Name: Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Leer Candida albicans visualiseren in de gastro-intestinale tractus van muizen met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie. Deze methode onthult morfologie en lokalisatie van de schimmel in zijn natuurlijke omgeving.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De schrijvers willen Carolina Tropini, Katharine ng, Justin Sonnenburg en KC Huang graag bedanken voor hun begeleiding bij het ontwikkelen van de VISTECHNIEK. Teresa O'Meara verstrekte nuttige commentaren op het manuscript, en Miriam Levy bijgestaan door fotografie. Dit werk werd gesteund door NIH grants R01AI108992, R01DK113788, en een Burroughs Welcome Award in de pathogenese van besmettelijke ziekten.

<ol><li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
<li>Bacher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Anti-fungal+Th17+Immunity+and+Pathology+Rely+on+Cross-Reactivity+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans.</a> Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).</li>
<li>Shao, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+Candida+albicans+Positively+Calibrates+Systemic+Th17+Immunological+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses.</a> Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).</li>
<li>Jiang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+Fungi+Recapitulate+the+Protective+Benefits+of+Intestinal+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria.</a> Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).</li>
<li>Iliev, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+Between+Commensal+Fungi+and+the+C-Type+Lectin+Receptor+Dectin-1+Influence+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis.</a> Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).</li>
<li>Fan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+HIF-1+alpha+and+LL-37+by+Commensal+Bacteria+Inhibits+Candida+Albicans+Colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization.</a> Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).</li>
<li>Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+Damage+and+Neutropenia+Are+Required+for+Candida+Albicans+Dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination.</a> PLoS Pathogens. 4 (2), e35(2008).</li>
<li>Yamaguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+Colonization+of+Candida+Albicans+Differs+in+Mice+Fed+Commercial+and+Purified+Diets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets.</a> Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).</li>
<li>Kadosh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Antifungal+Treatment+in+a+Diet-Based+Murine+Model+of+Disseminated+Candidiasis+Acquired+via+the+Gastrointestinal+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).</li>
<li>Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Fungal+Infections%3A+Epidemiology%2C+Diagnosis%2C+and+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment.</a> Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).</li>
<li>Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+Through+the+Mammalian+Gut+Triggers+a+Phenotypic+Switch+That+Promotes+Candida+Albicans+Commensalism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism.</a> Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).</li>
<li>Witchley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Morphogenesis+Programs+Control+the+Balance+between+Gut+Commensalism+and+Invasive+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection.</a> Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).</li>
<li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
<li>Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+Cell-Mediated+Immunity+in+Candida+Albicans-Colonized+Gnotobiotic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice.</a> Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).</li>
<li>Guarner, J., Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+Diagnosis+of+Fungal+Infections+in+the+21st+Century%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century.</a> Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).</li>
<li>Johansson, M. E., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+Mucus+in+Histological+Sections%2C+Immunostaining+of+Mucins+in+Fixed+Tissue%2C+and+Localization+of+Bacteria+with+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH.</a> Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).</li>
<li>Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+and+Composition+of+the+Mucosal+Flora+in+Patients+with+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).</li>
<li>Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Amino+Acid+Liquid+Synthetic+Medium+for+the+Development+of+Mycelial+and+Yeast+Forms+of+Candida+Albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Sabouraudia%22%5BJournal%5D)">An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans.</a> Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).</li>
<li>Banerjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UME6%2C+a+Novel+Filament-Specific+Regulator+of+Candida+Albicans+Hyphal+Extension+and+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).</li>
<li>Earle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Gut+Microbiota+Spatial+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization.</a> Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).</li>
<li>Sokol, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+Microbiota+Dysbiosis+in+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Fungal Microbiota Dysbiosis in IBD.</a> Gut. 66 (6), 1039-1048 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven methode maakt visualisatie van C. albicans gisten en schimmeldraden in de GI Tracts van commensally gekoloniseerd muizen van elk geslacht of stam. De vissen sonde hybridizes tot 23S rRNA, die wordt verspreid over het gehele schimmel cytoplasma. Onze methode werd aangepast van een eerder gerapporteerd protocol voor het visualiseren van darmbacteriën20. Omdat C. albicans zijn morfologie binnen de gastheer verandert, is de methode nuttig om schimmel celvorm en lokalisatie te bewaken. We hebben deze methode bijvoorbeeld gebruikt om de hypothese te ontzien dat gisten het hele spijsverteringskanaal domineren, en om discrepanties bloot te leggen tussen de in vivo en in vitro fenotypes van bepaalde "filamentatie-defecte" mutanten12.
Er bestaan verschillende Muismodellen voor C. albicans commensale kolonisatie. De microbiota van laboratorium muizen en-mensen is verschillend en bij muizen is het gebruik van antibiotica of een gespecialiseerd dieet nodig om een stabiele kolonisatie te bewerkstelligen. Behandeling met antibiotica verbetert ook C. albicans kolonisatie van de mens en is een belangrijke risicofactor voor verspreide ziekte10. De antibiotica gebruikt in deze studie zijn relatief goedkoop en rendement betrouwbare dalingen in de bacteriële microbiota. Merk op dat antibiotica worden gebruikt om de last van antagonistische bacteriesoorten te verminderen, niet om alle bacteriën van de dieren te elimineren. Als onderzoekers willen studeren C. albicans-gastheer interacties bij afwezigheid van bacteriën of om het gebruik van antibiotica of een speciaal dieet te voorkomen, kunnen kiemvrije dieren worden vervangen door conventioneel gekweekte dieren; echter, gnotobiotische muizen vertonen bepaalde immuun en anatomische afwijkingen en daarom mogelijk niet geschikt voor alle doeleinden.
Verschillende stappen zijn belangrijk voor succesvolle viskleuring: de aanbevolen fixatie methode is essentieel om de structurele integriteit van GI-weefsels te behouden, met name de fragiele inhoud van het darm lumen, zoals de slijm-laag en de driedimensionale organisatie van schimmels en bacteriën16. Houd er rekening mee dat veel veelgebruikte fixatie oplossingen die water bevatten, zeer schadelijk zijn voor de luminal-architectuur. De Fixatieven en oplossingen voor na fixatie wast die in dit protocol worden aanbevolen, bevatten geen water en het is belangrijk om verontreiniging met water te voorkomen. Een andere kritieke stap is de hybridisatie stap, waarbij het belangrijk is om verdamping van de hybridisatieoplossing te voorkomen tijdens de incubatie van dia's in de hybridisatie oven. We raden aan om de dia's in een waterdichte container te plaatsen om dit probleem te voorkomen. Als alternatief kan men gebruik maken van waterdichte hybridisatie kamers zoals die oorspronkelijk werden gebruikt voor hybridisatie van micro arrays.
Een C. albicans-specifieke vissonde wordt beschreven in dit protocol. Omdat veel in het laboratorium gehouden muizen echter geen c. albicans of andere schimmels bevatten als onderdeel van hun natuurlijke darm microbiota, kan een panschimmel sonde specifiek c. albicans in experimenteel gekoloniseerde dieren bevlekken. Vervanging van een panschimmel sonde kan wenselijk zijn vanwege de superieure hybridisatie eigenschappen en een hogere signaal-ruis verhouding. Als de panschimmel sonde wordt gebruikt als een pseudo-specifieke sonde voor C. albicans, is het belangrijk om een gebrek aan kleuring te documenteren in niet-geïnfecteerde dieren (d.w.z. behandeld met antibiotica maar niet C. albicans). Kleuring van een niet-gekoloniseerd controle dier is ook nuttig om achtergrondkleuring te beoordelen die kan voortvloeien uit het vasthouden van VISVOELERS aan voedseldeeltjes. Over het algemeen biedt het gebruik van VISVOELERS een verbeterde specificiteit ten opzichte van de meeste andere methoden van kleurings schimmels, zoals Calcofluor White (die chitin vlekken, een celwand component die kan variëren tussen celtypen), GMS of commercieel verkrijgbare schimmelwerende antilichamen. Bovendien maakt VISKLEURING het mogelijk om meerdere organismen te cokleuring met behulp van differentiaal gelabelde visvoelers op soortspecifieke Rrna's.
Een voorbehoud van deze techniek is dat bepaalde C. albicans gist celtypen lijken zeer VERGELIJKBAAR door vis (bijvoorbeeld, de ondoorzichtige en gut celtypen). Om onderscheid te maken tussen deze celtypen, zou het nuttig zijn om hybridisatie voelers te ontwikkelen naar celtypespecifieke schimmel Mrna's. Niettemin heeft de vistechniek in zijn huidige vorm al verrassende verschillen onthuld tussen de in vivo en in vitro gedrag van C. albicans mutanten geëvalueerd onder beide omstandigheden12, wat duidt op complexe interacties in de natuurlijke commensale omgeving die niet adequaat worden geïmbootst door bestaande in vitro assays. Verdere studies van verschillende C. albicans vlekken in extra wild type en Mutant hosts zijn waarschijnlijk extra inzicht in de interacties van schimmel-host opleveren. In het bijzonder, het zal leerzaam zijn voor profiel c. albicans in modellen van inflammatoire darmziekte, die wordt geassocieerd met hoge Antilichaamtiters van c. albicans bij de mens21, en andere modellen van c. albicans overgroei en ziekte. De VISTECHNIEK kan ook worden gecombineerd met immunohistochemie om specifieke hostcellen te vlekken. Over het algemeen biedt de hier gepresenteerde methode een redelijk snel en betrouwbaar middel om de lokalisatie en morfologie van C. albicans in het darmkanaal van zoogdieren te bepalen.

