Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

Dit protocol heeft een aantal van de beste inzichten die we tot nu toe hebben opgeleverd in hoe Candida albicans het zoogdierarmkanaal bewoont. Bijvoorbeeld, tot voor kort, we wisten niet echt waar Candida is gelokaliseerd in de darm of welke van de vele morfologische vormen het aanneemt binnen deze niche. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om Candida te visualiseren in zijn natuurlijke omgeving zonder het verstoren van de driedimensionale interacties van de schimmel heeft met gastheer structuren of met bacteriën in de microbiota.

Omdat de darm een complexe omgeving is, is het erg moeilijk om te modelleren in het laboratorium en daarom is het zeer bevredigend om een manier te vinden om Candida biologie direct in een hostmodel te onderzoeken. Bepaalde componenten van de darmmicrobiota, waaronder Candida albicans, worden verdacht van een rol bij ziekten zoals inflammatoire darmziekten. Deze techniek kan mogelijk worden gebruikt om de aanwezigheid van specifieke micro-organismen in biopsiemonsters verkregen van patiënten te diagnosticeren.

Beheersing van de gavage techniek en het vermogen om gastro-intestinale segmenten te ontleden zonder de organen te scheuren is belangrijk voor het verkrijgen van optimale resultaten. Om te beginnen, gavage elk dier met het berekende volume van een bepaald entmateriaal. Bevestig een autoclaved dier voederen naald aan een een milliliter spuit en vul de spuit met een gavage volume ervoor te zorgen dat alle bellen te verwijderen.

Plaats de spuit op een steriel oppervlak. Om het dier te beveiligen, houdt u het aan de voet van de staart met de dominante hand en schuift u de niet-dominante hand de rug van het dier naar de losse huid net achter de oren. Verzamel de scruff stevig bij elkaar met de duim en wijsvinger.

Raap het dier op bij de scruff, draai het om en loop de kleine vinger van dezelfde hand rond de staart om het dier tegen de palm van de hand te immobiliseren. Strek het hoofd van het dier voorzichtig uit, zodat het in een rechte lijn met het lichaam. Pak vervolgens de spuit met de dominante hand en houd hem loodrecht op het dier met de gebogen naald naar beneden.

Gebruik de bal van de naald om voorzichtig haak een binnenhoek van de mond en vooraf de naald langs de zijkant van de mond naar de achterkant van de keel, dan verplaats de naald naar het midden. Zodra de bal van de naald is aan de achterkant van de keel van het dier, kantel de naald omhoog, zodat het parallel is met het lichaam van het dier lijn en laat het soepel glijden in de keel. Als de naald niet soepel door de keel schuift, kan de naald niet goed worden geplaatst en moet deze worden teruggetrokken om het opnieuw te positioneren en opnieuw te proberen.

Laat de naald soepel vooruit, zodat het dier de naald kan doorslikken tot slechts een paar millimeter zichtbaar blijft. Test dat de bal van de naald in de maag zit door de zuiger voorzichtig vooruit te gaan en als er geen weerstand is, blijf het entmateriaal leveren. Trek de naald langzaam terug zodra het entmateriaal is toegediend en plaats het dier in zijn kooi.

Blijf het dier gedurende vijf tot 10 minuten in de gaten houden voor tekenen van moeizame ademhaling of nood en controleer of het de normale activiteit kort na de gavage hervat. Als hetzelfde entmateriaal zal worden gebruikt voor het volgende dier, maak de naald schoon met een alcoholdoek. Als een ander entmateriaal zal worden gebruikt, vervang de naald.

Gebruik stompe tangen om een deel van de buikhuid te knijpen en de huid en de onderliggende fascia in de buurt van de basis van het bekken te knijpen met behulp van een schaar. Breid de incisie in een U-vorm langs elke kant van de buikholte en tot aan de ribbenkast, dan til de huid uit de weg. Gebruik stompe tangen om het cecum voorzichtig uit de buikholte te halen met behulp van een schaar om de verbindingen tussen het cecum en de dunne en dikke darmen te verbreken.

Plaats het hele cecum in een histologie cassette, zodat het is untwisted en legt plat. Leg de tweede schuimkussen op de bovenkant en sluit de cassette. Plaats de cassette vervolgens in een schroefdop pot met methacarn.

Het gedeelte van de dikke darmen dat één tot twee fecale pellets bevat en een lengte minder heeft dan die van de cassette. Plaats het weefsel in de cassette houden het plat en untwisted. Overlay het met de tweede schuimpad, sluit de cassette en plaats het in de methacarn.

Voor elke sectie van de dunne darm te bemonsteren, accijns een een tot twee centimeter segment dat wat spijsverteringsmateriaal bevatten. Plaats het weefsel in de cassette, overlay met de tweede schuimpad, sluit de cassette en zet het in de methacarn. Bij het uitsnijden van de maag, verbreken de verbindingen met de slokdarm en de dunne darmen.

