Name: Betrouwbare isolatie van micro vaten van het centrale zenuwstelsel in vijf gewervelde groepen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor microvat-isolatie uit het centrale zenuwstelsel bij vijf gewervelde groepen. Deze techniek vereist geen ultracentrifugatie en kan binnen één dag worden voltooid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Cruz-Orengo werd gesteund door de Universiteit van Californië, Davis, de school van de veterinaire geneeskunde start up fondsen.

Alle procedures van de huidige studie zijn in overeenstemming met de richtlijnen die zijn vastgesteld door de Universiteit van Californië (UC), Davis institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC). Animal Care bij UC Davis wordt gereguleerd door verschillende onafhankelijke bronnen en is volledig geaccrediteerd door de vereniging voor beoordeling en accreditatie van Laboratory Animal Care International (AAALAC) sinds 1966. De weefsels van varkens CNS werden verkregen van het UCD-departement van Dierwetenschappen, het laboratorium voor vlees wetenschappen. CNS weefsels van rhesus makaken werden verkregen van de California National Primate Research Center pathologie Department (NIH P51OD011107). Er werd geen verdoving, euthanasie of obductie uitgevoerd door laboratoriummedewerkers op varkens en makachtigen. Daarom zijn er geen specifieke aanbevelingen met betrekking tot deze kwesties.
Opmerking: deze methode is gevalideerd voor meerdere soorten, maar het opgegeven protocol komt meer rechtstreeks overeen met muizen en varkens weefsels. Details met betrekking tot de optiek kwab zijn niet van toepassing bij gebruik van zoogdier monsters. Alle biogevaarlijke materialen moeten worden behandeld in een passende faciliteit voor bioveiligheidsniveau (BSL). Alle acuut giftige materialen moeten worden behandeld onder een rook afzuigkap. Alle biologisch gevaarlijke medische afvalstoffen en acuut giftig afval moeten naar behoren worden afgevoerd.
1. voorbereiding
<ol><li>Bereid oplossingen (tabel 1) ten minste één dag vooruit. Opmerking: het is zeer moeilijk om 70 kDa molecuulgewicht (MW) dextran op te lossen. Het is efficiënter om de oplossing 's nachts te laten roeren met een paraffine film of folie. Het protocol vereist het gebruik van twee verschillende MV-2-oplossingen, afhankelijk van het onderzochte model. De 18% dextran scheidt de myeline efficiënt van de microvat pellet bij het uitvoeren van het protocol op kleine lissencefische specimens. Echter, het ontwikkelt een uitstrijkje van myeline binnen de interface van CNS weefsels van grote gyrencephalic specimens, evenals de hypothalamus en de hypofyse uit kleine specimens. Dit uitstrijkje wordt voorkomen door 20% dextran te gebruiken.</li>
	<li>Maak goed dia's door het laden van 50 μL per put van poly-D-Lysine en laat drogen voor 2 h bij kamertemperatuur (RT), bij voorkeur in een biologische veiligheidskast-klasse 2 (BSC-2). Niet overdrogen. Spoel tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar in de koelkast tot het klaar is voor gebruik.</li>
</ol>2. CNS weefsel dissectie van kleine Lissencephalic gewervelde specimen
Opmerking: het artikel toont de toepassing van het protocol op een C57BL6/J, 10 week-oud, ~ 25 g, mannelijke muis.
<ol><li>Bereid de conische buizen van 2 15 mL en een micro centrifugebuis van 1,7 mL met respectievelijk 5 mL en 1 mL van de MV-1 oplossing per preparaat. Houd tubes op ijs.</li>
	<li>Esthetisering<ol>
<li>Anesthetize muizen door intraperitoneale injectie van een ketamine, xylazine, en Acepromazine anestheticum cocktail op 100/10/3 mg per kg lichaamsgewicht en spray met 70% ethanol. Bevestig anesthesie door de afwezigheid van palpebrale en pedaal reflexen te beoordelen door het aanraken van een oog en het knijpen van een voet, respectievelijk.</li>
		<li>Anesthetize duiven door inademing van 5% Isofluraan met behulp van een inductie anesthesie doos.</li>
		<li>Anesthetiseren vis en kikkers in 1% tricaïne in ofwel een vis houden watertank of amfian Ringer-oplossing (tabel van materialen), respectievelijk.</li>
		<li>Anesthetiseer hagedissen door te koelen bij 4 °C voorafgaand aan euthanasie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Onthooi het dier met een chirurgische schaar, Pel de huid weg met een tang om de schedel bloot te leggen en snijd met LaGrange-schaar door het foramen magnum (Figuur 1A).</li>
	<li>Dissteer de hersenen uit met een spatel en breng over naar een conische buis van 15 mL met MV-1-oplossing. Houd Tube op ijs.</li>
	<li>Haal de hypofyse uit de Sella turcica van de schedel met een tang en breng over naar een micro centrifugebuis van 1,7 ml met MV-1-oplossing. Houd Tube op ijs.</li>
	<li>Verwijder de huid en spieren om de wervelkolom bloot te leggen. Knip de ledematen, ribbenkast en inwendige organen uit (Figuur 1B).</li>
	<li>Ontleden het ruggenmerg door een van de twee methoden die hieronder worden beschreven. Breng vervolgens over naar een conische buis van 5 mL met MV-1-oplossing. Houd Tube op ijs.<ol>
<li>Voer laminectomie uit door in een rostrale migratoire naar caudale richting te snijden met LaGrange-schaar, beginnend door het halswervel foramen, totdat het lumbale koord wordt bereikt.</li>
		<li>Voer doorspoelen in een caudal tot rostrale richting door de lumbale Vertebrale foramen met een 18 G naald en 10 ml spuit geladen met MV-1 oplossing (Figuur 1C, D). Let op: deze methode werkt alleen met zeer kleine specimens, meestal knaagdieren (< 100 g).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Snijd met behulp van een ontleed bereik de durale zak van het ruggenmerg met veer schaar en verwijder de overgebleven hersenvliezen met een dubbele uitsteken (Figuur 2).</li>
	<li>Breng de hersenen over naar een Petri schaaltje en verwijder met een ontleed bereik de hersenvliezen met een dubbele uitsnede (Figuur 2a – C).</li>
	<li>Accijnzen de olfactorische bollen en thalamus met Tang, Iris schaar, en veer schaar. Gebruik de dubbele-pronged pick, verwijder de vaatvlies plexus uit alle hersenventrikels. Zorg ervoor dat u alle vaatvlies plexus verwijdert. Let op: de vaatvlies plexus en olfactorische bollen vormen een enorme bron van verontreiniging. In tegenstelling tot de BBB, deze capillairen zijn zeer fenestrated en de resultaten van de daaropvolgende experimenten zullen worden aangetast als ze niet worden verwijderd.</li>