Candida albicans is een schimmel commensaal en een opportunistisch humaan pathogeen. Deze gist mist een gedefinieerde milieu-niche en in plaats daarvan propageert binnen de gastro-intestinale (GI) tractus, huid, en urogenitaal tractus van mensen en andere zoogdieren1. Terwijl vroeg onderzoek naar C. albicans zich voornamelijk richtte op zijn virulentie potentieel, suggereren verschillende recente rapporten dat commensally teelt organismen in de darmen belangrijke rollen kunnen spelen in de normale gezondheid, met inbegrip van de immuunontwikkeling van de host2,3,4. Om onderzoek van C. albicans commensalism binnen de zoogdier darm te vergemakkelijken, ontwikkelden we een muismodel van stabiele GI-kolonisatie en een fluorescentie in situ hybridisatie (vis)-gebaseerde methode om schimmel gistcellen en schimmeldraden te visualiseren binnen de intestinale lumen.
Met enkele uitzonderingen5, laboratorium-gefokte muizen vertonen meestal weerstand tegen schimmel kolonisatie van het spijsverteringskanaal. Kolonisatie resistentie wordt verondersteld te worden bemiddeld door specifieke bacteriële soorten; Dit kan echter worden overwonnen door de behandeling van de dieren met antibiotica6,7 of het gebruik van een chemisch gedefinieerd dieet dat vermoedelijk bacteriesoorten samenstelling8,9verandert. Evenzo is bij mensen het gebruik van breedspectrum antibiotica in verband gebracht met C. albicans begroeiing en verspreiding10. Ons model van de kolonisatie van de Murine maakt gebruik van breedspectrum antibiotica om C. albicans kolonisatie van immunocompetente, conventioneel gehouden muizen te vestigen. Penicillaire en streptomycine worden in het drinkwater van de dieren aangeboden gedurende een week voorafgaand aan de maagsonde met 108 kolonie vormende eenheden (cfus) van C. albicans. Zolang het antibioticum-geïnfundeerd water wordt voortgezet, C. albicans zal propageren door de GI tractus, het bereiken van fecale Antilichaamtiters van 106− 108 cfus/g. Ondanks de hoge mate van schimmel kolonisatie, dieren blijven gezond en gewichtstoename tegen dezelfde snelheid als niet-geïnfecteerde controles. Dit model is met succes gebruikt om te schermen voor en karakteriseren meerdere C. albicans commensalism factoren11,12.
Net als andere leden van het schimmel rijk, C. albicans is geschikt voor enorme morfologische plasticiteit13. Onder in vitro omstandigheden is aangetoond dat het een overgang is tussen ten minste zes unicellulaire gistcellen, evenals multicellulaire schimmeldraden en pseudo-schimmeldraden. De gist-naar-hypha-overgang is een van de best gekenmerkte virulentie kenmerken, en schimmeldraden en pseudo-schimmeldraden domineren in de meeste zoogdieren ziekte modellen, evenals in geïnfecteerde menselijke weefsels. Om de lokalisatie en celmorfologie van C. albicans in het spijsverteringskanaal van Murine te bepalen, ontwikkelden we een vistechniek voor het verkleuren van gisten en schimmeldraden in vaste histologische secties. De sondes bestaan uit fluorescently gelabelde DNA-oligonucleotiden die hybridiseren om 23S ribosomaal RNA (rRNA), die wordt verspreid over het gehele schimmel cytoplasma. Omdat gastheer weefsels zijn vastgesteld op een manier die de driedimensionale architectuur van de darm behoudt, met inbegrip van de gastheer mucosa, spijsvertering materiaal, de bacteriële microbiota, en slijm in de darm lumen, deze techniek maakt de lokalisatie van schimmel cellen met betrekking tot deze bezienswaardigheden wanneer gekleurd. De VISTECHNIEK vergelijkt gunstig met traditionele histologische vlekken voor schimmels, zoals periodieke acid Schiff (PAS) of Gomori's methenamine-zilver (GMS), evenals in de handel verkrijgbare schimmelwerende antilichamen, omdat deze reagentia niet specifiek zijn voor C. albicans. Bovendien verwijderen standaard Fixatieven de slijm-laag en verstoren ze andere inhoud van het darm lumen14,15.
In dit artikel, bieden we gedetailleerde instructies voor het opzetten van high-grade C. albicans kolonisatie van de muis GI tractus, voor dissectie van het spijsverteringskanaal van geëugiseerde dieren, voor weefsel fixatie op een manier die luminal behoudt architectuur, en voor de detectie van C. albicans binnen gastheer weefsels met behulp van vis. Naast wild type en Mutant stammen van C. albicans, kan de maagsonde techniek worden gebruikt om andere micro-organismen te leveren. De fixatie techniek zou nuttig zijn voor elke studie waarin het behoud van de darminhoud gewenst is. De VISPROCEDURE kan binnen een dag worden voltooid en kan worden gebruikt om meerdere schimmelsoorten te lokaliseren met behulp van meerdere, differentieel gelabelde sondes.

