.Voeg 0,0134 gram koperchloride en 100 milliliter gedeïoniseerd water toe aan een schone ronde bodemkolf van 250 milliliter om een koperchlorideoplossing van één millimolar te creëren. Voeg 0,015 gram foliumzuur toe aan de kolf en gebruik een magnetische roerstaaf om de oplossing ongeveer vijf minuten te mengen. Meng vervolgens 0,024 gram natriumsulfide nonahydraat met 100 microliter gedeïsized water.Gebruik een pipet van 200 microliter om deze oplossing langzaam toe te voegen aan het reactiemengsel gedurende een duur van ongeveer 10 seconden. Sluit het reactievat af. Plaats het vat in een oliebad ingesteld op 90 graden Celsius en blijven roeren.Na ongeveer 15 minuten of wanneer het oliebad de temperatuur tussen 85 en 90 graden Celsius heeft bereikt, laat de reactie een extra uur doorgaan. Wanneer de reactie is voltooid, verwijder het reactievat uit het oliebad en laat het 10 tot 15 minuten afkoelen bij kamertemperatuur voordat u het naar een ijsbad breng. Zodra de reactie is afgekoeld, pas de pH aan op ongeveer 10 met behulp van een molaire natriumhydroxide.Voeg het mengsel toe aan een 30 kilodalton centrifugatiekolom in 15 milliliter batches en centrifuge bij 3, 082 keer g gedurende 15 minuten om het reactiemengsel te zuiveren. Meng eerst de met foliumzuur bedekte kopersulfide nanodeeltjes bij de juiste concentratie in verse RPMI-media. Voeg deze nanodeeltjesoplossing toe aan elke put van de voorbereide 24-putplaat die SK-OV-3 cellen bevat met een concentratie van 400 microgram per milliliter.Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide gedurende twee uur. Hierna proberen de cellen te onderzoeken met 0,5 milliliter van 0,25% trypsine en EDTA. Om de trypsine te neutraliseren, voeg ten minste een milliliter foliumzuur-vrije RPMI 1640 volledige groeimedia en centrifugeren de cellen op 123 keer g gedurende zes minuten.Om de cellen te wassen, verwijder de supernatant, resuspend de cellen in twee milliliters PBS en centrifuge op 123 keer g gedurende zes minuten. Herhaal deze wasstap twee keer om ongebonden nanodeeltjes te verwijderen. Dan resuspend de cellen met een tot twee milliliter van een 2%Tween oplossing in PBS.Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en Trypan Blue. Verdun de cellen in een oplossing van 2%Tween in PBS tot de gekozen concentratie voor detectie. Gebruik het meegeleverde driedimensionale STL-bestand om de stroomtank 3D af te drukken met ABS thermoplastisch of PLA-plastic.Na het printen van de tank, reinigen en monteren van het systeem voor gebruik. Plaats glazen coverslips over de een millimeter bij drie millimeter sleuf en de een centimeter gat in de stroom systeem en zorgvuldig af te sluiten met siliconen om lekkage te voorkomen. Plaats vervolgens de capillaire buis in de siliconen uitgeharde buizen.Steek de buizen in de stroomkamer via de zijkant van de stroomtank zodanig dat de glazen capillaire buis direct boven en voor de drie millimeter sleuf en de een centimeter gat. Sluit de slang af met siliconen. Sluit vervolgens de transducer aan op een ultrasone pulser en ontvanger.Versterk het signaal met een winst van 59 decibel. Sluit de uitvoer van het filter aan op een multifunctionele herconfigureerbare oscilloscoop die is uitgerust met een ingebouwde veld programmeerbare poortarray. Sluit een van de buizen afkomstig van de stroomkamer aan op een T-verbinding die is aangesloten op twee spuitpompen bij elke tak.Vul een van de spuitpompen met lucht en de andere pomp met het te analyseren monster. Stel de pomp met lucht in op een stroomsnelheid van 40 microliters per minuut en stel de pomp met het monster in op een stroomsnelheid van 20 microliters per