	<li>Met behulp van Tang, scheiden de verschillende CNS regio's: cortex, cerebellum, hersenstam, optiek kwal (niet op zoogdieren specimens), en hypothalamus.</li>
</ol>3. CNS weefsel dissectie van een grote Gyrencephalic gewervelde specimen
Opmerking: dit protocol maakt gebruik van varkens CNS weefsels verkregen uit een abattoir. Daarom wordt geen verdoving, euthanasie of obductie beschreven of hier getoond.
<ol><li>Transport van varkens CNS weefsels in een 0,946 L (32 oz) histologie container geladen met MV-1 oplossing in een ijskist/emmer.</li>
	<li>Met behulp van een ontleed bereik, verwijder de hersenvliezen met een dubbele-pronged pick, Tang, Iris schaar, en veer schaar van elk CZS weefsel. Zorg ervoor dat u alle stukjes vaatvlies plexus uit de hersenventrikels verwijdert.</li>
</ol>4. homogenisatie van het CZS-weefsel
Opmerking: het is efficiënter wanneer twee onderzoekers zich bezighouden met het homogenisatie proces: één ontleden van de hersenvliezen onder de stereoscoop en de andere die de fijngehakte weefsels homogeniseren. Op deze manier worden de weefsels snel teruggevoerd naar de ijsemmer en koud gehouden.
<ol><li>Plaats elke CNS regio op een Petri schaaltje met ~ 1 mL MV-1 oplossing. Met behulp van een single-Edge Blade, gehakt het weefsel om 1 – 2 mm stukken te verkrijgen.<ol>
<li>Voor een klein gewervelde specimen, gebruik een 100 mm x 20 mm Petri schaaltje.</li>
		<li>Voor een groot gewervelde specimen, gebruik een 150 mm x 15 mm Petri schaal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogenisatie van een klein gewervelde specimen (tabel 2 en tabel 3)<ol>
<li>Breng de cortex, cerebellum, hersenstam, optische LOB en het ruggenmerg over naar ~ 1 mL MV-1 oplossing in een individuele 10 mL Potter-Elvehjem glas slijpmachine met een PTFE-stamper met behulp van een transfer pipet. Voeg 5 mL MV-1 oplossing toe en homogeniseren elk weefsel (~ 10 slagen). Breng aan op individuele conische buizen van 15 mL. Houd tubes op ijs. Opmerking: voor een kleine gewervelde, 5 of 4, met of zonder optiek, respectievelijk, 10 ml Potter-elvehjem slijpmachines en 15 ml conische buizen zijn nodig.</li>
		<li>Breng de hypothalamus en hypofyse met de Tang naar ~ 100 μL MV-1 oplossing in een individuele 1,7 mL buis en zorgvuldig homogeniseren met een glazen micro stamper. Spoel elke micro stamper af met ~ 1 mL MV-1 oplossing. Houd Tube op ijs. Opmerking: voor een kleine gewervelde zijn 2 glazen micro pestles en 1,7 mL tubes nodig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogenisatie van een groot gewervelde specimen (tabel 4 en tabel 5)<ol>
<li>Gebruik een pipet voor overdracht en breng het fijngehakte weefsel over naar een 55 mL Potter-Elvehjem glas slijpmachine met een PTFE-stamper en Bevestig aan bovengrondse roerder. Voeg de helft van het aanbevolen volume MV-1-oplossing toe, volgens het specifieke CZS-gedeelte (tabel 5).</li>
		<li>Zet de Bovenroerder op zeer lage snelheid (~ 150 rpm) en beweeg de glazen buis voorzichtig op en neer voor ongeveer 30 s.</li>
		<li>Schakel de overhead roerder uit, voeg meer MV-1-oplossing toe en herhaal stap 4.3.2 totdat een homogene slurry wordt verkregen.</li>
		<li>Breng over naar een conische buis van 50 mL. Houd Tube op ijs.</li>
		<li>Was de molen met gedeïoniseerd water tussen de homogenisatie van het CZS-weefsel. Opmerking: voor een groot gewervelde 5 of 4, met of zonder witte stof, respectievelijk, zijn 50 mL conische buizen nodig. Evenzo, twee (2) 15 mL conische buizen zijn nodig voor de hypothalamus en hypofyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. zuivering van micro vaten
<ol><li>Centrifugeer weefsel homogeniteert als gevolg van stap 4.2.1, 4.2.2 of 4.3.4 bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Een grote witte interface van myeline zal op de top van de pellets van de roodachtige micro vaten worden vormgegeven. Gooi de supernatants weg.<ol>
<li>Klein gewervelde specimen (tabel 2 en tabel 3)<ol>
<li>Respendeer de cortex, cerebellum, hersenstam, optische LOB en ruggenmerg pellets in 5 mL ijskoude MV-2-oplossing met een serologische Pipet van 5 mL (~ 10 flushes). Voeg 5 mL ijskoude MV-2-oplossing toe aan elke suspensie en meng zorgvuldig door de buizen te spiegelen.</li>
			<li>Respendeer de hypothalamus en hypofyse pellets met 1 mL MV-2 oplossing.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Groot gewervelde specimen (tabel 4 en tabel 5)<ol>
<li>Voeg 20 mL ijskoude MV-2-oplossing toe aan de cortex, cerebellum, hersenstam en pellets van ruggenmerg microvaten. Resuspendeer de pellets door te mengen op een buis revolver Shaker, roeren bij 40 rpm gedurende ~ 5 min. balanceer de volumes van de conische buizen van de cortex, cerebellum, hersenstam en suspensies van het ruggenmerg door meer MV-2-oplossing toe te voegen.</li>
			<li>Respendeer de hypothalamus en hypofyse-microvat pellets in 5 mL MV-2-oplossing met een serologische Pipet van 5 mL (~ 10 flushes). Voeg 5 mL ijskoude MV-2-oplossing toe aan de suspensies en meng zorgvuldig door de buis te spiegelen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugeer bij 4.400 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de dikke en dichte myeline laag op de vloeistof interface van de wanden van elke buis door de buizen langzaam te roteren en de supernatant langs de wanden te laten passeren.</li>
	<li>Gooi de myeline en vloeibare interface weg en DEP de binnenwand van elke buis met een spatel gewikkeld met een laag-pluis papier doekje. Voor kleine gewervelde specimens, verwijder de myeline laag uit elke hypothalamus en hypofyse buis door voorzichtig te zuigen met een pipet voor overdracht.</li>
	<li>Veeg overtollige vloeistof af met een gedraaid, laag pluis papier doekje. Respendeer elke pellet met 1 mL MV-3 oplossing met behulp van low-binding tips. Houd tubes op ijs.</li>
</ol>6. elutie en filtratie van micro vaten
<ol><li>Giet ijskoude MV-3 oplossing in individuele bekers voor elke CNS-regio. Bewaren bij 4 °C.<ol>
