Betrouwbare isolatie van micro vaten van het centrale zenuwstelsel in vijf gewervelde groepen

Dit protocol is belangrijk omdat het zorgt voor de vergelijking van microvasculature tussen verschillende centrale zenuwstelsel regio's, evenals tussen verschillende individuen. Deze microschip isolatie techniek kan worden voltooid binnen een enkele dag, en het elimineert de noodzaak van ultracentrifugatie en enzymatische dissociatie. Het verwijderen van de hersenvliezen en de choroïde plexus kan moeilijk zijn.

Zorg ervoor dat u langzaam en zorgvuldig werkt om de volledige verwijdering van elk weefsel te garanderen. Voor CNS weefsel dissectie van een kleine lissencephalic gewervelde specimen, plaats de geoogste hersenen in een 15 milliliter buis met MV-1 oplossing op ijs, en gebruik tangen om de hypofyse te halen uit de sella turcica van de schedel. Plaats de hypofyse in een 1,7 milliliter microcentrifuge buis van MV-1 oplossing op ijs, en verwijder de huid en spieren om de wervelkolom bloot te leggen.

Gebruik na het verwijderen van de ledematen, ribbenkast en inwendige organen een spuit van 10 milliliter uitgerust met een 18-meter naald om de wervelkolom met verse MV-1-oplossing door te spoelen, in een caudal-to-rostral-richting door de lumbale wervelspoeers. Plaats vervolgens het ruggenmerg in een 5 milliliter buis met verse MV-1 oplossing. Plaats vervolgens de hersenen in een petrischaaltje onder de ontledende microscoop en verwijder de hersenvliezen met een dubbele prik.

Zorg ervoor dat u het ruggenmerg controleert om ervoor te zorgen dat er geen stukjes hersenvliezen overblijven. Gebruik de tangen om de hypothalamus, cerebellum, hersenstam en cortex te scheiden. Gebruik indien nodig tangen en iris- en veerschaar om de reukbollen en thalamus uit te roeien en gebruik de dubbelgeplete prik om alle choroid plexus uit alle hersenventrikels te verwijderen.

Voor CNS weefsel dissectie van een grote gyrencephalic gewervelde specimen, gebruik maken van een ontleden microscoop en een dubbel-pronged prik, tangen, en iris en lente schaar om de hersenvliezen te verwijderen uit elk CNS weefsel, zorg ervoor dat alle stukken van choroid plexus te verwijderen uit de ventilatiekamers. Voor homogenisatie van de geoogste CNS weefsels, gehakt elke CNS regio in een tot twee millimeter stukken binnen individuele petrischaaltjes. Om CNS-weefsels van kleine gewervelde exemplaren te homogeniseren, gebruikt u een overdrachtpipet om een milliliter MV-1-oplossing toe te voegen om het gehakte weefsel op te schorten.

Gebruik vervolgens dezelfde overdracht pipet om de cortex, cerebellum, hersenstam, optische kwab, en ruggenmerg stukken in individuele 10 milliliter glasweefsel slijpmachines, en gebruik een PTFE stamper en vijf milliliter mv-1 oplossing om elke set van weefsels te malen voor ongeveer 10 slagen. Breng elke weefseldrijfmest in individuele 15 milliliter buisbuizen op ijs, en gebruik tangen om de hypothalamus en hypofyse in 100 microliter van MV-1 oplossing, in individuele 1,7 milliliter buizen. Vervolgens, zorgvuldig homogeniseren elk weefsel met een glazen micropestle.

Om een groot gewerveld monster te homogeniseren, gebruik dan een afgeschuinde cut transfer pipet om het gehakte weefsel over te brengen naar een 55 milliliter glazen weefselmolen, en bevestig de molen aan een overhead roerder. Voeg de helft van het aanbevolen volume mv-1-oplossing toe volgens het specifieke CNS-gedeelte dat wordt gehomogeniseerd zoals aangegeven in de tabel, en schakel de overheadroer in tot ongeveer 150 rotaties per minuut. Beweeg de glazen buis voorzichtig ongeveer 30 seconden op en neer voordat u de overheadroerder uitschakelt om meer MV-1-oplossing toe te voegen voor extra homogenisatie, totdat een homogene drijfmest is verkregen.

Breng vervolgens het gehomogeniseerde weefsel over naar een conische buis van 50 milliliter op ijs. Voor microschip zuivering, pellet het CNS weefsel homogenates door centrifugatie, en gooi de supernatants. Voor een klein gewervelde monster microschip isolatie, pipet de cortex, cerebellum, hersenstam, optische kwab en ruggenmerg pellets, in vijf milliliter verse, ijskoude MV-2 oplossing per monster, ongeveer 10 keer, alvorens nog eens vijf milliliter van ijskoude MV-2 oplossing aan elke buis.

