Name: Experimentele aanpak voor het onderzoeken van leptine signalering in de carotis lichamen en de effecten ervan op de controle van de ademhaling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Ontdek hoe leptine signalering in de carotis lichamen de hypoxische ventilatoire respons reguleert bij muizen. Deze methode combineert chirurgische denervatie met adenovirus transfectie om ademhalingsregulatie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025

Alle experimentele protocollen zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (MO18M211).
1. leptine infusie
Opmerking: Om het effect van leptine op de ademhaling te onderzoeken, hebben we leptine subcutaan geïnfundeerd in Lean C57BL/6J muizen door een osmotische pomp om circulerende leptine niveaus te verhogen tot die waargenomen bij zwaarlijvige muizen.
<ol><li>
Osmotische pomp voorbereiding
	<ol>
<li>Weeg de lege pomp af om het nettogewicht van de geladen oplossing te controleren.</li>
		<li>Voeg leptine (5 mg/mL) toe aan de osmotische pomp (1 μL/h gedurende 3 dagen). Vul de pomp met een kleine spuit (1 mL). Na het vullen, sluit de pomp met de meegeleverde botte getipt 27 gauge vulbuis. Opmerking: De spuit en de bijgevoegde buis moeten vrij zijn van luchtbellen.</li>
		<li>Weeg de pomp na het vullen opnieuw af om het nettogewicht van de oplossing te controleren.</li>
		<li>
Plaats de leptine pomp subcutaan in het interscapulaire gebied. Opmerking: als u de infusie onmiddellijk wilt starten, inbroed dan de voorgevulde pomp in de steriele zoutoplossing bij 37 °c gedurende ten minste 4 tot 6 uur (bij voorkeur 's nachts).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hypoxische Ventilatorrespons (HVR)
Opmerking: Thermoneutrale voorwaarden elimineren stressvolle factoren opgelegd door koele omgevingstemperatuur en aanzienlijk wijzigen metabolisme in muizen. Daarom moeten alle Ademhalings metingen worden uitgevoerd aan de thermoneutrale condities (t = 30 °C) met behulp van een neonatale incubator12 (Figuur 1a). Het hele lichaam plethysmografie kamer (WBP) is gebruikt voor alle metingen. Alle dieren moeten worden geacclimeerd aan de barometrische plethysmografie kamer en aan een Sham nek kraag voor daaropvolgende Pulse oximetrie opname voor 3-5 dagen voorafgaand aan de HVR metingen. HVR wordt geregistreerd tussen 10 uur en 5 uur. HVR wordt onderdrukt tijdens de slaap, daarom kan het afzonderlijk worden gemeten tijdens de slaap en rustige wakkerheid13. Om de specifieke slaap-waak fase van het dier tijdens de HVR-meting te waarborgen, moeten de EEG/EMG-elektroden worden geïmplanteerd als een EEG/EMG-Head zoals eerder beschreven14. Dieren moeten worden toegestaan om ten minste 72 uur na de hoofdsteun te herstellen. Slaap fasering moet worden uitgevoerd in 5 s tijdperken. NREM slaap wordt herkend door de langzame Golf EEG activiteit bezetten groter dan 50% van het tijdperk. Stille wakkerheid manifesteert zich door de alpha EEG activiteit in de afwezigheid van bewegingen. REM-slaap wordt geïdentificeerd door de overheersende Alfa-en theta EEG-activiteit in de aanwezigheid van een verminderde spierspanning op EMG. Normaalgesproken wordt REM-slaap niet waargenomen tijdens de HVR-gasuitdagingen.