<li>Voor kleine gewervelde specimens, gebruik 10 mL MV-3 oplossing per 50 mL bekerglas. Een totaal van 6 – 7 bekers is noodzakelijk, afhankelijk van of de optiek kwab is opgenomen.</li>
		<li>Voor grote gewervelde specimens, gebruik 30 mL MV-3 oplossing per 100 mL bekerglas. Een totaal van 6 – 7 bekers is nodig, afhankelijk van of witte stof is opgenomen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats een celzeef bovenop een conische buis van 50 mL. Gebruik één per CZS-regio. Gebruik een 100 μm zeef voor de cortex, hersenstam, optiek kwal, ruggenmerg en hypofyse. Gebruik een 70 μm celzeef voor de cerebellum en de hypothalamus.</li>
	<li>Bevochtig elke zeef met 1 mL ijskoude MV-3 oplossing.</li>
	<li>Voeg meer MV-3 oplossing toe aan de suspensies bereid in stap 5,5 met een serologische pipet tijdens het mengen om aggregaten te voorkomen. Micro vaten op de zeef zorgvuldig laden. Spoel af met ijskoude MV-3 oplossing.<ol>
<li>Voeg voor kleine gewervelde specimens (tabel 2 en tabel 3) 10 – 15 ml MV-3-oplossing met een serologische Pipet toe en spoel af met 5 ml MV-3-oplossing.</li>
		<li>Voeg voor grote gewervelde specimens 20 mL MV-3-oplossing toe met een serologische pipet en spoel met 10 mL MV-3 oplossing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monteer de filtratie-eenheid door een nylon netfilter van 20 μm op een gemodificeerde filterhouder (Figuur 2D) te plaatsen, één per CZS-gebied.<ol>
<li>Voor kleine gewervelde specimens (tabel 2 en tabel 3), gebruik 25 mm gemodificeerde filterhouders voor de cortex, cerebellum, hersenstam, optische LOB en het ruggenmerg. Gebruik 13 mm gemodificeerde filterhouders voor de hypothalamus en hypofyse.</li>
		<li>Voor grote gewervelde specimens (tabel 4 en tabel 5), gebruik 47 mm gemodificeerde filterhouders voor de cortex, cerebellum, hersenstam en het ruggenmerg. Gebruik 25 mm voor de hypothalamus en hypofyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats het filter bovenop een conische buis van 50 mL en een natte filter met 5 mL ijskoude MV-3-oplossing, waardoor de filterhouder naar de conische buis stroomt.</li>
	<li>Breng de eluteerde micro vaten (vanaf stap 6,4) bovenop de 20 μm nylon netfilter en spoel de micro vaten af met 5 – 10 mL ijskoude MV-3-oplossing.</li>
	<li>Herstel het filter met behulp van een schone Tang en dompel het in het bekerglas met de ijskoude MV-3 oplossing, bereid in stap 6,1.</li>
	<li>Maak de micro vaten los van het filter door het zachtjes schudden voor ongeveer 30 s. Giet voor kleine gewervelde specimens het bekerglas in een conische buis van 15 mL. Giet voor grote gewervelde specimens het bekerglas in een conische buis van 50 mL.</li>
	<li>Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en breng de pellet in 1 ml IJSKOUDE MV-3-oplossing door met een laag bindende pipetpunt.<ol>
<li>Voor kleine gewervelde specimens, breng de suspensie (vanaf stap 6,10) over in een micro centrifugebuis van 1,7 mL en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Opmerking: deze spin wordt uitgevoerd op een tafel-centrifuge op maximale snelheid (~ 20.000 x g) om een robuuste opbrengst te garanderen.</li>
		<li>Voor grote gewervelde specimens, breng de suspensie van stap 6,10 over in een micro centrifugebuis van 5,0 mL, Voeg 4 mL MV-3-oplossing toe en centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. immunokleuring
Opmerking: de kleuring van HEMA Oxylin en eosine (H & E) werd uitgevoerd op reptielen, amfian en visspecimens als een proof-of-concept van de haalbaarheid van het protocol. Daarom is er geen aanbeveling voor immunolabeling voor deze specimens.
<ol><li>Verwijder de supernatant van de micro centrifugebuizen.</li>
	<li>Rebreng de pellet in 1x steriele PBS met een laag bindende pipetpunt (tabel met materialen). Houd de micro vaten van het vormen van aggregaten door meerdere malen te pipetten. Gebruik voor kleine gewervelde specimens (tabel 3) ~ 100 μl – 2000 μl volgens de korrelgrootte. Gebruik bij grote gewervelde specimens (tabel 5) ~ 1.000 μl – 4000 μl volgens de korrelgrootte.</li>
	<li>Gebruik een low-binding pipetpunt, breng de micro vaten over naar goed dia's, wees voorzichtig om ze toe te voegen aan het midden van elke put, waarbij de zijwanden worden vermeden.</li>
	<li>Stel de goed glijbanen, blootgelegd, in een BSC-2, en laat drogen voor 20 aan 30 min bij RT. Opmerking: een relatief hoog volume van 1x PBS wordt gebruikt om geaggregeerde vorming te voorkomen. Daarom is het noodzakelijk om de glaasjes voorafgaand aan fixatie te laten drogen om ervoor te zorgen dat de micro vaten worden vastgehouden door de poly-D-Lysine coating.</li>
	<li>Verwijder de resterende 1x PBS door pipetteren met een pipet voor overdracht, voeg 200 μL van 4% Paraformaldehyde (PFA) toe en inbroed gedurende 30 minuten bij RT.</li>
	<li>Pipetteer de fixatieve oplossing en spoel 3x met 200 μL 1x PBS gedurende 5 minuten bij RT. Opmerking: H & E kleuring op vissen, amfian, en reptiel CNS micro vaartuigen werd uitgevoerd op dit punt.</li>
	<li>Voeg 200 μL blokkerende buffer toe aan de put-Slide en inincubatie voor 60 min bij 37 °C.</li>
	<li>Verwijder de blokkerende buffer met een pipet voor overdracht en voeg 200 μL van de cocktail van het primaire antilichaam toe in antilichaam verdunningsmiddel (tabel met materialen). Incuberen bij 4 °C 's nachts.</li>
	<li>Pipetteer de cocktail van het primaire antilichaam en spoel 3x met 200 μL 1x PBS gedurende 5 minuten bij RT.</li>
	<li>Laad de cocktail van het secundaire antilichaam (tabel met materialen), verdund in 1x PBS, en inincuberen voor 2 uur bij RT, beschermd tegen licht.</li>
	<li>Pipetteer de cocktail van het secundaire antilichaam en was 3x met 200 μL 1x PBS gedurende 5 minuten bij RT, beschermd tegen licht. Na de laatste Wash los het frame van de goed-Slide en dep-droog elke overmaat 1x PBS met een laag pluis papier doekje.</li>
	<li>Voeg een dekslip, vloeibaar antifade inbedmiddel medium, en 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) voor nucleaire kleuring. Laat 's nachts drogen op RT beschermd tegen licht.</li>
	<li>Eenmaal droog, blijf beschermd tegen licht op een Slide box bij 4 °C tot het klaar is voor confocale microscopie en data-acquisitie.</li>
</ol>