<table><tbody><tr><td>1 mL spuit</td><td>BD</td><td>309659</td><td>kan worden vervangen door elke leverancier</td></tr><tr><td>BHI bloed agar</td><td></td><td></td><td>kan worden vervangen door elke leverancier</td></tr><tr><td>C. albicans FISH probe</td><td>IDT DNA Technologies</td><td>op bestelling</td><td></td></tr><tr><td>Kamer voor hybridisatie-incubatie</td><td></td><td></td><td>waterdichte kamer bedoeld om verdamping te verminderen</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>>=99.5%</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>kan worden vervangen door elke leverancier</td></tr><tr><td>Delicate task wiper tissues</td><td>Kimberley-Clark</td><td>34256CT</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-5KG</td><td>kan worden vervangen door elke leverancier</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>moleculaire biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>Voedingsnaalden</td><td>Cadence, Inc.</td><td>7910</td><td>metaal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; kan worden geautoclaveerd om te steriliseren</td></tr><tr><td>FITC-UEA-1</td><td>Sigma</td><td>L9006-1MG</td><td>andere fluoroforen beschikbaar</td></tr><tr><td>FITC-WGA</td><td>Sigma</td><td>L4895-2MG</td><td>andere fluoroforen beschikbaar</td></tr><tr><td>Schuimkussentjes</td><td>Fisher</td><td>22038221</td><td>Bestel schuimkussentjes die passen in cassettes</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>47671</td><td>moleculaire biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>Glazuur azijnzuur</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MK881746</td><td>ACS reagens, >=99.5%</td></tr><tr><td>Glas Coplin pot</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td>houdt tot 10 dia's rug aan rug</td></tr><tr><td>Histologie cassettes</td><td>Simport</td><td>M512</td><td>Diepe cassettes zodat cecum niet wordt verpletterd</td></tr><tr><td>Hybridisatie dekglasjes</td><td>Sigma</td><td>GBL712222</td><td>RNase-vrij</td></tr><tr><td>Hybridisatie oven</td><td></td><td></td><td>kan worden vervangen door elke leverancier</td></tr><tr><td>LB</td><td></td><td></td><td>kan worden vervangen door elke leverancier</td></tr><tr><td>Lee's media</td><td></td><td></td><td>bereid zoals beschreven in Lee et al. 1975</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>179337</td><td>ACS reagens, >=99.8%</td></tr><tr><td>Muizen</td><td>Charles River Laboratories</td><td>028</td><td>volwassen BALB/c; 18-21 gram (8-10 weken)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher</td><td>50-980-487</td><td>16% oplossing</td></tr><tr><td>Paraffinewas</td><td>Sigma</td><td>P3558-1KG</td><td>Paraplast voor weefsel inbedding</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>UCSF Cell Culture Facility Media Productie Unit</td><td>CCFAL003</td><td>calcium, magnesium-vrij; kan worden vervangen door elke leverancier</td></tr><tr><td>Penicilline G</td><td>Sigma</td><td>PENNA-100MU</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud dextrose agar</td><td></td><td></td><td>kan worden vervangen door elke leverancier</td></tr><tr><td>Zoutoplossing</td><td>Baxter</td><td>2F7123</td><td>steriel, kan worden vervangen door elke leverancier</td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>kan worden vervangen door elke leverancier; RNase-vrij onderhouden</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>kan worden vervangen door elke leverancier; RNase-vrij onderhouden</td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td>Sigma</td><td>S9137-100G</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP pen</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td>kan worden vervangen door elke leverancier</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>kan worden vervangen door elke leverancier; RNase-vrij onderhouden</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>bevat geen DAPI</td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Sigma</td><td>214736</td><td>reagenskwaliteit</td></tr><tr><td>YEPD</td><td></td><td></td><td>kan worden vervangen door elke leverancier</td></tr></tbody></table>