<ol><li>Het HVR-opname Protocol
	<ol>
<li>Gebruik de WBP-kamer van de volgende maat: inwendige diameter van 80 mm, hoogte van 50,5 mm en volume van 0,4 L. De WBP kamer bestaat uit twee kamers, verzegelde en referentie kamers, en een cirkelvormig platform om de muis14 (Figuur 1B) te plaatsen. Instroom en uitstroom in de kamer worden gecontroleerd door positieve en negatieve druk bronnen die de atmosferische druk behouden. Dit besturingselement creëert een gestage bias flow in de kamer en voorkomt CO2 retentie. Voor meer informatie over de WBP-set-up, zie Hernandez en collega's15.</li>
		<li>Meet de temperatuur binnen de kamer en de relatieve vochtigheid in de ruimte voordat u de muis in de WBP plaatst.</li>
		<li>Meet het lichaamsgewicht en de rectale temperatuur.</li>
		<li>Plaats de Oximeter kraag rond de nek van de muis (het gebied moet eerder geschoren zijn).</li>
		<li>Plaats de muis in de WBP en zorg ervoor dat de kamer volledig is afgesloten om luchtlekkage te voorkomen.</li>
		<li>Wacht ongeveer 30 minuten totdat de muis stil is en de kamer zich op een constant volume bevindt.</li>
		<li>Normoxia: na 30 min, als de muis stil is, beginnen met het opnemen van de Ademhalings signalen en perifere zuurstofverzadiging (SpO2) bij normoxia fase (21% fio2 bij 1 ATM van druk) gedurende 20 min, met behulp van labchart 7 Pro (versie 7,2).</li>
		<li>Hypoxie: na 20 min van rustige normoxia, beginnen met het opnemen van de eerste cyclus van acute hypoxie en SpO2. Voor hypoxie fase, bloot de dieren aan een constante gemengde gasstroom samengesteld door 10% O2 en 3% co2 voor 5 min.<ol>
<li>Tijdens de eerste 30 sec van hypoxie stroomt het gemengde gas door de kamer via 2 kleine zijpoorten aan de basis waardoor de FiO2 kan dalen van 21% (bij 1 ATM van druk) tot 10%.</li>
			<li>Na de eerste 30 s sluit u een van de kleine zijpoorten van de WBP-kamer en houdt u de opname bij de constante hypoxie bij 10% FiO2 gedurende 5 minuten. Opmerking: het mengsel van 10% O2 en 3% co2 bij hypoxie wordt gebruikt om eucapnea11te handhaven.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Na de 5 min van hypoxie, de muis weer blootstellen aan kamerlucht (21% fio2 bij 1 ATM van druk) door het omschakelen van de instroom bron.</li>
		<li>Wacht ten minste 30 minuten tot de volgende normoxia-opname om te herstellen van de vorige hypoxische blootstelling om te voorkomen dat de ventilatoren roll-off fenomeen (dat wil zeggen, centrale onderdrukking van de ademhaling tijdens hypoxie16). Opmerking: Herhaal normoxie/hypoxie cycli driemaal in elke muis om de reproduceerbaarheid van de metingen te verzekeren. In onze ervaring, extra (meer dan 3 keer op een bepaalde dag) hypoxische blootstellingen moeten worden vermeden, vanwege de beemingsadaptatie (de roll-off fenomeen).</li>
		<li>Kalibreer aan het einde van het experiment de WBP-kamer (met de muis is nog steeds binnen) door 1 mL kamerlucht 3 keer te injecteren met een injectiespuit die is aangesloten op een van de kleine zijpoorten aan de basis van de kamer.</li>
		<li>Meet de temperatuur in de kamer opnieuw met het dier erin.</li>
		<li>Open de kamer en meet de rectale temperatuur van de muis voordat u deze terugplaatst in de huis kooi.</li>
	</ol></li>
	<li>HVR-berekening
	<ol>
<li>Digitaliseer alle signalen voor HVR-berekening op 1.000 Hz (bemonsteringsfrequentie per kanaal). Opmerking: WBP Tidal volume analyse wordt uitgevoerd in Lab Chart 7 op basis van Drorbaugh en Fenn vergelijking17. De vereiste variabelen bestaan uit de rectale temperatuur van de muis en de kamertemperatuur (voor en na de HVR-meting), de relatieve vochtigheid en de gasconstante van de kamer. Deze constante wordt verkregen uit de WBP druk afbuiging na de 1 mL lucht injecties in de kalibratie fase. Voor meer informatie, zie Hernandez en collega's15.</li>
		<li>Na het berekenen van de vergelijking Drorbaugh en Fenn, vermenigvuldigt u het kamer kanaal van het getijden volume (VT) met de constante.</li>
		<li>
Selectie van opnames voor de analyse
		<ol>
<li>Normoxia: Selecteer alleen gedeelten van gestage ademhaling met constant getijden volume. Vermijd secties in de nabijheid van muisbewegingen.</li>