<ol><li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).</li>
<li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li>
<li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li>
<li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li>
<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier%3A+From+Physiology+to+Disease+and+Back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).</li>
<li>Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the blood-brain barrier.</a> Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).</li>
<li>O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+barriers%3A+a+comparative+look+at+the+blood-brain+barrier+across+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms.</a> Genes & Development. 32, 466-478 (2018).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR7+influences+leukocyte+entry+into+the+CNS+parenchyma+by+controlling+abluminal+CXCL12+abundance+during+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).</li>
<li>Serres, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1-targeted+magnetic+resonance+imaging+reveals+subclinical+disease+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis.</a> FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).</li>
<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers%3A+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li>
<li>Sohet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSR%2Fangulin-1+is+a+tricellular+tight+junction+protein+involved+in+blood-brain+barrier+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation.</a> Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+expression+underlies+female+CNS+autoimmunity+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).</li>
<li>Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li>
<li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li>
<li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li>
<li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li>
<li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li>
<li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li>
<li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li>
<li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mouse+Brain+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).</li>
<li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li>
<li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li>
<li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex%3A+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li>
<li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De BBB omvat de unieke eigenschappen van de hersenen microcirculatiebed endotheliale cellen in combinatie met een verfijnde architectuur van strakke-, aanhangers-, "Peg-socket"-knooppunten, en adhesie plaques kritisch voor CNS homeostase2,3,19. Endotheliale cellen eigenschappen worden geïnduceerd en onderhouden door pericytes en de omringende astroglia eind-voet processen2,3</...