visualisatie van candida albicans in de murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is een schimmel component van de darm microbiota bij de mens en vele andere zoogdieren. Hoewel C. albicans geen symptomen in de meeste gekoloniseerde hosts veroorzaken, het commensale reservoir fungeert als een opslagplaats voor besmettelijke ziekte, en de aanwezigheid van hoge schimmel Antilichaamtiters in de darm wordt geassocieerd met inflammatoire darmziekte. Hier beschrijven we een methode om C. albicans celmorfologie en lokalisatie in een muismodel van stabiele gastro-intestinale kolonisatie te visualiseren. De kolonisatie wordt vastgesteld met behulp van een enkelvoudige dosis van C. albicans bij dieren die zijn behandeld met orale antibiotica. Segmenten van het weefsel van de darmen zijn vastgesteld op een manier die de architectuur van luminal inhoud (micro-organismen en slijm), evenals de gastheer slijmvlies behouden. Tot slot wordt fluorescentie-in-situ hybridisatie uitgevoerd met behulp van sondes tegen schimmel-rRNA tot vlek voor C. albicans en Hyphae. Een belangrijk voordeel van dit protocol is dat het toelaat om gelijktijdige observatie van C. albicans celmorfologie en zijn ruimtelijke associatie met gastheer structuren tijdens gastro-intestinale kolonisatie.