			<li>Hypoxie: gooi de eerste 30 s weg wanneer O2 niveaus afnemen van 21% naar 10%, selecteer secties van 30 s tot 2 min van 10% O2 blootstelling (een 90 s interval). Selecteer binnen dit interval alleen secties met constante ademhaling met constant getijden volume. Vermijd secties in de nabijheid van muisbewegingen. De analyse is betrouwbaar als ten minste 10 s van hypoxie is geselecteerd in elke cyclus. Opmerking: De perifere component van chemoreflex, bestuurd door CB, overheerst tijdens de eerste 1-2 min van blootstelling16,18,19. Tijdens de tweede fase, tussen 2 min en 5 min hypoxische blootstelling, spelen zowel het perifere als het centrale onderdeel een rol. Ten slotte wordt de derde fase, > 5 min, gekenmerkt door hypoventilatie (het roll-off fenomeen), voornamelijk bestuurd door centrale chemoreceptors. Onze ervaring leert dat muizen vaak wakker zijn tijdens hypoxische expositie vanwege de handmatige schakelopties in de luchtstroom bron.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereken na de selectie de gemiddelde minuten ventilatie (Ve) bij normoxic en hypoxische condities met behulp van de formule Ve = ademhalingsfrequentie X getijden volume.</li>
		<li>Bereken het gemiddelde SpO2 bij normoxia en hypoxie condities.</li>
		<li>Bereken de HVR handmatig met behulp van de formule HVR = (Ve (10% o2)-ve (21% o2))/(SPO2 (10% o2) – SPO2 (21%o 2)). Opmerking: In C57BL/6J muizen, de osmotische pomp voor leptine infusie kan afbreuk doen aan de nauwkeurige SpO2 signaaldetectie door de nek kraag. In dit geval wordt HVR berekend op basis van de FiO2 -waarden bij normoxic en hypoxische condities als HVR = ΔvE /δfio211.</li>
	</ol></li>
</ol>3. carotis Body Denervatie of carotis sinus zenuw dissectie (CSND)
Opmerking: We voerden gecombineerde chirurgische en chemische denervatie een week uit elkaar, omdat chirurgische denervatie alleen niet de hypoxische chemoreflex afschaffen.
<ol><li>
Chirurgische voorbereiding
	<ol>
<li>Voer alle procedures uit voor volwassen mannelijke C57BL/6J-muizen. Steriliseer alle chirurgische instrumenten. Gebruik steriele chirurgische handschoenen, spuiten en met katoen getipt applicators.</li>
		<li>Anesthetize mannelijk C57BL/6j muizen met 1-2% Isofluraan met behulp van een neuskegel en plaats een warme deken om hypothermie te voorkomen. Isofluraan wordt zorgvuldig getitreerd om de ademhalingsfrequentie bij 1 Hz (60 ademhalingen/min) te handhaven. De toereikendheid van de anesthesie voorafgaand aan het starten van operaties zal worden beoordeeld door de ademhaling frequentie, de afwezigheid van bewegingen en hoorbare geluiden, de afwezigheid van reactie op tactiele stimuli en de forelimb of hindledemaat pedaal terugtrekking reflex.</li>
		<li>Dien buprenorfine (0,05 mg/kg) intraperitoneaal toe om pijn ongemak te voorkomen. Verwijder het haar in het ventrale gebied van de nek en Desinfecteer het gebied met Betadine en alcohol.</li>
		<li>Ter voorkoming van corneale uitdroging, smeer de ogen van de muizen met steriele oftalmische zalf tijdens de anesthesie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CSND-procedures Fase 1: chirurgische denervatie<ol>
<li>Na middenlijn incisie, bloot de bifurcatie van de gemeenschappelijke carotis slagaders door het verwijderen van bindweefsel en vetweefsel.</li>
		<li>Identificeer de hypoglossale zenuw, die meestal zeer prominent, en til het omhoog om de glossopharyngeale zenuw onmiddellijk eronder bloot. Dissect carotis sinus zenuwen bilateraal met behulp van micro veer schaar.</li>
		<li>Sluit de incisie met 6-0 zijde hecht.</li>
		<li>Dien 1 mL normale zoutoplossing subcutaan toe om uitdroging te voorkomen.</li>
		<li>Huis de muizen in een herstel kamer en bewaak hun gedrag elke 15 minuten voor de eerste 1 uur totdat de muizen opnieuw bewustzijn krijgen om borstbeen recumbency te handhaven. Keer de muizen terug naar hun huis kooien nadat ze volledig zijn hersteld. Houd de muizen twee keer per dag in de gaten voor de volgende 3 dagen. Geef extra buprenorfine als muizen tekenen van pijn vertonen (bijv. verminderde eetlust, rusteloosheid). Fase 2: chemische denervatie</li>
		<li>Een week na de operatie, verf de halsslagader met een oplossing van 2% fenol verdund in ethanol op de punten van vertakkingen van de glossopharyngeale zenuw naar de schedel stok van de CB. Dezelfde postoperatieve verzorging moet worden gegeven na de chemische denervatie zoals hierboven beschreven in de chirurgische denervatie sectie. Opmerking: voor een Sham chirurgie groep, dezelfde procedures worden uitgevoerd met uitzondering van de carotis sinus zenuw dissectie.</li>