Ons brein is het belangrijkste orgaan in ons lichaam. Om deze reden, houden van de hersenen homeostase ondanks externe factoren die een afwijking van normaliteit kan leiden is een prioriteit. Volgens sommige geleerden, ongeveer 400 – 500 miljoen jaar geleden1, gewervelde dieren ontwikkeld wat we nu kennen als de bloed-hersen barrière (BBB)2,3. Deze beschermende "hek" oefent de grootste invloed op homeostase van het centrale zenuwstelsel (CNS) en functies door het transport van ionen, moleculen en cellen tussen bloed en CNS parenchym strak te reguleren. Wanneer de BBB wordt verstoord, de hersenen wordt vatbaar voor toxische blootstelling, infectie, en ontsteking. Daarom, BBB dysfunctie wordt geassocieerd met vele, zo niet alle, neurologische en neurodevelopmental aandoeningen4,5,6.
De verfijnde functie van de BBB wordt toegeschreven aan de unieke CNS Microvasculatuur aan normen voldoende door de neurovasculaire eenheid (NVU)2,3. Zeer gespecialiseerde endotheliale cellen, pericytes en astrocytische eind voeten zijn de cellulaire componenten van de nvu2,3. De extracellulaire matrix gegenereerd door deze cellen is ook essentieel voor de nvu en BBB fysiologie2,3. Hoewel essentiële cellulaire en moleculaire componenten van de nvu onder gewervelde dieren worden bewaard, wordt heterogeniteit gerapporteerd bij orders en soorten7,8. Technische beperkingen belemmeren echter ons vermogen om deze verschillen in neurobiologie, biomedisch of translationeel onderzoek volledig te overwegen.
Daarom hebben we een regiospecifieke microvessel-isolatiemethode voor het CZS uitgebreid om het toepasbaar te maken op tal van soorten uit alle vijf gewervelde groepen: vissen, amfibieën, reptielen, vogels en zoogdieren. Het protocol wordt beschreven voor gebruik op kleine lissencefale en groot-gyrencephalic Vertebraten, met inbegrip van soorten met translationele relevantie9. Bovendien, we nemen andere regio's van het CZS niet eerder onderzocht in deze context, maar relevant voor neurofysiologie en met enorme klinische implicaties: de hypothalamus, hypofyse, en witte materie. Tot slot testten we de capaciteit van deze isolatiemethode als een betrouwbaar hulpmiddel om veranderingen in eiwit expressie langs de nvu en/of BBB9,10,11te identificeren. Als proof-of-concept hebben we laten zien hoe veranderingen in VCAM-1 en JAM-B-expressie tijdens EAE kunnen worden vastgesteld met behulp van de isolatiemethode gevolgd door immunofluorescentie.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>BP39920</td><td>Gebaten voor blokkering en antilichaamverdunner.</td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td>Gebaten als fixeermiddel (4% PFA)</td></tr><tr><td>70,000 MW Dextran</td><td>Millipore Sigma</td><td>9004-54-0</td><td>Gebaten voor MV-2 oplossing</td></tr><tr><td>Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11006-12</td><td>Gebaten voor verwijdering van spier en huid</td></tr><tr><td>Adson Forceps, student quality</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td>Hetzelfde als hierboven maar goedkoper</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>Gebaten voor MV-3 oplossing, blokkering en antilichaamverdunner</td></tr><tr><td>Corning 100 &mu;m Cell strainer</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431752-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 &mu;m Cell strainer</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning Deskwork low-binding tips</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS4151</td><td>Hetzelfde als hieronder maar goedkoper.</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lysine</td><td>R&amp;D</td><td>3439-100-01</td><td>Gebaten voor het coaten van slides</td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21432</td><td>Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21202</td><td>Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21206</td><td>Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>A31573</td><td>Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10029</td><td>Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.</td></tr><tr><td>Double-Pronged Tissue Pick</td><td>FST</td><td>18067-11</td><td>Gebaten voor verwijdering van meninges en choroïde plexus</td></tr><tr><td>Dumont #3c Forceps</td><td>FST</td><td>11231-20</td><td>Gebaten voor delicate en/of kleine CNS weefselbehandeling (zoals hypofyse)</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>Gebaten voor CNS weefseldissociatie en behandeling</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps, student</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td>Hetzelfde als hierboven maar goedkoper</td></tr><tr><td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips</td><td>Eppendorf</td><td>22493008</td><td>Betere kwaliteit dan de tips hierboven (duurder).</td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps, serrated</td><td>FST</td><td>11151-10</td><td>Gebaten voor botverwijdering</td></tr><tr><td>Fine Scissors, sharp</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>Gebaten voor verwijdering van durale zak bij varkens en apen</td></tr><tr><td>Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10</td><td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td><td>GP1.5_10</td><td>Gebaten voor kleine vertebraten hypothalamus en hypofyse.</td></tr><tr><td>Goat anti-CXCL12, biotinylated</td><td>PeproTech</td><td>500-P87BGBT</td><td>Gebaten als primair antilichaam op CNS microvaten van alle specimens. Aanbevolen verdunning: 1:20.</td></tr><tr><td>Goat anti-JAM-B</td><td>R&amp;D</td><td>AF1074</td><td>Gebaten als primair antilichaam om neuro-inflammatie te beoordelen. Aanbevolen concentratie: 5 &mu;g/mL.</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A11001</td><td>Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21424</td><td>Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.</td></tr><tr><td>Goat anti-PDGFR&beta;</td><td>R&amp;D</td><td>AF1042</td><td>Gebaten als primair antilichaam op CNS microvaten van alle specimens. Aanbevolen concentratie: 5 &mu;g/mL.</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21249</td><td>Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488</td><td>Thermo</td><td>35552</td><td>Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10021</td><td>Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.</td></tr><tr><td>Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth</td><td>FST</td><td>11054-10</td><td>Gebaten voor nylon filternet vasthouden en schudden</td></tr><tr><td>HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium</td><td>Corning</td><td>21-022-CM</td><td>Gebaten voor MV-1 oplossing</td></tr><tr><td>HEPES, 1M liquid buffer</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td>Gebaten voor MV-1 oplossing</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4-Biotin-XX</td><td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td><td>I21414</td><td>Glycoproteïne geïsoleerd uit de peul Griffonia simplicifolia dat zich bindt aan D-galactosylresiduen van endotheelcel glycocalysx. Gebaten voor vogel- en varkens-CNS microvaten. Aanbevolen concentratie: 5 &mu;g/mL.</td></tr><tr><td>LaGrange Scissors, serrated</td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>Gebaten voor schedeldissectie en laminectomie (behalve varkens en apen)</td></tr><tr><td>Millicell EZ slide 8-well unit</td><td>Millipore Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-CLDN5</td><td>Thermo</td><td>35-2500</td><td>Gebaten als primair antilichaam op CNS microvaten van alle specimens. Aanbevolen concentratie: 5 &mu;g/mL.</td></tr><tr><td>Mouse anti-GGT1</td><td>Abcam</td><td>ab55138</td><td>Gebaten als primair antilichaam op CNS microvaten van alle

