Time-lapse 2D-beeldvorming van fagocytische activiteit in M1 macrophage-4T1 muis borstkanker cellen in co-culturen
14 december 2019
Macrofaag fagocytische activiteit tegen kankercellen, in het bijzonder 4T1 muis borstklier carcinoom cellen, werd afgebeeld in deze studie. Het cocultuurmodel van de levende cellen werd vastgesteld en waargenomen met behulp van een combinatie van fluorescerende en differentiële interferentie contrast microscopie. Deze beoordeling is gemaakt met behulp van imaging software om multipoint time-lapse-video te ontwikkelen.
Het algemene doel van deze studie is het verkrijgen van een Time-Lapse 2D Imaging van phagocytische activiteit in M1 Macrofagen 4T1 Mouse Mammary Carcinomas Cells in Co-culturen. De levenscellen co-culturen model werd vastgesteld en waargenomen met behulp van een combinatie van fluorescerende en differentiële interferentie contrast microscopie. De beoordeling van fagocytose activiteit door macrofagen waren beeld;met behulp van imaging software te verdubbelen multi point time lapse video, voorafgaand aan het aten van onze incubatie.
De materie die we hebben uitgevoerd over de behoeften en voordelen van de honen te vervullen in het gedrag van macrofagen en de fagocytische activiteit met kankercellen. Specifiek in de studie is muis borstcarcinoom. Het eerste deel van deze studie begint met live cellen co-cultuur model van 4T1 muis borstcarcinoom cellen en RAW 2647 muis macrofagen.
Begin het experiment door 41 muiscarcinoomcellen en RAW 2647 muismacrofagen te kweken. Ontdooi eerst een flesje 4T1- en RAW 2647-cellen. Verdun de ontdooide cellen in 10 millimeter in een 15 mill conische buis.
Vervolgens centrifugeren de cellen op 660 g kracht gedurende 5 minuten om celpellet te verkrijgen. Voorzichtig de media aanzuigen, de cellen opnieuw opschorten in 8 molen van volledige media en de cellen overbrengen in weefselkweek. Broed de cellen uit op 37 graden Celsius met 5 procent kooldioxide.
Na een week van kweken onder randvoorwaarden, controleer de kolf dagelijks en aan te vullen met atmil complete media als dat nodig is. De volgende stap gaat verder met de immunostaining van M1 gepolariseerde RAW 2647 macrofagen. Deze stap moet zorgen voor een volledige polarisatie van M1 macrofagen.
Als de samenvloeiing van RAW 2647 heeft bereikt 70 tot 80 procent gooi de cultuur media en zachtjes twee keer spoelen met PBS. Bereid de macrofagen voor op het verzamelen door de aanhangende cellen voorzichtig los te maken met behulp van een celschraper en over te zetten in een conische buis van 50 molens. Tel cellen met behulp van hemocytometer en bereid een cel opsuspen bij een dichtheid van 100.000 cellen per schotel door het toevoegen van de resterende oplossing aan de zitdichtheid.
Zit 2 molen van macrofagen vering in twee beeldvormende schotels. Incubeer de cellen 2 tot 3 uur bij 37 graden Celsius met 5 procent kooldioxide om celafhankelijkheid mogelijk te maken. Bereid M1 polarisatiemedia voor door 100 nilligram per molen LPS en 20 nilligram per molen interferon-gamma op te nemen in een compleet medium aangevuld met 10 procent FBS.
Gooi de culturen supernatant van macrofagen geïncubeerd voor en zorgvuldig wassen van de monolagen in de schotel twee keer met behulp van PBS. Voeg 2 molen M1 polarisatiemedia toe aan een van de bijpassende gerechten en laat de duracellen in m1 macrofagen finnatype intrekken. Voordat u immunostaining, fix RAW en M1 macrofagen cellen met behulp van 2 molen van 4 procent paraformaldehyde en incubeer gedurende 50 minuten in kamertemperatuur.
Verwijder de supernatant en was de cellen monolayer met behulp van PBS, ten minste drie keer. Blus met 2 molen van 50 millimeter ammoniumchloride in PBS en incubeer gedurende 50 minuten bij kamertemperatuur. Permeabiliseren met behulp van 0,3 procent Triton X-100 in PBS voor 50 minuten in kamertemperatuur.
Blokkeren stap met behulp van 10 procent FBS voor 30 minuten in PBS kamertemperatuur. Incubeer met anti-iNOS antilichaam geconjugeerd FITC in PBS en een procent FBS 's nachts op 4 graden Celsius. Incubeer 1 molen VAN DAPI in beeldvorming schotels voor 10 minuten bij 37 graden Celsius in donkere staat door te bedekken met aluminiumfolie.
Was cellen met behulp van PBS ten minste 3 keer en voeg 1 molen van DMEM in bijpassende gerechten en klaar voor fluorescerende beeldvorming. De volgende stap gaat verder met het zaaien van 4T1 muiscarcinoomcellen. Als de samenvloeiing van 4T1 cellen bereiken 70 tot 80 procent gooi de cultuur media en gentley spoelen twee keer met PBS.