Volgens de instructies, zal de uitkomst van deze techniek fluorescerende etikettering van kernen in het gastheer epitheel, slijm, en C. albicans in gesectioneerde GI weefsels. Wild type Candida albicans cellen moeten verschijnen als ronde, unicellulaire gistcellen of zeer langwerpig, soms vertakkingen, multicellulaire schimmeldraden (celceldeling zal niet duidelijk zijn in de schimmeldraden). Mutanten van C. albicans kunnen bovendien verschijnen als kleinere, licht langwerpige "grijze" gisten of als grotere, licht langwerpige "darm" (gastro-intestinale geïnduceerde overgang) of "ondoorzichtige" gisten.
Figuur 1 toont de voeder naald die wordt gebruikt voor orale maagsonde, evenals belangrijke posities van de naald tijdens de maagsonde procedure. Figuur 2 biedt een typische setup die wordt gebruikt voor orgel dissectie en het uiterlijk van GI-segmenten van de muis.
Figuur 3 toont de vis kleuring van verschillende C. albicans celtypen na vermeerdering in vitro en binnen het muismodel. Figuur 3A toont fluorescentie-en fase beelden van vaste, permeabilized, in vitro-gepropageerde Hyphae. Hypha vorming werd geïnduceerd met vloeibare Lee's medium18 met 2% N-acetylglucosamine, pH 6,8 bij 37 °c. Figuur 3B toont fluorescentie-en fase beelden van vaste, permeabilized, in vitro gepropageerde gistcellen. Figuur 3C, D toont vaste, permeabilized, in vitro-gepropageerde darmcellen en ondoorzichtige cellen, respectievelijk. DARMEN en ondoorzichtige celtypen zijn morfologisch niet te onderscheiden, behalve wanneer gevisualiseerd door het scannen van elektronenmicroscopie. Houd er rekening mee dat vis kleuring van in vitro gepropageerde cellen suboptimaal zal zijn als de cellen niet goed doordoorlatiseerd zijn. Een voorbeeld van zwakke en diffuse kleuring wordt weergegeven in Figuur 3C. Voor de beste resultaten moeten de celfixatie-en permeabilization condities empirisch worden bepaald voor elk celtype en elke soort die moet worden onderzocht. Gelukkig produceert het aanbevolen protocol voor het visualiseren van C. albicans in gesectioneerde weefsels een consistentere permeisatie.
Figuur 3e-G verbeelden C. albicans in muis grote darmen, gekleurd met de C. albicans-specifieke sonde (Figuur 3E) of de panschimmel sonde (Figuur 3F, G). C. albicans lijkt rood in deze afbeeldingen, host celkernen zijn blauw, en de slijm-laag is groen. Zowel ronde gisten als zeer langwerpige schimmeldraden (witte pijlpunten) komen voor in de dikke darm. Houd er rekening mee dat kleuring helderder is met de panschimmel sonde. Figuur 3G toont een ume6 mutant in hetzelfde compartiment, gekleurd met de panfungale probe. ume6 codeert een transcriptiefactor die nodig is voor hypha vorming onder in vitro condities19 . Interessant is dat het gist-Locked fenotype dat door deze Mutant onder in vitro omstandigheden wordt weergegeven, niet in de darm wordt gerecapitculeerd, wat suggereert dat een redundante factor moet worden geactiveerd binnen de host12. Figuur 4 toont de verschijning van wild type C. albicans in verschillende segmenten van de Murine GI tractus, met inbegrip van de regio's direct grenzend aan de gastheer mucosa en meer centrale gebieden van de darm lumen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig01.jpg"> Figuur 1: belangrijke toevoer naaldposities tijdens de maagsonde. A) toevoer naald. B) het voeden van de naald kogel die aan de zijkant van de tong wordt ingebracht. C) toevoer naald in de rechtopstaande positie met inbrengen in de slokdarm. (D) toevoer naald ingebracht in de maag met enkele millimeter zichtbaar boven de neus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig02.jpg"> Afbeelding 2: voorbeeld dissectie layout. A) dissectie-pad en gereedschap. B) de GI-darmkanaal is weggesneden. Proximale (slokdarm) tot distale (anus) secties: I. maag. II. proximale dunne darmen. III. mediale dunne darmen. IV. distale dunne darmen. V. Cecum. VI. dikke darm. Roze onderbroken rand vakken geven de te fixen weefsels aan. C) weefsels die in cassettes zijn geplaatst. Romeinse cijfers zijn hetzelfde als in panel B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig03.jpg"> Figuur 3: representatieve beelden van vis-gebeitst c. albicans. a) visvan c. albicans schimmeldraden geteeld in vloeibare lee's media18 met 2% N-acetylglucosamine, pH 6,8. B) vis van C. albicans ronde gistcellen geteeld op yepd + 2% agar-platen. C) vis van C. albicans gut Cells (ySN1045), geteeld op yepd + 2% agar-platen. D) vis van C. albicans ondoorzichtige cellen geteeld op yepd + 2% agar-platen. E) wild type C. albicans (ySN250) in grote darmen, gekleurd met de C. albicans-specifieke sonde. F) wild type C. albicans in dikke darmen, gekleurd met de panschimmel sonde. (G) Ume6 Mutant (ySN1479) in dikke darmen, gekleurd met de panfungale Probe: rood is C. albicans, blauw is gastheer epitheel kernen, en groen is mucin. Pijlpunten geven Hyphae aan. Pijlen geven gist aan. Schaal staven = 20 μm. afbeeldingen F en G zijn aangepast van Witchley et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig04.jpg"> Figuur 4: verschijning van vis-gebeitst C. albicans in verschillende gut compartimenten. Wild type C. albicans wordt weergegeven in de aangegeven segmenten van de muis GI tractus. Binnen elk compartiment, beelden verbeelden het gebied grenzend aan de gastheer mucosa en de centrale regio van de darm lumen. Kleuring werd uitgevoerd met de panfungale probe. Schaalbalk = 20 μm. afbeeldingen zijn aangepast van Witchley et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Antibiotica bestanden (200x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penicillaire G</td>
			<td>181 mg/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Streptomycine</td>
			<td>400 mg/μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Methacarn</td>
		</tr>
<tr>
<td>Voorraad</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Eenheden</td>
		</tr>
<tr>
<td>Methanol</td>
			<td>60%</td>
			<td>300</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
			<td>30</td>
			<td>150</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ijsazijn</td>
			<td>10</td>
			<td>50</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Hybridisatieoplossing</td>
		</tr>
<tr>
<td>Voorraad</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Eenheden</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris-HCl, pH 7,4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>20</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M NaCl</td>
			<td>0,9 M</td>
			<td>180</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% SDS</td>
			<td>0,10%</td>
			<td>10</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% formamide</td>
			<td>1,00%</td>
			<td>10</td>
			<td>μL (in kleine aliquots bij-20 °C tussen toepassingen)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-vrij water</td>
			<td></td>
			<td>780</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Oplossing voor het wassen van vis</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris-HCl, pH 7,4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>1</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M NaCl</td>
			<td>0,9 M</td>
			<td>9</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-vrij water</td>
			<td></td>
			<td>40</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Mucin-nuclei-kleurings oplossing</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI, 10 μg/mL</td>
			<td>20 ng/mL</td>
			<td>2</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lectine, 40 μg/mL</td>
			<td>1,6 μg/mL</td>
			<td>40</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS, pH 7,4</td>
			<td></td>
			<td>958</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: typische volumes en concentraties van oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.