Plaats het weefsel in de cassette en plaats de cassette in de methacarn. Laat de cassettes in de methacarn oplossing op kamertemperatuur gedurende ten minste drie uur, maar minder dan twee weken. Verwijder na fixatie de schuimkussens en breng elke intacte weefselsectie terug in de cassette.

Was vervolgens de weefsels twee keer gedurende 35 minuten in 100% methanol, twee keer gedurende 25 minuten in 100% ethanol en twee keer gedurende 20 minuten in xyleen. Dep de cassettes droog op een papieren handdoek en leg ze twee uur in een voorgesmolten paraffinewas in een hybridisatieoven. Verwijder vervolgens de cassettes uit de was, laat de overtollige was uitlekken en bewaar ze op kamertemperatuur totdat ze zijn ingebed in wasblokken.

De-wax de paraffine ingebed histologische secties door het invoegen van de dia's in een voorverwarmde pot gevuld met xyleen. Laat de pot op 60 graden Celsius gedurende 10 minuten, gooi de xylene wassen. Giet verse kamertemperatuur xyleen in de pot en herhaal de incubatie.

Vul vervolgens de pot met 100% ethanol en broed het vijf minuten op kamertemperatuur. Verwijder na de incubatie de glijbanen uit de pot en droog ze aan de lucht. Om de C.albicans te bevlekken met een vissonde, begin met het tekenen van een cirkel rond de weefselsectie met behulp van een Pat Pen.

Pipette 50 microliters van sonde met hybridisatieoplossing op het vaste weefsel en verdeel het voorzichtig met de pipetpunt. Overlay de vloeistof met een hybridisatie coverslip ervoor te zorgen dat bellen te voorkomen. Sluit vervolgens de glijbanen af in een waterdichte hybridisatiekamer en ontcubeer de secties drie uur bij 50 graden Celsius in een hybridisatieoven in het donker.

Voeg na de incubatie de wasoplossing toe aan een Coplin-pot. Verwijder voorzichtig de hoezenplaat van de glijbaan met tangen en plaats de glijbaan in de wasoplossing. Bedek de pot met aluminiumfolie en broed het 20 minuten op 50 graden Celsius.

Was vervolgens de glijbanen door de wasoplossing af te gieten en de pot bij te vullen met PBS. Giet onmiddellijk af en vul met verse PBS herhalen van het proces voor een totaal van twee wasbeurten. Wick weg de PBS met een delicate taak vegen en cirkel de darmweefsel sectie met een Pat Pen.

Plaats de glijbanen in een ondoorzichtige plastic container en voeg 50 microliters mucin nuclei kleuring oplossing aan het weefsel sectie. Bedek de container met aluminiumfolie en broed het 45 minuten op vier graden Celsius. Na de incubatie, zet de dia's in een Coplin pot en was ze twee keer met PBS.

Tik weg de overtollige PBS op een papieren handdoek en vervolgenswick weg de laatste druppels met een weefsel. Plaats een druppel montagemedium op elke sectie en overlay het met een glazen coverslip ervoor te zorgen dat bubbels te voorkomen. Laat het montagemedium onder de gehele coverslip uitspreiden.

Veranker de coverslip op zijn plaats met nagellak op de hoeken en beeld de dia's met behulp van een fluorescerende microscoop. Dit protocol kan worden gebruikt om fluorescerend C.albicans in vitro en in gastheerweefsels te etiketteren. In vitro gepropageerde hyphae, ronde gistcellen, darmcellen en ondoorzichtige cellen werden vastgesteld, permeabiliseerd, en onderscheiden met fluorescentie en fase contrast microscopie.

Ronde gisten en zeer langwerpige hyphae werden afgebeeld in de dikke darmen van de muis. Gastheer weefsels werden gekleurd met de C.albicans specifieke sonde of de panfungal sonde. C.albicans werd aangeduid als rood, gastheer cel kernen blauw, en het slijm laag groen.

C.albicans werd gedetecteerd in verschillende segmenten van de murine GI-darmkanaal, waaronder de regio's die direct grenzen aan het gastheerslijmvlies en meer centrale gebieden van het darmlumen. Voor wetenschappers die niet eerder hebben uitgevoerd de gavage techniek, is het belangrijk om gespecialiseerde training te verkrijgen voordat u probeert deze methode. Na visvlekken kunnen immunofluorescentietechnieken worden gebruikt om extra kenmerken van het gastheerslijmvlies te bevlekken.

Dit kan zorgen voor karakterisering van weefselschade of immuunreacties van de gastheer. Deze techniek heeft ons in staat gesteld om de relatie tussen schimmelcelmorfologie van Candida albicans mutanten karakteriseren en overleven binnen de gastheer het bevorderen van ons begrip van Candida albicans biologie die kan worden benut bij de ontwikkeling van therapieën.