Imaging van intracellulaire ATP in Organotypic weefsel segmenten van de muis hersenen met behulp van de FRET-gebaseerde sensor ATeam 1.03^Yemk

Hier laten we zien hoe we de ATP-gevoelige FRET-sensor ATeam 1.03 YEMK kunnen gebruiken voor dynamische metingen van veranderingen in neuronale en astrocytische ATP-niveaus in organotypisch gekweekte muis hippocampal plakjes. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat men energiemetabolisme in levend hersenweefsel in een gecontroleerde omgeving kan bestuderen, een omgeving met hoge sensorexpressieniveaus. Deze techniek kan helpen bij het verkrijgen van inzichten in pathomechanisms, onderliggende ziekten, of hersenschade, bijvoorbeeld, veroorzaakt door energiedeprivatie, zoals ischemische beroerte.

Het kan in principe worden gebruikt om ATP-niveaus te bestuderen, niet alleen in hersenweefsel, maar ook in andere organen. Om dit experiment succesvol uit te voeren, is het essentieel om alle stappen uit te voeren die betrokken zijn bij het kweken van het weefsel uiterst voorzichtig en om steriliteit te behouden. Bovendien is enige kennis van cellulaire fluorescerende beeldvorming vereist.

Weefselbehandeling in de meest geavanceerde aanpak en een visualisatie is van vitaal belang om de juiste procedures te begrijpen. Hetzelfde geldt voor beeldvormende experimenten. Het aantonen van de procedure zal Rodrigo Lerchundi, een postdoc, en Na Huang, een master student van het laboratorium.

In een ijskoud petrischaaltje gevuld met ACSF, plaats de hersenen op een filter membraan. Scheid de hemisferen en voer een parasagittale snede uit onder een hoek van 45 graden. Bevestig een halfrond in het vibratomeweefsel stadium met superlijm, en onmiddellijk de overdracht van het weefsel blok naar de Vibratome bad met ijskoude ACSF bubbelde met 5% kooldioxide en 95%zuurstof.

Lijn het weefsel in het Vibratome bad uit. Houd het tweede halfrond in ijskoude ACSF tot het snijden. Pas de Vibratome aan om plakjes op 250 tot 400 micrometer te snijden.

Na het snijden van de slice, identificeer de hippocampal formatie op basis van zijn typische morfologische verschijning en isoleren met behulp van hypodermische naalden, waardoor het deel van de hersenschors grenzend aan de hippocampus. Plaats de plak op een gaas in ACSF, opgewarmd tot 34 graden Celsius en bubbelde met 5% kooldioxide en 95% zuurstof totdat alle plakjes zijn verzameld. Breng de plakjes naar de laminaire stroomkast om verder te gaan onder steriele omstandigheden.

Met een omgekeerde, steriele, glazen Pasteur pipet, breng je de plakjes van de ACSF voorzichtig over in een van de voorverwarmde petrischaaltjes gevuld met steriele Hanks'zoutoplossing. Verander de pipet en breng de plakjes naar de tweede cultuurschaal. Herhaal het proces vijf keer in totaal.

Breng zo min mogelijk HBSS over naar de volgende kweekplaten. Met behulp van een pipet, voorzichtig plaats een plak per keer op de top van de cultuur insert. Vermijd turbulenties in de pipet en wacht tot het plakje afdaalt naar de punt van de Pasteur pipet.

Herhaal het proces voor elk segment. Plaats twee plakjes op een membraan. Verwijder voorzichtig eventuele overtollige Hank-oplossing van de bovenkant van de wisselplaat met behulp van een fijne tip.

Bewaar de culturen in een bevochtigde couveuse op 5% kooldioxide en 37 graden Celsius tot de dag van het experiment. Vervang het medium om de twee tot drie dagen. Zonder het weefsel aan te raken, breng 0,5 microliter van de verdunde vector rechtstreeks op de bovenkant van elk segment.

Tot slot, plaats de plakjes terug in de couveuse en onderhoud ze daar nog minstens zes dagen. Net voor het starten van een experiment, breng een insert met gekweekte plakjes in de steriele kap, en plaats het in een 30 millimeter schotel met een milliliter organotypic slice cultuur medium, of minimale essentiële medium. Plaats de schotel onder de stereoscoop en focus op het oppervlak van de plak.

Gebruik twee steriele injectienaalden om een korte dwarsdoorsnede te maken op de smalle randen van een gekozen plak, en in de bovenste laag zonder het weefsel eronder te beschadigen. Om het geprepareerde plaksel uit de wisselplaat te verwijderen, houdt u de randen van het membraan met een pincet vast en gebruikt u een steriele scalpel om rechte, parallelle sneden aan het membraan te maken, waarbij een vierkant of een driehoek met het segment in het midden wordt gevormd. Als de insert extra plakjes bevat, breng deze dan terug naar de originele plaat en in de couveuse.

De oppervlaktespanning van het medium voorkomt lekkage op het oppervlak van het membraan. Bereid experimentele ACSF en verkrijg een pH van 7,4 door het te borrelen met 95% zuurstof en 5% kooldioxide door middel van een ingebrachte slang aangesloten op de carbogen levering gedurende ten minste dertig minuten. Houd de zoutoplossing borrelde tijdens het hele experiment.