		<li>Laat de dieren herstellen voor 5-7 dagen vóór HVR metingen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. expressie van LepRb in het CB met behulp van een adenovirale vector (ad-leprb) versus controle (ad-lacz)
<ol><li>
Ad-LepRb en ad-lacz schorsing
	<ol>
<li>Transfect de muizen met adenovirus (ad-LepRb-GFP, 2-5X1010 Pfu/ml voor overexpressie, ad-lacz, 1 x 1010 Pfu/ml voor controle) naar het CB-gebied.</li>
		<li>Ontdooi de Matrigel matrix door de injectieflacon in ijs in een koelkast van 4 °C 's nachts in te voegen.</li>
		<li>Onderbreek adenovirus voorzichtig in vloeibare Matrigel matrix bij 1:5 (1 μL Matrigel matrix en 4 μL adenovirus bilateraal toegepast).</li>
		<li>Houd virale suspensie altijd op ijs totdat deze in de CB wordt aangebracht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chirurgische voorbereiding
	<ol>
<li>Gebruik dezelfde chirurgische instrumenten als het CSND-protocol.</li>
		<li>Anesthetize leprb-deficiënte db/DB muizen met 2-2.5% Isofluraan met behulp van een neuskegel en plaats de dieren op een warme deken om hypothermie te voorkomen. Isofluraan wordt zorgvuldig getitreerd om de ademhalingsfrequentie bij 1 Hz (60 ademhalingen/min) te handhaven. De toereikendheid van de anesthesie zal worden beoordeeld door de ademhaling frequentie, de afwezigheid van bewegingen en hoorbare geluiden, de afwezigheid van reactie op tactiele stimuli en de forelimb of hindledemaat pedaal terugtrekking reflex.</li>
		<li>Toediening van buprenorfine (0,05 mg/kg) intraperitoneaal.</li>
		<li>Verwijder het haar in het ventrale gebied van de nek en Desinfecteer het gebied met Betadine en alcohol zoals in het CSND-protocol.</li>
		<li>Ter voorkoming van corneale uitdroging, smeer de ogen van de muizen met steriele oftalmische zalf tijdens de anesthesie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adenovirus behandeling van de CB
	<ol>
<li>Stel CBs bloot zoals beschreven in het CSND-protocol en breng 5 μL van de virale suspensie op bilateraal wijze aan op het CB-gebied.</li>
		<li>Wacht 2-3 min tot de Liquid Matrigel matrix een gel wordt. Na te hebben bevestigd dat de virale suspensie was gecongealed, sluit de incisie met 6,0 zijde hecht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Na de operatie
	<ol>
<li>Huis de muizen in een herstel kamer en bewaak hun gedrag elke 15 minuten voor de eerste 1 uur totdat de muizen opnieuw bewustzijn krijgen om borstbeen recumbency te handhaven. Keer de muizen terug naar hun huis kooien nadat ze volledig zijn hersteld. Houd de muizen twee keer per dag in de gaten voor de volgende 3 dagen. Geef extra buprenorfine als muizen tekenen van pijn vertonen (bijv. verminderde eetlust, rusteloosheid).</li>
		<li>Dien buprenorfine (0,05 mg/kg) intraperitoneaal toe om pijn ongemak te voorkomen tijdens de postoperatieve periode.</li>
		<li>Meet HVR 9 dagen na de adenovirus transfection.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>O'donnell, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+prevents+respiratory+depression+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Leptin prevents respiratory depression in obesity.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, 1477-1484 (1999).</li>
<li>Polotsky, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+gender+exacerbates+respiratory+depression+in+leptin-deficient+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).</li>
<li>Bassi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+leptin+replacement+enhances+chemorespiratory+responses+in+leptin-deficient+mice+independent+of+changes+in+body+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Pflu%CC%88gers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).</li>
<li>Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+the+respiratory+activity+of+leptin+at+the+level+of+the+solitary+tract+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).</li>
<li>Considine, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+immunoreactive-leptin+concentrations+in+normal-weight+and+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans.</a> New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).</li>