Draai de buizen voorzichtig om om te mengen en schort de hypothalamus en hypofysepellets opnieuw op in één milliliter MV-2-oplossing. Voor grote gewervelde specimen microschip isolatie, voeg 20 milliliter van ijskoude MV-2 oplossing aan de cortex, cerebellum, hersenstam, en ruggenmerg microvessel pellets, en opnieuw opschorten de pellets in een buis revolver op 40 rotaties per minuut gedurende ongeveer 5 minuten. Aan het einde van de hersuspensie, scheiden de CNS weefsel lycates door centrifugatie, en langzaam draaien elke buis om de supernatant te passeren langs de muur om zorgvuldig los de dikke en dichte myeline laag op de vloeibare interface van de buis muren.

Gooi de myeline en vloeibare interfaces, en dep de binnenwand van elke buis met een spatel verpakt met een laag-pluisjes papier doekje. Gebruik vervolgens een gedraaide laagvlint papierdoek om overtollige vloeistof op te nemen en gebruik laagbindingstips om elke pellet opnieuw op te schorten in één milliliter MV-3-oplossing. Voor microschip elutie en filtratie, meng een paar milliliter verse MV-3 oplossing om elk CNS weefsel microvessel drijfmest, en tijdens het mengen om aggregaten te voorkomen, stam elke suspensie door middel van een Pruitt strainer in individuele 50 milliliter conische buizen.

Plaats één nylon netfilter van 20 micrometer op één gemodificeerde filterhouder per CNS-gebied. Breng de filterhouder over op een conische buis van 50 milliliter en maak het filter nat met vijf milliliter ijskoude MV-3-oplossing, zodat de buffer de filterhouder in de conische buis giet. Breng de eluted microschepen over op elk nylon netfilter van 20 micrometer en spoel de microschepen af met vijf tot 10 milliliter ijskoude MV-3-oplossing.

Gebruik tangen om elk filter over te zetten in individuele bekers met de ijskoude MV-3-oplossing en schud elk filter voorzichtig ongeveer 30 seconden om de microschepen los te maken. Na het overbrengen naar een 15 milliliter conische buis, verzamel de microschepen door centrifugatie, en gebruik een laag-bindende pipet om elke pellet opnieuw op te schorten in een milliliter ijskoude MV-3 oplossing. Breng vervolgens microschepenussuspensies van kleine gewervelde exemplaren over in een 1,7 milliliter microcentrifugebuis voor centrifugatie gedurende vijf minuten op 20.000 keer G, in vier graden Celsius.

Voor grote gewervelde exemplaren, breng de suspensie in individuele vijf milliliter centrifuge buizen, en voeg vier milliliter MV-3 oplossing voor centrifugatie gedurende vijf minuten op 2,000 keer G in vier graden Celsius. De intrinsieke componenten van de neurovasculaire eenheid kunnen worden gedetecteerd binnen microschepen, geïsoleerd zoals aangetoond, door immunolabeling voor CD31, PDGFR-beta, en aquaporine vier, met inbegrip van de corticale, cerebellar, hypofyse, hypothalamische, hersenstam, en spinale microschepen. Ook de expressie van hechte-knooppunt eiwit VE-cadherine, strakke kruising eiwitten CLDN5 en Zonula Occludens-1, driehoekige kruising eiwit angulin-1, en basale markes chemokine ligand CXCL motief 12, en gamma-glutamyltransferase-1, kan worden gevisualiseerd.

Bovendien is de meerderheid van de microschepen verstoken van de expressie van alfa gladde spier actin, wat aangeeft dat dit isolatieprotocol selectief gericht is op microschepen van klein kaliber. Microschepen verkregen uit andere kleine lissencephalic gewervelde dieren, zoals vogel, leugenaar, kikker, en vis, delen een aantal morfologische kenmerken, wat suggereert dat deze methode nuttig is voor verdere karakterisering van verschillen in neurovasculaire eenheden tussen soorten. Kwantificering van de veranderingen in eiwitexpressie onthult een toename van vasculaire celhefels molecuul een, en junctionele adhesie molecuul B langs het ruggenmerg microschepen, tijdens de piek van experimentele auto-immuunenceomyelitis.

Echter, vasculaire cel adhesie molecuul een is ook aanzienlijk toegenomen in hypofyse microschepen, en daalde in de hypothalamus en hersenstam microschepen. Bovendien worden veranderingen waargenomen in vasculaire celheczie molecuul een uitdrukking tijdens chronische experimentele auto-immuunenceomyelitis in alle CNS weefsels, en in junctionele adhesie molecuul B expressie in de hypothalamus en hypofyse microvessels. Kwantitatieve analyses, zoals westerse vlek, PCR en immunohistochemie, kunnen volgens deze procedure worden uitgevoerd om inzichten te onthullen in gen- en eiwitexpressiepatronen binnen de bloed-hersenbarrière.

Paraformaldehyde is een acuut giftig reagens, en moet altijd worden behandeld onder de rookkap tijdens het dragen van de juiste PBM.