In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

Deze techniek vergemakkelijkt de observatie in real time van synaptische calciumactiviteit als fysiologische parameter voor de cellulaire processen die ten grondslag liggen aan leren en geheugenvorming in drosophila melanogaster. Door neuronale reacties op geuren voor en na associatieve training te vergelijken, kunnen we directe correlaties trekken tussen synaptische activiteit en de vorming van het geheugenspoor bij individuele fruitvliegjes. Voor de productie van transgene fruitvliegjes waarin specifieke neuronen van belang uitdrukken een genetisch gecodeerde calcium indicator kruis vrouw-maagd en mannelijke vliegen die de gewenste GAL4 en UAS constructies, en leeftijd van de vrouwelijke nakomelingen tot drie tot zes dagen na de sluiting.

Om een vlieg voor te bereiden op beeldvorming, gebruik maken van fijne tangen om een ijs verdoofd vliegen plaats in een aangepaste voorbereide beeldvorming kamer. Met behulp van een ontledenmicroscoop om de thorax en benen in contact te brengen met de elektrische draden aan de onderkant van de kamer, en met het hoofd plat liggen. Bevestig de vlieg op zijn plaats met duidelijke plakband, en gebruik een chirurgische scalpel mes om een raam in de tape rond het hoofd te snijden, waardoor de antenne bedekt en alleen de voorste meeste deel van de thorax blootgesteld.

Gebruik een insectenspeld die door concave-convexe kaken wordt vastgehouden om de zijkanten en achterkant van het hoofd zorgvuldig te omringen met blauw licht uithardingslijm. En gebruik een blauw licht uitzendende LED-lamp om de lijm in te stellen. Wanneer de lijm volledig is ingesteld, moet u alle resterende ongeharde lijm van het dorsale oppervlak van de vliegkop wissen en de blootgestelde cuticula van het hoofd bedekken met een druppel oplossing van Ringer.

Met behulp van een zeer fijnbladig steekmes, dwars door de cuticula over het achterste van het hoofd, te beginnen bij de ocelli en het snijden van elke kant mediaal aan de ogen om een flap van de cuticula die gemakkelijk kan worden afgescheurd met behulp van tangen te vormen. Verwijder elke overtollige cuticula die het hersengebied van belang kan blokkeren en gebruik fijne tangen om het rugoppervlak van een luchtpijp zorgvuldig te verwijderen, waarbij u ervoor zorgt dat verstoring van het hersenweefsel zelf wordt voorkomen. Verwijder en vernieuw de oplossing van de Ringer indien nodig om het gebied van weefselresten te verwijderen.

En plaats een injectienaald van hypodermische geur op ongeveer een centimeter van het hoofd van de vlieg, waarbij u ervoor zorgt dat er niets is dat de geurtoevoer naar de antenne kan belemmeren. Sluit vervolgens de beeldkamer aan op het geurtoevoersysteem via de injectienaald van de hypodermische geur. En laat de vlieg 10 minuten om te herstellen van de anesthesie en chirurgie.

Voor visualisatie van de GFP gebaseerde calcium indicatoren, tune de laser van een multi-foton microscoop uitgerust met een infrarood laser en een water onderdompeling doelstelling geïnstalleerd op een trilling geïsoleerde tafel om een excitatie golflengte van 920 nanometer en installeer een GFP bandpass filter. Met behulp van de cursus Z aanpassing knop, scannen door de Z-as van de hersenen om de hersenen gebied van belang te lokaliseren. Gebruik de bijsnijdfunctie om het scannen alleen op het interessegebied te richten, om de scantijd te minimaliseren.

En draai de scan weergave zodanig dat de voorste van het hoofd naar beneden wordt gericht. Pas vervolgens de framegrootte aan op 512 bij 512 pixels en selecteer het gebied dat moet worden gescand. Rekening houdend met de berekende scantijd voor elk frame, om een framesnelheid van ten minste vier hertz te bereiken.

Voor geur-opgeroepen calcium voorbijgaande visualisatie, initiëren van een voorgeprogrammeerde macro-pakket in staat van het koppelen van de beeldverwerving software en de geur levering programma en beginnen met de meting in de microscoop software voor 6,25 seconden om een F0 baseline waarde vast te stellen. In de geur levering systeem, leveren een 2,5 seconden geur stimulus hier aangegeven door verlichting van LED's geactiveerd door het openen en sluiten van specifieke geur beker kleppen. Gevolgd door 12,5 seconden van de opname aan het einde van geur offset.

Herhaal vervolgens de levering voor een tweede en derde geurstof op dezelfde manier. Om associatieve conditionering uit te voeren in deze setup, gebruik maken van de computer gecontroleerde geur levering systeem om de geconditioneerde stimulus-plus-geur presenteren voor 60 seconden naast 12 90 volt elektrische schokken. Na een pauze van 60 seconden presenteren de geconditioneerde stimulus-minus-geur alleen voor 60 seconden zonder elektrische schok.

Meet de post training geur opgeroepen calcium vergankelijkheid opnieuw door het herhalen van de pre training geur stimulatie protocol drie minuten na het beëindigen van de trainingsfase. Sla vervolgens de beeldvormende bestanden op in een geschikte indeling voor latere beeldanalyse. Hier representatieve paddestoel lichaam output neuron beelden, verworven zoals aangetoond kan worden waargenomen.

De specifieke gecompartimenteerde expressie van de dHomer-GCaMP3 sensor, die niet wordt uitgedrukt in de axonnale compartimenten van het neuron, toont een onderbroken signaal in het dendritische compartiment. Duidelijk hoewel lagere amplitude geur reacties kunnen worden waargenomen bij vliegen uitdrukken dHomer-GCaMp3, in vergelijking met vliegen uitdrukken cytosolic GCaMP6f. Hier, representatieve calcium sporen van een individuele vlieg toont verschillen in het geluidsniveau en amplitude die kunnen worden verkregen tussen individuele preparaten.

Deze techniek heeft de mogelijkheid geopend om te visualiseren op subcellulair niveau, hoe reukvoorstellingen worden gemoduleerd en hoe geheugenfasen worden gevormd door conditionering. Dergelijke experimenten zullen van vitaal belang zijn om ons begrip van complexe hersenstructuren zoals het paddenstoellichaam uit te breiden en om te karakteriseren hoe associatieve herinneringen worden opgeslagen over gedistribueerde populaties van neuronen.