<li>Maffei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+levels+in+human+and+rodent%3A+measurement+of+plasma+leptin+and+ob+RNA+in+obese+and+weight-reduced+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects.</a> Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).</li>
<li>Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+serum+leptin+with+hypoventilation+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity.</a> Thorax. 57, 75-76 (2002).</li>
<li>Berger, S., Polotsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+Leptin+Resistance+in+the+Pathogenesis+of+Obstructive+Sleep+Apnea%3A+A+Possible+Link+to+Oxidative+Stress+and+Cardiovascular+Complications%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947(2018).</li>
<li>Ribeiro, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+blunts+the+effects+of+leptin+on+ventilation+and+on+carotid+body+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity.</a> The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+signaling+in+the+carotid+body+regulates+a+hypoxic+ventilatory+response+through+altering+TASK+channel+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression.</a> Frontiers in Physiology. 9, 249(2018).</li>
<li>Caballero-Eraso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+acts+in+the+carotid+bodies+to+increase+minute+ventilation+during+wakefulness+and+sleep+and+augment+the+hypoxic+ventilatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response.</a> The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).</li>
<li>Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoneutrality+modifies+the+impact+of+hypoxia+on+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).</li>
<li>Polotsky, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+interrupted+leptin+pathways+on+ventilatory+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control.</a> Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).</li>
<li>Pho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+leptin+replacement+on+sleep-disordered+breathing+in+the+leptin-deficient+ob%2Fob+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse.</a> Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).</li>
<li>Hernandez, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+whole+body+plethysmography+system+for+the+continuous+characterization+of+sleep+and+breathing+in+a+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse.</a> Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).</li>
<li>Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+domains+of+the+hypoxic+ventilatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Respiration+Physiology%22%5BJournal%5D)">Time domains of the hypoxic ventilatory response.</a> Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).</li>
<li>Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+barometric+method+for+measuring+ventilation+in+newborn+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A barometric method for measuring ventilation in newborn infants.</a> Pediatrics. 16, 81-87 (1955).</li>
<li>Duffin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+ventilatory+response+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measuring the ventilatory response to hypoxia.</a> The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).</li>
<li>Teppema, L. J., Dahan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ventilatory+Response+to+Hypoxia+in+Mammals%3A+Mechanisms%2C+Measurement%2C+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis.</a> Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).</li>
<li>Nurse, C. A., Fearon, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carotid+body+chemoreceptors+in+dissociated+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture.</a> Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).</li>
<li>Kumar, P., Prabhakar, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+chemoreceptors%3A+function+and+plasticity+of+the+carotid+body%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body.</a> Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).</li>
<li>Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilatory+and+central+neurochemical+reorganisation+of+O2+chemoreflex+after+carotid+sinus+nerve+transection+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat.</a> The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen of openbaarmakingen.

