Time-lapse Live beeldvorming en kwantificering van snelle dendritische tak dynamiek bij de ontwikkeling van Drosophila neuronen

Dit protocol biedt een nieuwe aanpak voor het kwantificeren van de tak dynamiek van de dendritische prieel en het ontwikkelen van neuronen met behulp van live time lapse imaging en een 3D-beeld annotatie software. Deze techniek beeldt en volgt de takterminals die een snelle en efficiënte methode bieden voor het meten van het dynamische gedrag van dendritische filopodia. Onderzoek met behulp van deze methode geeft inzicht in het begrijpen van hoe ontwikkeling en activiteit dendriet morfogenese reguleren.

Onze methoden zijn van toepassing op schaars gelabelde neuronen in zowel in vitro als in vivo settings. Houd er bij het uitvoeren van deze procedure rekening mee dat de beeldparameters zorgvuldig moeten worden aangepast om een voldoende temporele en ruimtelijke resolutie te bereiken. Om hersenen te oogsten van larve drosophila, onder een ontleden microscoop gebruik maken van een paar van nummer vijf standaard tip dissectie forcept om een larvenexemplaar op zijn plaats te houden, terwijl het gebruik van de andere om zorgvuldig ontleden van de hersenen, het behoud van de oogschijven, hersenklobben, en ventrale zenuwstreng.

Verwijder vervolgens de bijgevoegde spieren om elke beweging van het monster tijdens de beeldvorming te minimaliseren. Wanneer alle hersenen zijn geoogst, gebruik vacuüm vet om een vierkante kamer te trekken op een glazen glijbaan en voeg 20 microliters van externe zoutoplossing aan de kamer. Gebruik de tangen om de hersenen over te brengen naar de kamer en de posities van de hersenen onder de microscoop aan te passen met de rugkanten naar boven gericht.

Bedek de kamer met een glazen afdekbrief en druk zachtjes op de afdekslip om monsterdring tijdens de beeldvormingsprocedure te verminderen. Om hersenexplants te identificeren die individueel gelabelde neuronen bevatten, selecteert u binnen 30 minuten na de dissectie een 40X wateronderdompelingsdoelstelling en een epifluorescentielichtbron. Selecteer een twee fotonlaser van 920 nanometer en een niet-Dscan-detector en stel de beeldvormingsparameters in om de beelden te verzamelen op 512 bij 512 pixels per frame en één minuut per Z-stack gedurende 10 minuten.

Pas vervolgens de optische en digitale zoom aan om een voldoende X- Y- en Z-resolutie te bereiken en tegelijkertijd de dekking van de hele dendritische prieel binnen een minuut te garanderen. De instellingen genereren afbeeldingen met een typische X, Y, Z-resolutie van 0,11 bij 0,11 bij 0,25 micrometer. Open voor driftcorrectie het interessebestand in een geschikt driftcorrectiesoftwareprogramma en klik op Microscopische parameters bewerken en bewerken.

Stel het microscooptype in op Breed veld voor de twee fotonafbeeldingen als er een optie voor twee foton is en volg de workflow die door de software is gedefinieerd. Open voor deconvolution het afgekoppelde beeld in de deconvolution-software en volg de workflow. Sla vervolgens de gedeconvolveerde afbeelding op in een bestandstype dat wordt ondersteund door de daaropvolgende beeldannotatiesoftware die 4D-gegevens kan analyseren en de ruimtelijke coördinaten van gedefinieerde vlekken in de afbeelding kan rapporteren.

Open voor beeldannotatie de gedeconvolveerde afbeelding in de beeldannotatiesoftware en onderzoekt en markeer de branchtips op alle tijdstippen in 3D. De beeldannotatiesoftware rapporteert en slaat de ruimtelijke en temporele coördinaten van de gemarkeerde vertakkingstips op. Exporteer de coördinatengegevens als een CSV-bestand voor latere berekeningen.

Klik in de module Vlekken op Automatisch maken overslaan, Handmatig bewerken en schakel het selectievakje Automatisch verbinden met Geselecteerde steunpoten in. Controleer de frames in de tijdreeks en selecteer een vertakking voor annotatie. Houd shift-toets, klik op de tip van de filiaalterminal om een plek toe te voegen.

Klik vervolgens op het tabblad Statistieken en selecteer Gedetailleerde, specifieke waarden en positie. De opgenomen ruimtelijke en temporele coördinateninformatie wordt weergegeven. Klik op Opslaan om de gegevens als CSV-bestand te exporteren.

Als u de plaatsing van de vertakkingstip in 3D wilt berekenen, opent u het CSV-bestand als spreadsheet en selecteert u de kolom Track ID. Klik op Kleinste sorteren naar grootste en accepteer De selectie uitbreiden. Na het sorteren identificeert Track ID elke unieke dendritische tak en delen de spots van dezelfde branch dezelfde Track ID.The Time-kolom slaat de informatie op uit verschillende tijdsframes.

Voeg in de spreadsheet een kolom Afstand toe en gebruik de coördinaten om de afstand van elke twee tijdelijk aangrenzende plekken te berekenen. Als u kleine bewegingen op het niveau van één voxel wilt meten, stelt u alle afstandswaarden van minder dan 0,3 micrometer opnieuw in om ongecorrigeerde drifting of onvolmaakte beeldannotatie te filteren. Maak vervolgens een kolom Verplaatsing en kopieer de waarden van de kolom Afstand naar de kolom Verplaatsing.

Wijs handmatig de extensie- en intrekgebeurtenissen voor elke vertakkingspunt toe. Als het een uitbreiding is, laat u de positieve verplaatsingswaarde ongewijzigd. Als het een intrekking is, wijzigt u de overeenkomstige verplaatsingswaarde in een negatieve waarde.

Som vervolgens in een nieuwe kolom Gebeurtenis de verplaatsingswaarden op voor afzonderlijke extensie- en intrekgebeurtenissen. In deze video kan een maximale intensiteit geprojecteerde beeldreeks verzameld van een vertegenwoordiger individueel gelabeld ventrale laterale neuron worden waargenomen. Afbeeldingen met één frame maken evaluatie van de gebeurtenissen voor intrekking en uitbreiding mogelijk.

Semigeautomateerde 4D tracking van de branch terminals maakt annotatie van de dynamische tak terminals van individueel gelabelde ventrale laterale neuronen zoals aangetoond. Berekening van de richting en afstand van de tak bewegingen op elk tijdstip punt maakt een vergelijking van de dendritische tak dynamiek voor individueel gelabelde ventrale laterale neuronen in verschillende ontwikkelingsstadia. De belangrijkste stap is het behoud van de integriteit van het hersenweefsel en dendriet morfoloy tijdens dissectie en montage.

De ruwe beeldreeks kwaliteit is ook van cruciaal belang voor succesvolle tracking en kwantificering. Met behulp van deze techniek kregen we de mogelijkheid om kwantitatieve analyse van dendriet filopodia uit te voeren bij de ontwikkeling van drosophila centrale neuronen en om de moleculaire machines met betrekking tot dendriten rijping en synaptogenese te verkennen.