Het doel van dit protocol is het visualiseren van Candida albicans celvorm en lokalisatie in het maagdarmkanaal van zoogdieren.

Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Dit protocol heeft een aantal van de beste inzichten die we tot nu toe hebben opgeleverd in hoe Candida albicans het zoogdierarmkanaal bewoont. Bijvoorbeeld, tot voor kort, we wisten niet echt waar Candida is gelokaliseerd in de darm of welke van de vele morfologische vormen het aanneemt binnen deze niche. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om Candida te visualiseren in zijn natuurlijke omgeving zonder het verstoren van de driedimensionale interacties van de schimmel heeft met gastheer structuren of met bacteriën in de microbiota.Omdat de darm een complexe omgeving is, is het erg moeilijk om te modelleren in het laboratorium en daarom is het zeer bevredigend om een manier te vinden om Candida biologie direct in een hostmodel te onderzoeken. Bepaalde componenten van de darmmicrobiota, waaronder Candida albicans, worden verdacht van een rol bij ziekten zoals inflammatoire darmziekten. Deze techniek kan mogelijk worden gebruikt om de aanwezigheid van specifieke micro-organismen in biopsiemonsters verkregen van patiënten te diagnosticeren.Beheersing van de gavage techniek en het vermogen om gastro-intestinale segmenten te ontleden zonder de organen te scheuren is belangrijk voor het verkrijgen van optimale resultaten. Om te beginnen, gavage elk dier met het berekende volume van een bepaald entmateriaal. Bevestig een autoclaved dier voederen naald aan een een milliliter spuit en vul de spuit met een gavage volume ervoor te zorgen dat alle bellen te verwijderen.Plaats de spuit op een steriel oppervlak. Om het dier te beveiligen, houdt u het aan de voet van de staart met de dominante hand en schuift u de niet-dominante hand de rug van het dier naar de losse huid net achter de oren. Verzamel de scruff stevig bij elkaar met de duim en wijsvinger.Raap het dier op bij de scruff, draai het om en loop de kleine vinger van dezelfde hand rond de staart om het dier tegen de palm van de hand te immobiliseren. Strek het hoofd van het dier voorzichtig uit, zodat het in een rechte lijn met het lichaam. Pak vervolgens de spuit met de dominante hand en houd hem loodrecht op het dier met de gebogen naald naar beneden.Gebruik de bal van de naald om voorzichtig haak een binnenhoek van de mond en vooraf de naald langs de zijkant van de mond naar de achterkant van de keel, dan verplaats de naald naar het midden. Zodra de bal van de naald is aan de achterkant van de keel van het dier, kantel de naald omhoog, zodat het parallel is met het lichaam van het dier lijn en laat het soepel glijden in de keel. Als de naald niet soepel door de keel schuift, kan de naald niet goed worden geplaatst en moet deze worden teruggetrokken om het opnieuw te positioneren en opnieuw te proberen.Laat de naald soepel vooruit, zodat het dier de naald kan doorslikken tot slechts een paar millimeter zichtbaar blijft. Test dat de bal van de naald in de maag zit door de zuiger voorzichtig vooruit te gaan en als er geen weerstand is, blijf het entmateriaal leveren. Trek de naald langzaam terug zodra het entmateriaal is toegediend en plaats het dier in zijn kooi.Blijf het dier gedurende vijf tot 10 minuten in de gaten houden voor tekenen van moeizame ademhaling of nood en controleer of het de normale activiteit kort na de gavage hervat. Als hetzelfde entmateriaal zal worden gebruikt voor het volgende dier, maak de naald schoon met een alcoholdoek. Als een ander entmateriaal zal worden gebruikt, vervang de naald.Gebruik stompe tangen om een deel van de buikhuid te knijpen en de huid en de onderliggende fascia in de buurt van de basis van het bekken te knijpen met behulp van een schaar. Breid de incisie in een U-vorm langs elke kant van de buikholte en tot aan de ribbenkast, dan til de huid uit de weg. Gebruik stompe tangen om het cecum voorzichtig uit de buikholte te halen met behulp van een schaar om de verbindingen tussen het cecum en de dunne en dikke darmen te verbreken.Plaats het hele cecum in een histologie cassette, zodat het is untwisted en legt plat. Leg de tweede schuimkussen op de bovenkant en sluit de cassette. Plaats de cassette vervolgens in een schroefdop pot met methacarn.Het gedeelte van de dikke darmen dat één tot twee fecale pellets bevat en een lengte minder heeft dan die van de cassette. Plaats het weefsel in de cassette houden het plat en untwisted. Overlay het met de tweede schuimpad, sluit de cassette en plaats het in de methacarn.Voor elke sectie van de dunne darm te bemonsteren, accijns een een tot