betrouwbare isolatie van micro vaten van het centrale zenuwstelsel in vijf gewervelde groepen

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Isolatie van micro vaten van het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt vaak uitgevoerd door het combineren van corticale weefsel van meerdere dieren, meestal knaagdieren. Deze aanpak beperkt de ondervraging van bloed-hersen barrière (BBB) eigenschappen tot de cortex en staat niet toe voor individuele vergelijking. Dit project richt zich op de ontwikkeling van een isolatiemethode die het mogelijk maakt voor de vergelijking van de neurovasculaire eenheid (NVU) uit meerdere gebieden van de CNS: cortex, cerebellum, Optic kwbe, hypothalamus, hypofyse, hersenstam, en ruggenmerg. Bovendien, dit protocol, oorspronkelijk ontwikkeld voor Murine monsters, werd met succes aangepast voor gebruik op CNS weefsels van kleine en grote gewervelde soorten waaruit we ook in staat zijn om micro vaten te isoleren van hersen halfrond witte materie. Deze methode, wanneer gekoppeld met immunolabeling, maakt kwantificering van eiwit expressie en statistische vergelijking tussen individuen, weefseltype of behandeling mogelijk. We bewees deze toepasbaarheid door veranderingen in de eiwit expressie te evalueren tijdens experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE), een muriene model van een neuroinflammatoire ziekte, multiple sclerose. Bovendien kunnen micro tanks die door deze methode worden geïsoleerd, onder andere worden gebruikt voor downstreamtoepassingen zoals qPCR, RNA-SEQ en Western Blot. Hoewel dit niet de eerste poging is om CZS-micro vaartuigen te isoleren zonder het gebruik van ultracentrifugatie of enzymatische dissociatie, is het uniek in zijn bedrevenheid voor de vergelijking van individuele personen en meerdere CZS-regio's. Daarom is het mogelijk voor onderzoek van een aantal verschillen die anders mogelijk onduidelijk blijven: CNS porties (cortex, cerebellum, optiek kwabben, hersenstam, hypothalamus, hypofyse, en ruggenmerg), CNS weefseltype (grijze of witte stof), individuen, experimentele behandelingsgroepen en soorten.

Micro vaten geïsoleerd uit Murine CNS toonde alle intrinsieke cellulaire componenten van de neurovasculaire eenheid2,3. Met behulp van ofwel bloedplaatjes endotheliale cel adhesie molecuul-1 (PECAM, ook bekend als CD31) of isolectine IB4 (een glycoproteïne dat de endotheel cel glycocalyx bindt) voor endotheel cellen, trombocyten afgeleide groeifactor-β (PDGFRβ) of neuron-glial antigeen 2 (NG2) voor pericytes en aquaporin-4 (AQP4) ...

Het doel van dit protocol is het isoleren van micro vaartuigen uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel van lissencefische en gyrencephalic vertebraten.

Betrouwbare isolatie van micro vaten van het centrale zenuwstelsel in vijf gewervelde groepen