Schakel vervolgens de fluorescerende lichtbron van de monochrometer in. Breng de organotypic slice cultuur in de experimentele kamer. Plaats een raster op de top van de organotypic slice cultuur met het frame naar beneden, niet aanraken van de cultuur, en de draden omhoog, het aanraken van het membraan.

Plaats de kamer op het microscoopstadium en sluit deze aan op het perfusiesysteem. Schakel de peristaltische pomp in met een stroomsnelheid van 1,5 tot 2,5 milliliter per minuut. Zorg ervoor dat het perfusiesysteem niet lekt.

Breng met behulp van transmissielicht het gekweekte deel in beeld en identificeer het gebied waar experimenten moeten worden uitgevoerd. Voordat u begint met beeldvormingsexperimenten, wacht u minstens 15 minuten om de plakjes aan te passen aan de zoutomstandigheden en schakel u vervolgens de camera en de beeldsoftware in. Prikkel het donor fluorescerende eiwit op 435 nanometer.

Stel de belichtingstijd in op 40 tot 90 milliseconden. Plaats vervolgens de dichroic spiegel en de filters in de bundel splitter unit. Splits de fluorescentie emissie op 500 nanometer met een emissie beeld splitter, en gebruik band pass filters op 482 plus of min 16 en 542 plus of min 13,5 nanometer om verder te isoleren donor en acceptoresfluorescentie.

Selecteer een regio van belang blijkbaar verstoken van cellulaire fluorescentie voor achtergrond aftrekken. Cirkel enkele structuren van gelabeld weefsel in de afbeelding op het scherm om ROI's te maken. Stel de frequentie in van beeldverwerving en de totale opnametijd.

Voor experimenten langer dan 30 minuten wordt een acquisitiefrequentie van 0,2 tot 0,5 Hertz aanbevolen om fototoxiciteit te voorkomen. Start vervolgens de opname. Als u veranderingen in intracellulaire ATP wilt veroorzaken, schakelt u de perfusiebuis van standaard ACSF over naar een zoutoplossing die metabole remmers bevat, bijvoorbeeld chemische ischemieoplossing.

U ook een zoutoplossing met verhoogde kaliumconcentratie bij acht millimolar gebruiken om het vrijkomen van kaliumionen uit actieve neuronen na te bootsen. Direct na de opnames, uitwisseling van de experimentele ACSF met enorm veel gebufferde ACSF. Breng vervolgens de opnamekamer met de slicecultuur over naar de confocale laserscanmicroscoop.

Neem Z-stackbeelden met de hoogst mogelijke Z-resolutie bij de gegeven optische configuratie. In dit protocol, tien dagen na een transductie, werden neuronen die ATeam 1.03 YEMK uitdrukken gevonden bij hoge dichtheid in de neocortex van gekweekte weefselschijven op diepten tot 50 micrometer onder het snijoppervlak. Vergelijkbare resultaten werden bereikt in de hippocampus.

Voor astrocyten werd ATeam 1.03 YEMK uitgedrukt onder de controle van de menselijke glia-zuurzuurzuurproever, en organotypische plakjes die ATeam 1.03 YEMK uitdrukken in de hippocampal neuronen geselecteerde ROI's vertegenwoordigen de somata van piramidale cellen. Na het blootstellen van de slice tot 5 millimolar natrium azide bij afwezigheid van extracellulaire glucose gedurende een minuut, werden tegenovergestelde veranderingen veroorzaakt in de emissie-intensiteit van het FRET-paar. Ook werd een omkeerbare daling van de ATeam FRET-ratio waargenomen.

Lange termijn ATeam FRET ratio in 14 verschillende cellen onder basislijnomstandigheden in neuronen en astrocyten tonen aan dat het ATeam een betrouwbare en stabiele sensor is. Houd er rekening mee dat de chemische ischemie resulteerde in de verwachte sterke daling van de ATeam-ratio in beide celtypen aan het einde van dit experiment. Een toename van de extracellulaire kaliumconcentratie van drie naar acht millimolar gedurende drie minuten heeft niet geleid tot een aantoonbare verandering in de neuronen die ATeam 1.03 YEMK uitdrukken.

Astrocyten reageerden daarentegen op de toename van extracellulair kalium door een omkeerbare toename van de ATeam FRET-ratio, wat wijst op een toename van intracellulaire ATP-niveaus. Nogmaals, chemische ischemie veroorzaakte een onmiddellijke daling van de ATeam-ratio, waaruit blijkt dat de sensor veranderingen in ATP kan detecteren. Bij een poging tot fret-gebaseerde cellulaire beeldvorming zoals hier beschreven, is het belangrijk om in gedachten te houden dat de productie van hoogwaardige plakjes in organotypische culturen is een belangrijke stap.

Bovendien zijn zorgvuldige verwijdering van het glialitteken en de beeldvorming op expertniveau vereist. Na deze procedure moet men ook in staat zijn om experiment uit te voeren waarin verschillende andere fret-gebaseerde nanosensor voor cellulaire metabolieten. Bijvoorbeeld die voor glucose of lactaat.

Ten slotte, maar niet in de laatste plaats, moet worden benadrukt dat er altijd rekening moet worden gehouden met relevante handelingen ter bescherming van dieren. Dit geldt ook voor de effectieve wetgeving inzake de omgang met genetisch gemodificeerde organismen.