Generatie van in-frame Gendeletie mutanten in Pseudomonas aeruginosa en testen op virulentie demping in een eenvoudig muis model van infectie

Dit protocol is belangrijk voor het creëren en bepalen van geest-lichaam gewenste mutaties in het genoom van Pseudomonas aeruginosa, evenals het testen van het effect van mutaties op virulentiereductie in een reproduceerbaar muismodel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een chroomvalidatie en een reproduceerbaarheid van muisinfectiemodel. Bacteriën werken voortdurend, voortdurend veranderen.

Om dit proces te vertragen, gebruiken we een bevroren stops, verpakken ze, hangen ze op meerdere sporten aan modificatie voordat we ze testen in het muismodel. Iemand die niet bekend is met deze methoden zal waarschijnlijk worstelen met de ontwikkeling en selectie van mogelijke crossover recombinant te testen. Bovendien zal de behandeling van de muizen voor infectie moeilijk zijn voor iemand die niet bekend is met dierlijk werk.

Deze methode kan worden toegepast op het testen van andere ziekteverwekkers en hun mutanten, evenals virulentie infecteren bij muizen. Vergeleken met de huidige modellen, procedures met reproduceerbaarheid plus kloon validatie voor en na infectie kan profiteren van andere onderzoekers in het veld. Visuele demonstratie van dit protocol geeft inzicht in uitgebreide procedures die moeilijk te begrijpen of te begrijpen zijn door alleen te lezen.

Begin met het kweken van enkele crossover, recombinant kolonies in Pseudomonas Isolation Broth, of PIB. Inenting en streep 10 microliter van elke cultuur op voorverwarmde PIA-platen, aangevuld met 10%sucrose. Dan incubeer de platen 's nachts op 37 graden Celsius.

Verwijder de platen de volgende dag uit de couveuse en inspecteer ze op groei. De sacharosebestendige kolonie moet dubbele crossover recombinanten zijn. Gebruik steriele tandenstokers om ten minste 20 kolonies te patchen op voorverwarmde platen van PIA, PIA aangevuld met 10%sucrose en PIA aangevuld met carbenicilline.

Broed de platen 's nachts en onderzoeken ze voor de groei op de volgende dag. Echte dubbele crossover recombinanten zullen carbenicilline-gevoelig en sacharose-resistent zijn. Scherm 10 tot 20 kolonies voor verwijdering, met behulp van kolonie PCR.

Pak de groei van een vermoedelijke dubbele crossover recombinant met een steriele tandenstoker en schort het op in 50 microliters van PBS. Kook de suspensie 100 graden Celsius gedurende 10 minuten. Centrifuge het drie minuten op 13.000 keer G en leg het op ijs.

Voer vervolgens PCR uit volgens de aanwijzingen van het manuscript. Zodra PCR klaar is, voer Agarose gel elektroforese op de producten. Kleinere versterkingsproducten geven kolonies aan waarin het interessegebied is verwijderd.

Ontdooi op de ochtend van injecties de cryovials van bacteriële cellen bij vier graden Celsius gedurende drie tot vier uur. Houd de flesjes op ijs na het ontdooien en injecteer de muizen binnen twee uur. Breng de inhoud van elke cryovial over naar een nieuwe twee milliliter buis en centrifugeer het op 4, 500 keer G gedurende 10 minuten.

Gooi de supernatant weg en hang de celpellet opnieuw op in één milliliter PBS. Herhaal de centrifugatie en schort de cellen in PBS opnieuw op tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 keer 10 tot de negende kolonievormende eenheden per milliliter. Neem drie monsters van de laatste suspensie van elke stam om concentratie, genotype en fenotype te valideren.

Voor elke stam, aliquot 1,5 milliliter van de cel suspensie in een twee milliliter buis en bereid de PBS voor controle injecties. Verzamel de muizen en materialen die nodig zijn voor injecties in een steriele dierlijke chirurgische ruimte en veeg alle oppervlakken met ontsmettingsdoekjes voordat u begint. Draag twee paar latex handschoenen om het risico op punctie te beperken, indien gebeten, evenals een labjas, veiligheidsbril en gezichtsmasker.