twee centimeter segment dat wat spijsverteringsmateriaal bevatten. Plaats het weefsel in de cassette, overlay met de tweede schuimpad, sluit de cassette en zet het in de methacarn. Bij het uitsnijden van de maag, verbreken de verbindingen met de slokdarm en de dunne darmen.Plaats het weefsel in de cassette en plaats de cassette in de methacarn. Laat de cassettes in de methacarn oplossing op kamertemperatuur gedurende ten minste drie uur, maar minder dan twee weken. Verwijder na fixatie de schuimkussens en breng elke intacte weefselsectie terug in de cassette.Was vervolgens de weefsels twee keer gedurende 35 minuten in 100% methanol, twee keer gedurende 25 minuten in 100% ethanol en twee keer gedurende 20 minuten in xyleen. Dep de cassettes droog op een papieren handdoek en leg ze twee uur in een voorgesmolten paraffinewas in een hybridisatieoven. Verwijder vervolgens de cassettes uit de was, laat de overtollige was uitlekken en bewaar ze op kamertemperatuur totdat ze zijn ingebed in wasblokken.De-wax de paraffine ingebed histologische secties door het invoegen van de dia's in een voorverwarmde pot gevuld met xyleen. Laat de pot op 60 graden Celsius gedurende 10 minuten, gooi de xylene wassen. Giet verse kamertemperatuur xyleen in de pot en herhaal de incubatie.Vul vervolgens de pot met 100% ethanol en broed het vijf minuten op kamertemperatuur. Verwijder na de incubatie de glijbanen uit de pot en droog ze aan de lucht. Om de C.albicans te bevlekken met een vissonde, begin met het tekenen van een cirkel rond de weefselsectie met behulp van een Pat Pen.Pipette 50 microliters van sonde met hybridisatieoplossing op het vaste weefsel en verdeel het voorzichtig met de pipetpunt. Overlay de vloeistof met een hybridisatie coverslip ervoor te zorgen dat bellen te voorkomen. Sluit vervolgens de glijbanen af in een waterdichte hybridisatiekamer en ontcubeer de secties drie uur bij 50 graden Celsius in een hybridisatieoven in het donker.Voeg na de incubatie de wasoplossing toe aan een Coplin-pot. Verwijder voorzichtig de hoezenplaat van de glijbaan met tangen en plaats de glijbaan in de wasoplossing. Bedek de pot met aluminiumfolie en broed het 20 minuten op 50 graden Celsius.Was vervolgens de glijbanen door de wasoplossing af te gieten en de pot bij te vullen met PBS. Giet onmiddellijk af en vul met verse PBS herhalen van het proces voor een totaal van twee wasbeurten. Wick weg de PBS met een delicate taak vegen en cirkel de darmweefsel sectie met een Pat Pen.Plaats de glijbanen in een ondoorzichtige plastic container en voeg 50 microliters mucin nuclei kleuring oplossing aan het weefsel sectie. Bedek de container met aluminiumfolie en broed het 45 minuten op vier graden Celsius. Na de incubatie, zet de dia's in een Coplin pot en was ze twee keer met PBS.Tik weg de overtollige PBS op een papieren handdoek en vervolgenswick weg de laatste druppels met een weefsel. Plaats een druppel montagemedium op elke sectie en overlay het met een glazen coverslip ervoor te zorgen dat bubbels te voorkomen. Laat het montagemedium onder de gehele coverslip uitspreiden.Veranker de coverslip op zijn plaats met nagellak op de hoeken en beeld de dia's met behulp van een fluorescerende microscoop. Dit protocol kan worden gebruikt om fluorescerend C.albicans in vitro en in gastheerweefsels te etiketteren. In vitro gepropageerde hyphae, ronde gistcellen, darmcellen en ondoorzichtige cellen werden vastgesteld, permeabiliseerd, en onderscheiden met fluorescentie en fase contrast microscopie.Ronde gisten en zeer langwerpige hyphae werden afgebeeld in de dikke darmen van de muis. Gastheer weefsels werden gekleurd met de C.albicans specifieke sonde of de panfungal sonde. C.albicans werd aangeduid als rood, gastheer cel kernen blauw, en het slijm laag groen.C.albicans werd gedetecteerd in verschillende segmenten van de murine GI-darmkanaal, waaronder de regio's die direct grenzen aan het gastheerslijmvlies en meer centrale gebieden van het darmlumen. Voor wetenschappers die niet eerder hebben uitgevoerd de gavage techniek, is het belangrijk om gespecialiseerde training te verkrijgen voordat u probeert deze methode. Na visvlekken kunnen immunofluorescentietechnieken worden gebruikt om extra kenmerken van het gastheerslijmvlies te bevlekken.Dit kan zorgen voor karakterisering van weefselschade of immuunreacties van de gastheer. Deze techniek heeft ons in staat gesteld om de relatie tussen schimmelcelmorfologie van Candida albicans mutanten karakteriseren en overleven binnen de gastheer het bevorderen van ons begrip van Candida albicans biologie die kan worden benut bij de ontwikkeling van therapieën.