Voeg 1 molen van voorverwarmde trypsine toe om de cellen te de-associëren en tot 20 minuten bij 37 graden Celsius uit te broeden. Zodra de cellen lijken ontvoegd, breng de de-attached cellen naar een 15 molen conische buis. En voeg 2 molen van voorverwarmd compleet medium toe om de buis gezien te inactiveren.
Centrifuge op 600 g kracht gedurende 5 minuten om een cel pellet te verkrijgen. Verwijder de supernatant en opnieuw op te schorten pellet in 10 mill prerun bemonstering DMEM medium. Tel de cellen met behulp van hemocytometer en zaad 100.000 cellen in molen DMEM.
In beeldvorming deze met behandelde TC. De volgende stap is het labelen van levende 4T1 muis borstcarcinoom cellen met cfse kleuring. Verwijder eerst de bestaande media uit de beeldschaal die eerder met 4T1-cellen is gezaaid.
Bereid CFSE kleuroplossing voor door CFSE-vlekken in 1 mill PBS te verdunnen om 5 macrmal out te maken met toestemming. Voeg 1 molen CFSE kleuroplossing toe aan de beeldvormschaal om cellen gedurende 20 minuten in te broeden bij kamertemperatuur of 37 graden Celsius in het donker. Voeg een gelijke van DMEM aan de cellen plus kleuring oplossing en laat zaad voor 5 minuten.
De volgende stap is om RAW2647 muis macrofagen en co-cultuur zaad met 4T1. Na CFSE nivellering van 4T1 cellen, was de imaging schotel twee keer, met behulp van PBS. Zaad 2 molen van macrofagen suspensie in 4T1 imaging schotel.
De volgende stap is het polariseren van RAW 4627 macrofagen in M1 finnatype. Voeg 2 molen van M1 polarisatie media in de imagine schotel en laat de RAW-cellen te bezielen in M1 macrofaag finnatype. Het tweede deel van de studie is time-lapse beoordeling van M1 macrofagen fagocyted 4T1 cellen.
De volgende stap omvat live-cel video microscopie phagocytose beoordeling. Zet eerst de microscoop aan. Stel de temperatuur in op 37 graden Celsius.
En 5 procent kooldioxidegas. Plaats de co-cultuurcellen in het midden van het podium en schroef voorzichtig op de bovenste kamer. Gebruik de joystick om het podium te motoriseren door verschillende positie te selecteren die moet worden vastgelegd.
Er zijn veel factoren moeten worden overwogen tijdens het uitvoeren van live-cel beeldvorming. Om een vrij kleine video te verkrijgen. Het vereist optimalisatie van de blootstelling aan beeldvorming, tijdmeting en ook het automatiseren van focuscorrectie.
In het geval dat de video is overbelicht, onjuiste tijdsinterval, en ook onscherp, kost de video onbruikbaar. Herhaling van het experiment moet worden gedaan als een van deze factoren is gedetecteerd. Figuur één toont immunofluorescenties draaien met anti-iNOS in het groen.
Nucleaire marker DAPI in het blauw. En verbeterde versies van de meeste afbeeldingen. Film 1 is een representatieve live-cel film van het begrijpen van M1 macrofagen en 4T1.
CFSE gekleurd de meeste borstcarcinoom cellen co-culturen gevangen met behulp van multi-channel verwerving van florescent en de IC microscopie. Film 2 live-cell video microscopie films van multi-point in een enkele echtelijke schotel. Phagocytose van 4T1 door geïnduceerde M1-macrofagen.
Beelden werden gedurende 13 uur met tussenpozen van 50 minuten gemaakt. Film 3 live-cell video microscopie film, van een enkele coördinaten punt gekozen om een diepgaande visualisatie van de fagocytose van 4T1 door M1 Macrophages tonen. Rode pijlen toont aan M1 macrofagen, gele cirkel toont aan dat een aantal 4T1 cellen fluorene en goffman van 4T1 cellen doven.
M1 macrofagen move-ology beschrijven als porocytoplasma waren als 4T1 muis geheugen carcinomen hebben een epitheel morfologie. Macrofagen kunnen worden gezien bewegen om 4T1 cellen toe te voegen om cel-naar-cellen contact te maken. Die vervolgens wordt gevolgd door de opname van 4T1 cellen per M1 macrofagen.
Na het bekijken van deze video moet je een goed begrip over hoe live-cell video microscopie experiment uit te voeren;met 4T1 muis borstcarcinoom en RAW 2647 merad macrofagen. Je moet ook in staat om het opzetten van 's nachts co-culturen van beide celtypes fagocytose essay uit te voeren. Je moet ook begrijpen hoe de co-cultuers van 4T1 met LPS en interferon-gamma macrofagen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de fagocytische activiteit van M1-macrofagen tegen 4T1-melanomcellen van de muizenmamaklaarcarcinoom met behulp van een levend cel-coculturemodel. De beeldvorming werd uitgevoerd met fluorescentie- en differentieel interferentiecontrastmicroscopie, wat leidde tot multipunt time-lapse video-assessments.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Kankeronderzoek
Achtergrond
- Macrofagen spelen een cruciale rol in de immuunrespons tegen kankercellen.