Haal de muis uit de kooi en weeg hem, waardoor de staart wordt gemerkt met permanente markering voor het volgen na de injectie. Open een nieuwe een milliliter spuit met een 27-meter naald en het opstellen van 200 microliter van steriele PBS. Pak de muis achter zijn oren, met behulp van de duim en wijsvinger, en knijp om een huidplooi te creëren op de nek.

Zet vervolgens de staart in de palm met behulp van de pink om de muis plat en onbeweeglijk te houden. Plaats de naald in een hoek van 30 graden in de buikholte links of rechts van de middellijn. Til de naald iets op om ervoor te zorgen dat deze niet in organen is ingebracht.

Injecteer vervolgens langzaam de PBS en trek de naald terug. Een bolus op de injectieplaats is typisch. Plaats de naald in de aangewezen slijpcontainer en verplaats de muis naar een aparte kooi.

Herhaal de procedure met de volgende muis en nadat alle muizen uit de ene kooi zijn geïnjecteerd, verplaats ze terug naar hun oorspronkelijke kooi. Na het injecteren van de controlegroep, injecteer de testgroepen met dezelfde procedure. Zodra alle injecties zijn voltooid, breng de muizen terug naar de behuizing en maak het werkgebied schoon met ontsmettingsdoekjes.

Om de dieren in beeld te brengen, bereidt u het beeldsysteem voor door de cameraparameters in te stellen en het podium te verwarmen. Stel de zuurstofstroom in op 1,5 liter per minuut en isoflurane op 3,5% en beweeg de muis naar de verdovingskamer, vervolgens naar het temperatuur gestabiliseerde stadium, na anesthesie. Plaats de muis op zijn rug met uitgestrekte armen en pas een neuskegel aan voor toediening van 2,5% isoflurane tijdens beeldvorming.

Sluit de deur en maak bioluminescente beelden en röntgenfoto's van de muis. Wanneer de beeldvorming is voltooid, breng de muis terug naar zijn kooi en controleer deze. Het moet binnen drie tot vijf minuten weer bij bewustzijn komen.

De gerichte genomische deleties werden bevestigd door kolonie PCR met specifieke primers die de regio van belang versterkt. De kolonies met de genomic schrapping opbrengst een kortere band PCR in vergelijking met wilde typekolonies. Intraperitoneale injectie van de verzwakte stam van P aeruginosa, PGN vijf, resulteerde in 0%-mortaliteit, gelijk aan sterfte waargenomen met E.coli BL 21.

Injectie van de ouderstam was echter fataal voor 80% van de muizen. Infectie progressie werd bijgehouden met behulp van bioluminescentie gemarkeerde ouder en verzwakte stammen. De verzwakte stam bleef gelokaliseerd op de injectieplaats tot de bioluminescentie vervaagde, wat waarschijnlijk samenviel met de klaring van de infectie.

De gepresenteerde methode onderzocht alleen de sterfte die door de stam wordt veroorzaakt. Meer diepgaande immunologische en toxicologische aspecten kunnen worden gebruikt om de dynamiek van infectie te bepalen en het eindeffect van de infectie heeft dat niet leidt tot de dood. Het belangrijkste in de procedure is de uitgebreide validatie gedaan, tussen verschillende stappen van de eerste identificatie tot dierproeven.

Het missen van bepaalde validatiestappen kan mogelijk leiden tot een verkeerd resultaat, omdat de geteste stammen een mutatie en selectie kunnen ondergaan of besmet kunnen raken. Met de ontwikkeling van deze twee technieken, denken we dat dit onze onderzoekers op het gebied van infectie immunologie in staat zal stellen om effectiever te onderzoeken hoe krachtige pakketinteractie leidt tot het extreme fenotype, sepsis en mortaliteit. De impact van verschillende voedingsstoffen op varianten kan worden vergeleken door middel van grootteding van bacteriën.