minuut. Sluit vervolgens de resterende buis die het stroomsysteem verlaat aan op een container van 10% bleekmiddel om cellen te verwijderen nadat ze het stroomsysteem hebben verlaten.Plaats het gedeelte van de kwartscapillaire buis in directe uitlijning met de transducer in het gezichtsveld van de microscoop om een zorgvuldige plaatsing van de optische vezel boven het monster mogelijk te maken, zodat deze de gehele breedte van de buis verlicht. Bestraal het monster met behulp van een optische vezel channeling een diode-gepompte solid-state laser die werkt op een golflengte van 1,053 nanometer. Gebruik een microscoop gemonteerde camera om de stroom, het afvuren van de laser, en de passage van monsters door het stroomsysteem op te nemen.In deze studie worden fotoakoestische stroomcytometrie en het beoogde kopersulfide-doelmiddel gebruikt om circulerende tumorcellen van de eierstokken op te sporen. Een typisch TEM-beeld van de gesynthetiseerde nanodeeltjes laat zien dat de gemiddelde grootte van een typisch nanodeeltje ongeveer 8,6 nanometer is. De horizontale en verticale diameters van elk deeltje worden dan loodrecht op elkaar gemeten en verder gemiddeld.De gemiddelde hydrodynamische diameter voor deze deeltjes is 73,6 nanometer. Kopersulfide nanodeeltjes hebben een karakteristieke absorptiecurve die zich uitstrekt tot in de nabij-infrarood. Er is een licht artefact rond 850 nanometer dat wordt veroorzaakt door het schakelen van lasers door de spectrofotometer.Fluorescentiemicroscopie beelden van cellen geïncubeerd met fluorescerend gelabelde nanodeeltjes tonen aan dat nanodeeltjes opname kan worden gevisualiseerd door de aanwezigheid van fluorescentie over de cel. Cellen die niet met nanodeeltjes zijn geïncubeerd, vertonen geen fluorescerend signaal. De aanwezigheid van dit fluorescerende signaal geeft de succesvolle opname van de deeltjes en hun vermogen om te worden gedetecteerd in het stroomsysteem.Voorbeelden van typische signalen van gegevensverwerving worden hier getoond. De ruwe gegevens geven de verschillen in signaal tussen de nanodeeltjes gelabelde cellen, PBS, en foliumzuur afgetopte kopersulfide nanodeeltjes. Met behulp van aangepaste lab view en MATLAB software, beeld reconstructies zijn gemaakt van de positieve en negatieve controles in real time en na de overname respectievelijk.Individuele enveloppen worden vervolgens omgezet in pixelwaarden en weergegeven als onafhankelijke kolommen. Duidelijke verschillen in fotoakoestisch signaal optreden tussen PBS en het met foliumzuur bedekte kopersulfide nanodeeltjes bij een concentratie van 100 microgram per milliliter. Tijdens deze procedure is het van cruciaal belang om de ultrasone transducer, microscoop en glasvezel in het fotoakoestische stroomcytometriesysteem goed uit te lijnen.Bevestig de uitlijning van het systeem door positieve en negatieve controles te testen. Door de veelzijdigheid van fotoakoestische targetingtechnieken en het brede scala aan toepassingen die mogelijk zijn met PAFC, maakt deze techniek de weg vrij voor translationeel belangrijke klinische en onderzoekstoepassingen. Om de klinische toepassing te waarborgen, moeten verdere studies zich richten op het testen van patiëntmonsters en het verminderen van procedurele stappen.De synthese van de nanodeeltjes moet plaatsvinden in een chemische rookkap met behulp van de juiste beschermende apparatuur. Menselijke cellijnen moeten worden behandeld volgens de richtlijnen van uw instelling. Het gebruik van de laser vereist stralingsveiligheidstraining en passende BESCHERMINGSMIDDELEN.Lasergebruik en fotoakoeien mogen alleen worden uitgevoerd door hoog opgeleid personeel.