- Inzicht in hun fagocytische activiteit kan waardevolle informatie verschaft voor de behandeling van kanker.
- Het 4T1-muismodel voor mammacarcinoom wordt veelvuldig gebruikt voor het bestuderen van borstkanker.
- Live cell imaging-technieken verbeteren de observatie van cellulaire interacties.
Doel van de studie
- Om de fagocytische activiteit van M1-macrofagen tegen kankercellen te visualiseren.
- Om een betrouwbaar co-culturemodel op te stellen voor real-time imaging.
- Om de dynamiek van het gedrag van macrofagen in de aanwezigheid van kankercellen te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Live cell co-cultuur van 4T1 muis mammarycarcinoomcellen en RAW 264.7 muismacrofagen.
- Fluorescentiemicroscopie voor het visualiseren van cellulaire interacties.
- Differentieel-interferentiecontrastmicroscopie voor verbeterde beeldvorming.
- Gebruik van beeldvormingssoftware voor multipoint time-lapse videoanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle totstandkoming van een co-cultuurmodel met levende cellen.
- Visualisatie van fagocytose van kankercellen door macrofagen.
- Time-lapse imaging onthulde dynamische interacties tussen macrofagen en kankercellen.
- Inzichten in het gedrag van macrofagen in de tumoromgeving.
Conclusies
- De studie biedt een kader voor het onderzoeken van interacties tussen macrofagen en kankercellen.
- Real-time imaging-technieken zijn effectief voor het bestuderen van fagocytische activiteit.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van immunotherapeutische strategieën.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Kwantitatieve time-lapse imaging van fagocytose door M1-macrofagen in co-cultuur met 4T1-carcinoomcellen biedt een direct inzicht in interacties tussen immuuncellen en tumorcellen, een kritiek omslagpunt voor ontdekkingen binnen de immuno-oncologie. Deze aanpak maakt een mechanistische risicoreductie van macrofaag-gemedieerde antitumoractiviteit mogelijk en ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie in een vroeg stadium. Het vermogen van deze methode om dynamisch celgedrag te documenteren, informeert translationele strategieën en de prioritering van portfolio's in pipelines voor kankerimmunotherapie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie mogelijk van de interactie tussen macrofaag en tumorcel en van de fagocytische functie.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door immuuneffectoractiviteit te verduidelijken in een ziekterelevante context.
- Levert functioneel bewijs voor targetvalidatie in immuno-oncologieprogramma's.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt een reproduceerbaar co-culturesysteem vast voor de kwantitatieve beoordeling van fagocytose.
- Faciliteert de standaardisatie van de assay via multipunt live-cell imaging en fluorescente labeling.
- Genereert kwantitatieve output die geschikt is voor comparatieve screening van modulatoren of kandidaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt in vitro bevindingen af op de dynamiek van de tumormicro-omgeving die relevant zijn voor preklinische modellen.
- Maakt continuïteit mogelijk van de immuuncelfunctie in de ontdekkingsfase naar translationeel onderzoek naar biomarkers.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van immunotherapeutische strategieën gericht op macrofaagactiviteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze workflow voor live-cell imaging slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek door hypothese-gestuurde analyse van immuun-tumorinteracties mogelijk te maken en ondersteuning te bieden bij daaropvolgende screening en translationele studies.
- Ontdekkingsbiologie: Levert direct bewijs van fagocytische activiteit, wat bijdraagt aan hypothesetoetsing en het verduidelijken van pathways.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve imaging-outputs voor assay-ontwikkeling en de evaluatie van verbindingen.
- Analytica: Maakt tijd-opgeloste meting van cel-celinteracties en fagocytosesnelheden mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro immuunfunctie met preklinische tumormodellen voor biomarker-afstemming.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Biedt een gestandaardiseerd, schaalbaar platform voor herhaalde immuun-oncologische onderzoeken.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in de functie van immuuncellen en de validatie van targets.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van live-cell imaging assays.
- Strategische waarde: Onderbouwt go/no-go beslissingen voor immuno-oncologie activa door mechanistische ambiguïteit te verminderen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten die gericht zijn op macrofaag-tumorinteracties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in live-cell imaging en het opzetten van co-culturesystemen.
- Vraagt om toegang tot geavanceerde fluorescentie- en DIC-microscopieplatformen.
- Noodzaak van strikte standaardisatie van beeldparameters en analyse tussen teams.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende tumor- of immuuncelmodellen, zoals ondersteund door het protocol.
- Afhankelijk van de optimalisatie van beeldcondities om datakwaliteit en reproduceerbaarheid te waarborgen.