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Dit protocol is belangrijk omdat het zorgt voor de vergelijking van microvasculature tussen verschillende centrale zenuwstelsel regio's, evenals tussen verschillende individuen. Deze microschip isolatie techniek kan worden voltooid binnen een enkele dag, en het elimineert de noodzaak van ultracentrifugatie en enzymatische dissociatie. Het verwijderen van de hersenvliezen en de choroïde plexus kan moeilijk zijn.Zorg ervoor dat u langzaam en zorgvuldig werkt om de volledige verwijdering van elk weefsel te garanderen. Voor CNS weefsel dissectie van een kleine lissencephalic gewervelde specimen, plaats de geoogste hersenen in een 15 milliliter buis met MV-1 oplossing op ijs, en gebruik tangen om de hypofyse te halen uit de sella turcica van de schedel. Plaats de hypofyse in een 1,7 milliliter microcentrifuge buis van MV-1 oplossing op ijs, en verwijder de huid en spieren om de wervelkolom bloot te leggen.Gebruik na het verwijderen van de ledematen, ribbenkast en inwendige organen een spuit van 10 milliliter uitgerust met een 18-meter naald om de wervelkolom met verse MV-1-oplossing door te spoelen, in een caudal-to-rostral-richting door de lumbale wervelspoeers. Plaats vervolgens het ruggenmerg in een 5 milliliter buis met verse MV-1 oplossing. Plaats vervolgens de hersenen in een petrischaaltje onder de ontledende microscoop en verwijder de hersenvliezen met een dubbele prik.Zorg ervoor dat u het ruggenmerg controleert om ervoor te zorgen dat er geen stukjes hersenvliezen overblijven. Gebruik de tangen om de hypothalamus, cerebellum, hersenstam en cortex te scheiden. Gebruik indien nodig tangen en iris- en veerschaar om de reukbollen en thalamus uit te roeien en gebruik de dubbelgeplete prik om alle choroid plexus uit alle hersenventrikels te verwijderen.Voor CNS weefsel dissectie van een grote gyrencephalic gewervelde specimen, gebruik maken van een ontleden microscoop en een dubbel-pronged prik, tangen, en iris en lente schaar om de hersenvliezen te verwijderen uit elk CNS weefsel, zorg ervoor dat alle stukken van choroid plexus te verwijderen uit de ventilatiekamers. Voor homogenisatie van de geoogste CNS weefsels, gehakt elke CNS regio in een tot twee millimeter stukken binnen individuele petrischaaltjes. Om CNS-weefsels van kleine gewervelde exemplaren te homogeniseren, gebruikt u een overdrachtpipet om een milliliter MV-1-oplossing toe te voegen om het gehakte weefsel op te schorten.Gebruik vervolgens dezelfde overdracht pipet om de cortex, cerebellum, hersenstam, optische kwab, en ruggenmerg stukken in individuele 10 milliliter glasweefsel slijpmachines, en gebruik een PTFE stamper en vijf milliliter mv-1 oplossing om elke set van weefsels te malen voor ongeveer 10 slagen. Breng elke weefseldrijfmest in individuele 15 milliliter buisbuizen op ijs, en gebruik tangen om de hypothalamus en hypofyse in 100 microliter van MV-1 oplossing, in individuele 1,7 milliliter buizen. Vervolgens, zorgvuldig homogeniseren elk weefsel met een glazen micropestle.Om een groot gewerveld monster te homogeniseren, gebruik dan een afgeschuinde cut transfer pipet om het gehakte weefsel over te brengen naar een 55 milliliter glazen weefselmolen, en bevestig de molen aan een overhead roerder. Voeg de helft van het aanbevolen volume mv-1-oplossing toe volgens het specifieke CNS-gedeelte dat wordt gehomogeniseerd zoals aangegeven in de tabel, en schakel de overheadroer in tot ongeveer 150 rotaties per minuut. Beweeg de glazen buis voorzichtig ongeveer 30 seconden op en neer voordat u de overheadroerder uitschakelt om meer MV-1-oplossing toe te voegen voor extra homogenisatie, totdat een homogene drijfmest is verkregen.Breng vervolgens het gehomogeniseerde weefsel over naar een conische buis van 50 milliliter op ijs. Voor microschip zuivering, pellet het CNS weefsel homogenates door centrifugatie, en gooi de supernatants. Voor een klein gewervelde monster microschip isolatie, pipet de cortex, cerebellum, hersenstam, optische kwab en ruggenmerg pellets, in vijf milliliter verse, ijskoude MV-2 oplossing per monster, ongeveer 10 keer, alvorens nog eens vijf milliliter van ijskoude MV-2 oplossing aan elke buis.Draai de buizen voorzichtig om om te mengen en schort de hypothalamus en hypofysepellets opnieuw op in één milliliter MV-2-oplossing. Voor grote gewervelde specimen microschip isolatie, voeg 20 milliliter van ijskoude MV-2 oplossing aan de cortex, cerebellum, hersenstam, en ruggenmerg microvessel pellets, en opnieuw opschorten de pellets in een buis revolver op 40 rotaties per minuut gedurende ongeveer 5 minuten. Aan het einde van de hersuspensie, scheiden de CNS weefsel lycates door centrifugatie, en langzaam draaien elke buis om de supernatant te passeren langs de muur om zorgvuldig los de dikke en dichte myeline laag op de vloeibare interface van de buis muren.Gooi de myeline en vloeibare interfaces, en dep de binnenwand van elke buis met een spatel verpakt met een laag-pluisjes papier doekje. Gebruik vervolgens een gedraaide laagvlint papierdoek om overtollige vloeistof op te nemen en gebruik laagbindingstips om elke pellet opnieuw op te schorten in één milliliter MV-3-oplossing. Voor microschip elutie en filtratie, meng een paar milliliter verse MV-3 oplossing om elk CNS weefsel microvessel drijfmest, en tijdens het mengen om aggregaten te voorkomen, stam elke suspensie door middel van een Pruitt strainer in individuele 50 milliliter conische buizen.Plaats één nylon netfilter van 20 micrometer op één gemodificeerde filterhouder per CNS-gebied. Breng de filterhouder over op een conische buis van 50 milliliter en maak het filter nat met vijf milliliter ijskoude MV-3-oplossing, zodat de buffer de filterhouder in de conische buis giet. Breng de eluted microschepen over op elk nylon netfilter van 20 micrometer en spoel de microschepen af met vijf tot 10 milliliter ijskoude MV-3-oplossing.Gebruik tangen om elk filter over te zetten in individuele bekers met de ijskoude MV-3-oplossing en schud elk filter voorzichtig ongeveer 30 seconden om de microschepen los te maken. Na het overbrengen naar een 15 milliliter conische buis, verzamel de microschepen door centrifugatie, en gebruik een laag-bindende pipet om elke pellet opnieuw op te schorten in een milliliter ijskoude MV-3 oplossing. Breng vervolgens microschepenussuspensies van kleine gewervelde exemplaren over in een 1,7 milliliter microcentrifugebuis voor centrifugatie gedurende vijf minuten op 20.000 keer G, in vier graden Celsius.Voor grote gewervelde exemplaren, breng de suspensie in individuele vijf milliliter centrifuge buizen, en voeg vier milliliter MV-3 oplossing voor centrifugatie gedurende vijf minuten op 2,000 keer G in vier graden Celsius. De intrinsieke componenten van de neurovasculaire eenheid kunnen worden gedetecteerd binnen microschepen, geïsoleerd zoals aangetoond, door immunolabeling voor CD31, PDGFR-beta, en aquaporine vier, met inbegrip van de corticale, cerebellar, hypofyse, hypothalamische, hersenstam, en spinale microschepen. Ook de expressie van hechte-knooppunt eiwit VE-cadherine, strakke kruising eiwitten CLDN5 en Zonula Occludens-1, driehoekige kruising eiwit angulin-1, en basale markes chemokine ligand CXCL motief 12, en gamma-glutamyltransferase-1, kan worden gevisualiseerd.Bovendien is de meerderheid van de microschepen verstoken van de expressie van alfa gladde spier actin, wat aangeeft dat dit isolatieprotocol selectief gericht is op microschepen van klein kaliber. Microschepen verkregen uit andere kleine lissencephalic gewervelde dieren, zoals vogel, leugenaar, kikker, en vis, delen een aantal morfologische kenmerken, wat suggereert dat deze methode nuttig is voor verdere karakterisering van verschillen in neurovasculaire eenheden tussen soorten. Kwantificering van de veranderingen in eiwitexpressie onthult een toename van vasculaire celhefels molecuul een, en junctionele adhesie molecuul B langs het ruggenmerg microschepen, tijdens de piek van experimentele auto-immuunenceomyelitis.Echter, vasculaire cel adhesie molecuul een is ook aanzienlijk toegenomen in hypofyse microschepen, en daalde in de hypothalamus en hersenstam microschepen. Bovendien worden veranderingen waargenomen in vasculaire celheczie molecuul een uitdrukking tijdens chronische experimentele auto-immuunenceomyelitis in alle CNS weefsels, en in junctionele adhesie molecuul B expressie in de hypothalamus en hypofyse microvessels. Kwantitatieve analyses, zoals westerse vlek, PCR en immunohistochemie, kunnen volgens deze procedure worden uitgevoerd om inzichten te onthullen in gen- en eiwitexpressiepatronen binnen de bloed-hersenbarrière.Paraformaldehyde is een acuut giftig reagens, en moet altijd worden behandeld onder de rookkap tijdens het dragen van de juiste PBM.