ovarian-cancer-detection-using-photoacoustic-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We hebben een flowcytometer met behulp van laser-geïnduceerde echografie op te sporen circulerende melanoom cellen als een vroege indicator van gemetastaseerde ziekte.

Detectie en isolatie van circulerende melanoom cellen met behulp van Fotoakoestisch Flowmetry

In this video, we demonstrate a technique to facilitate the internalization of folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (CuS NPs). Folic acid-functionalized CuS NPs have the ability to target folate-receptors which are overexpressed in many ovarian cancer cells.

Functionalized Nanoparticle Targeting of Ovarian Cancer: A Technique to Facilitate Folic Acid-conjugated Nanoparticle Contrast Agent Uptake by Ovarian Cancer Cells

In this video, we present a photoacoustic flow cytometric detection of ovarian cancer cells bearing nanoparticles in a circulating in vitro flow chamber. This non-invasive technique successfully identifies circulating tumor cells in a flow system utilizing a contrast agent.

In Vitro Photoacoustic Flow Cytometry: A Non-invasive Flow Photoacoustic Technique to Detect Nanoparticle-bearing Circulating Ovarian Cancer Cells

This protocol describes a technique for sample preparation by co-culturing ovarian explants with the fallopian tube cancer cells. These samples are visualized using imaging mass spectroscopy, or IMS,  to detect small molecule exchange between the cells and tissues leading to tumor development.

Modeling Ovarian Cancer Communication for Imaging Mass Spectrometry Analysis: A Method to Identify Small Molecule Chemical Communicators in Metastatic Ovarian Tumor Development

Fotoakoestische cystography (PAC) heeft een groot potentieel om urineblazen, een straling gevoelige intern orgaan bij pediatrische patiënten, in kaart zonder gebruik van ioniserende straling of giftige contrastmiddel. Hier laten we zien het gebruik van PAC voor het in kaart brengen urineblazen met een injectie van optische-opake tracers bij...

Fotoakoestische cystography

We beschrijven een niet-invasieve dierlijke beeldvormingsplatform die de detectie, kwantificering en monitoring van de groei en recidief van ovariumkanker mogelijk maakt. Dit intra-peritoneale xenograftmodel bootst het klinische profiel van patiënten met ovariumkanker na.

Muizenmodel voor Non-invasieve beeldvorming te detecteren en Monitor Eierstokkanker Herhaling

Eierstokkankermetastase wordt gekenmerkt door talrijke diffuse intra-peritoneale laesies, waardoor nauwkeurige visuele kwantificering van de tumorbelasting een uitdaging is. Hierin beschrijven we een methode voor in situ en ex vivo kwantificering van de metastatische tumorbelasting met behulp van rood fluorescerend proteïne (RFP)-gelabelde tumorcellen en optische beeldvorming.

Kwantificering van Intra-peritoneale eierstokkanker Metastase

Hier presenteren we een protocol om materiaal te schatten en oppervlakte optische eigenschappen met behulp van de fotoakoestische effect gecombineerd met een totale interne reflectie. Deze techniek vervallende veld-gebaseerde Fotoakoestiek kan worden gebruikt om een ​​fotoakoestische meetsysteem materialen 'dikten, bulk en dunne film brekingsindices schatting maken en staand hun optische eigenschappen.

Evanescent Field Gebaseerd Fotoakoestiek: Optical Property Evaluatie aan oppervlakken

Eierstokkanker vormen metastasen in de peritoneale holte. Hier presenteren we een protocol te maken en gebruik folaat-receptor gerichte oppervlak-enhanced resonantie Raman verstrooiing nanoprobes dat onthullen van deze letsels met hoge specificiteit via de beeldvorming van de ratiometric. De nanoprobes intraperitoneally zijn toegediend aan levende muizen, en de afgeleide beelden correleren goed met histologie.

Oppervlakte-enhanced resonantie Raman verstrooiing nanosonde Ratiometry voor het opsporen van microscopische eierstokkanker via folaat Receptor gericht op

We rapporteren een co-geregistreerd echografie- en fotoakoestisch beeldvormingsprotocol voor de transvaginale beeldvorming van ovariële / adnexale laesies. Het protocol kan waardevol zijn voor andere translationele fotoakoestische beeldvormingsstudies, met name die met behulp van commerciële ultrasone arrays voor de detectie van fotoakoestische signalen en standaard delay-and-sum beamforming-algoritmen voor beeldvorming.

Een co-geregistreerd echografie- en fotoakoestisch beeldvormingsprotocol voor de transvaginale beeldvorming van ovariumlaesies

Veranderingen in de bloedstroom van de eierstokken tijdens de pre-ovulatieperiode zijn essentieel voor de eisprong. Doppler-echografie is gebruikt bij mensen en grote dieren om de hemodynamica en perfusie van de eierstokken te beoordelen. Er wordt een protocol gepresenteerd voor het toepassen van Doppler-echografie om de hemodynamica van de eierstokken tijdens de preovulatoire en periovulatoire fasen bij muizen te evalueren.

Doppler-echografie voor live beeldvorming en kwantificering van de ovariële vasculaire functie bij muizen

Leer fotoakoestische flowcytometrie voor detectie van circulerende eierstokkankercellen met behulp van gefoliumzuur-afgedekte koper sulfide nanopartikelen. Deze methode biedt een eenvoudig, kosteneffectief platform voor specifieke kankermarkerdetectie.

Ovariële kanker detectie met Photoacoustic flow Cytometrie

Meer video's verkennen