visualization-candida-albicans-murine-gastrointestinal-tract-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De snelle ontwikkeling, de kleine oppervlakte en de transparantie van de zebravis zijn enorme voordelen voor de studie van aangeboren immuunsysteem controle op...

Niet-invasieve beeldvorming van gedissemineerde candidiasis in de zebravis Larven

Source: Ng, K. M., Tropini, C. Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) to stain gut microbiota within mouse intestinal tissue by hybridizing fluorescent probes to bacterial rRNA (ribosomal ribonucleic acid) and counterstaining the host structures for microscopic analysis.

Fluorescence In Situ Hybridization of Gut Bacteria in Mouse Intestinal Sections

This video demonstrates the development of an in vivo mouse model to study the biofilm formation of Candida albicans in subcutaneous tissue. The experiment involves implanting Candida-infected devices in the animal's back region for biofilm development.

Candida albicans Biofilm Formation in an In Vivo Mouse Model

We presenteren een experimentele procedure van Candida albicans biofilmontwikkeling in een muis subcutaan model. Schimmelbiofilms werden gekwantificeerd door het bepalen van het aantal kleurvormende eenheden en door niet-invasieve bioluminescentie-beeldvorming, waarbij de hoeveelheid geproduceerd licht overeenkomt met het aantal levensvatbare cellen.

Candida albicans biofilm ontwikkeling op medisch-relevante vreemde lichamen in een muis Subcutane Model Gevolgd door bioluminescentiebeeldvorming

Hier beschrijven we een microscoopgebaseerde techniek om de vroege cascades van gebeurtenissen tijdens fagocytose van pathogenen zoals de schimmels Candida albicans en deeltjes die groter zijn dan 0,5 µm, waaronder zymosan en IgG-gecoate kralen, te visualiseren en te kwantificeren.

Het visualiseren van de vroege stadia van Phagocytosis

Om de interne kenmerken van Candida albicans biofilms te bekijken en te kwantificeren, bereiden we vaste intacte exemplaren voor die worden verduidelijkt door refractieve indexmatching. Vervolgens kan optische sectioning microscopie worden gebruikt om driedimensionale beeldgegevens te verkrijgen, hoewel de volledige dikte van de biofilm.

Verduidelijken en beeldvorming Candida albicans Biofilms

De ex vivo test beschreven in deze studie met behulp van gut homogenaat extracten en immunofluorescentie kleuring vertegenwoordigt een nieuwe methode om de hyphal morfogenese van Candida albicans in de GI-darmkanaal te onderzoeken. Deze methode kan worden gebruikt om de milieusignalen te onderzoeken die morfogenetische overgang in de darm regelen.

Een Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in het maag-darmkanaal

Dit gestroomlijnde protocol beschrijft een workflow om bacteriën in complexe weefselmonsters te detecteren en in beeld te brengen, van het fixeren van het weefsel tot het kleuren van microben met fluorescerende in situ hybridisatie.

Visualisatie van darmmicrobiota-gastheerinteracties via fluorescentie in situ hybridisatie, lectinekleuring en beeldvorming

Intestinale microben, waaronder extracellulaire bacteriën en intracellulaire pathogenen zoals het Orsay-virus en microsporidia (schimmels), worden vaak geassocieerd met wilde Caenorhabditis-nematoden . Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren en kwantificeren van microben die C. elegans-nematoden koloniseren en / of infecteren, en voor het meten van de pathogenenbelasting na gecontroleerde infecties in het laboratorium.

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren

Dit manuscript beschrijft een methode voor het screenen van middelgrote Candida albicans mutante bibliotheken op morfogenese fenotypes tijdens actieve infectie in een zoogdier gastheer met behulp van niet-invasieve confocale microscopie.

Gebruik van in vivo beeldvorming om te screenen op morfogenese fenotypes in Candida albicans mutante stammen tijdens actieve infectie bij een zoogdiergastheer

We stellen een muismodel op van C.albicans-geassocieerde kathetergerelateerde infectie (CRI), waarbij biofilm zich vormt op de katheter, en de interactie tussen C.albicans en gastheer goed correleert met de klinische CRI. Dit model helpt bij het screenen van therapieën voor C.albicans biofilm-geassocieerde CRI, waarmee een basis wordt gelegd voor klinische transformatie.

Een kathetergerelateerd Candida albicans-infectiemodel bij muizen

Leer Candida albicans visualiseren in de gastro-intestinale tractus van muizen met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie. Deze methode onthult morfologie en lokalisatie van de schimmel in zijn natuurlijke omgeving.

Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

Meer video's verkennen