reliable-isolation-central-nervous-system-microvessels-across-five

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the isolation of intact vessels from a mouse's brain that constitute the blood-brain barrier (BBB) along with neurons and glial cells. The isolated vessels can be used as an in vitro model to study their role in maintaining brain homeostasis.

Isolating Mouse Brain Vessels: A Protocol to Isolate Intact Vessels from Murine Brain Sample

This video demonstrates the process of isolating brain microvessels from euthanized rats. It includes the dissection of the brain, cleaning of the tissue, and mechanical digestion, followed by repeated centrifugation to isolate the pure fraction of microvessels.

A Method for the Isolation of Neurovascular Units from Rat Brain

Hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC) zijn onderling verbonden door specifieke junctionele eiwitten die een sterk gereguleerde barrière vormen die bloed en het centrale zenuwstelsel (CZS) scheiden, de zogenaamde bloed-hersenbarrière (BBB). De isolatie van primaire muis-hersenmicrovasculaire endotheelcellen, zoals besproken in dit protocol, maakt gedetailleerde in vitro studies van de BBB mogelijk.

Isolatie van Primary Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen

Dit protocol beschrijft repetitieve hypoxische preconditie, of korte blootstellingen aan systemische hypoxie die infarctvolumes en bloed-hersenbarrière-storingen verminderen na een voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader bij muizen. Het beschrijft ook dubbele kwantificering van infarctvolume en bloed-hersenbarrière-storing na een beroerte om de werkzaamheid van neurovasculaire bescherming te beoordelen.

Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

We beschrijven een protocol dat de zuivering van het vasculaire compartiment van de muizenhersenen mogelijk maakt. Geïsoleerde hersenvaten omvatten endotheelcellen die zijn verbonden door strakke verbindingen en omringd door een continue basale lamina, pericyten, vasculaire gladde spiercellen, evenals perivasculaire astrogliale membranen.

Zuivering van Mouse Brain Schepen

Dit manuscript beschrijft een eenvoudig en reproduceerbaar protocol voor het isoleren van intracerebrale arteriolen (een groep bloedvaten die omvat parenchymale arteriolen, penetrerende arteriolen en precapillaire arteriolen) van muizen, te gebruiken in drukmyografafie, immunofluorescentie, biochemie en moleculaire studies.

Isolatie en Canulatie van Cerebral Parenchymale Arteriolen

Geïsoleerde hersenen haarvaten van menselijk hersenweefsel kunnen worden gebruikt als een preklinische model om te studeren barrièrefunctie fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Hier presenteren we een geoptimaliseerde protocol om te isoleren van de hersenen haarvaten van verse menselijk hersenweefsel.

Isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel

Hier wordt een methode voor het isoleren van de rat hersenen microvessels en voor de bereiding van de eindmonsters membraan beschreven. Dit protocol heeft het duidelijk voordeel van het produceren van verrijkte microvessel monsters met aanvaardbare eiwit van individuele dieren opbrengst. Steekproeven kunnen vervolgens worden gebruikt voor analyses van de robuuste proteïne in de hersenen microvasculaire endotheel.

Een eenvoudige en reproduceerbare methode te bereiden membraan monsters van vers geïsoleerde Rat hersenen Microvessels

Dit artikel presenteert twee geoptimaliseerde protocollen voor het onderzoeken van residente en perifeer afgeleide immuuncellen in het centrale zenuwstelsel, waaronder de hersenen, het ruggenmerg en de hersenvliezen. Elk van deze protocollen helpt bij het vaststellen van de functie en samenstelling van de cellen die deze compartimenten bezetten onder steady state en ontstekingsomstandigheden.

Isoleren van weefsels van het centrale zenuwstelsel en bijbehorende hersenvliezen voor de downstream-analyse van immuuncellen

Hier presenteren we een protocol voor in vitro isolatie van meerdere gliacelpopulaties van een muis CNS. Deze methode maakt de segregatie van regionale microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten mogelijk om de fenotypen van elk in verschillende cultuursystemen te bestuderen.

Dissectie en isolatie van Murine Glia uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel

Tot op heden zijn protocollen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het centrale zenuwstelsel uit dezelfde muis een onvervulde vraag. Het protocol toont een procedure die toepasbaar is bij naïeve en experimentele auto-immuun encefalomyelitis-muizen om complexe cellulaire netwerken tijdens neuro-inflammatie te onderzoeken en tegelijkertijd het vereiste aantal muizen te verminderen.

Gelijktijdige isolatie van de belangrijkste celtypen van het centrale zenuwstelsel van volwassen auto-immuun encefalomyelitis-muizen

Leer een betrouwbare methode voor microvat-isolatie uit het centrale zenuwstelsel bij vijf gewervelde groepen. Deze techniek vereist geen ultracentrifugatie en kan binnen één dag worden voltooid.

Betrouwbare isolatie van micro vaten van het centrale zenuwstelsel in vijf gewervelde groepen

Meer video's verkennen