De belangrijkste focus van onze studie was het onderzoeken van respiratoire effecten van leptine signalering in de CB. Verschillende protocollen zijn ontwikkeld om de rol van leptine op een mechanistische manier te beoordelen. Eerste, specifieke bijdrage van CB aan de HVR werd geanalyseerd door zorgvuldige kwantificering van de HVR tijdens de eerste 2 min van hypoxische blootstelling. Ten tweede, de relevantie van CB in leptine-gemedieerde up-regulering van de controle van de ademhaling werd onderzocht door twee compleme...

Een adipocyte geproduceerd hormoon leptine handelt in de hypothalamus te onderdrukken van voedselinname en verhoging van de stofwisseling. Studies uitgevoerd in ons laboratorium1,2 en door andere onderzoekers3,4 toonde aan dat leptine verhoogt de hypercapnic ventilatoire respons (HVR) voorkomen van obesitas hypoventilatie in leptine gebrekkige obesitas. Echter, een meerderheid van zwaarlijvige individuen hebben hoge plasma leptine niveaus en demonstreren weerstand tegen de metabole en respiratoire effecten van het hormoon5,6,7,8. Resistentie tegen leptine is multifactoriële, maar beperkte permeabiliteit van de bloed-hersen barrière (BBB) aan leptine speelt een belangrijke rol. Wij stellen voor dat leptine handelt onder BBB in een belangrijk orgaan van perifere hypoxische gevoeligheid, de carotis lichamen (CB), om de ademhaling in zwaarlijvige individuen te verdedigen. CBs Express de lange functionele isovorm van leptine receptor, leprb, maar de rol van CB in de Ademhalings effecten van leptine is niet voldoende opgehelderd9,10.
Het doel van onze methode was om het effect van leptine signalering in de CB op HVR te onderzoeken. Onze redenering was het uitvoeren van (a) verlies van functie-experimenten die leptine in muizen met intact carotis lichamen en denervated carotis lichamen gevolgd door HVR metingen; b) winst van functie-experimenten in db/DB -Muizen zonder leprb, waarin we de HVR op baseline en na uitdrukking van LEPRb uitsluitend in CB hebben gemeten. Het voordeel van onze technieken was dat we al onze experimenten uitgevoerd in ongefixeerde unanesthetized muizen tijdens de slaap en wakkerheid. Vorige onderzoekers ofwel uitgevoerd hun experimenten onder anesthesie9 of niet meten van de effecten van leptine tijdens de slaap10. Daarnaast is onze studie de eerste die gebruik maakt van een unieke winst van functie benadering met selectieve LepRb -expressie in CB zoals hierboven beschreven.
In de brede context, onze aanpak kan worden gegeneraliseerd naar andere receptoren uitgedrukt in CB en hun rol in hypoxische gevoeligheid. Onderzoekers kunnen een ligand aan een receptor van belang en meet de HVR op baseline en na CB denervation. Als een complementaire aanpak kan een receptor van belang worden overuitgedrukt in CB en HVR metingen kunnen worden uitgevoerd voor en na overexpressie met behulp van onze technologie beschreven in dit manuscript.

<table><tbody><tr><td>1 mL Insulin Syringes</td><td>BD Biosciences</td><td>309311</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7.4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Ad-Lacz</td><td>Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago)</td><td></td><td>1 x 1010 pfu/mL</td></tr><tr><td>Ad-LepRb-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>ADV-263380</td><td>2-5 x 1010 pfu/mL</td></tr><tr><td>Anesthetic cart</td><td>Atlantic Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine (Buprenex)</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td>0,3 mg/mL</td></tr><tr><td>C57Bl/6J</td><td>Jackson laboratory</td><td>000664</td><td>Muisensoort</td></tr><tr><td>Cotton Gauze Sponges</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>db/db</td><td>Jackson laboratory</td><td>000697</td><td>Muisensoort</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Vetone</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Lab Chart</td><td>Data Science International (DSI)</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spring Scissors</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ox Plus</td><td>STARR Life Sciences Corp.</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Mouse Ox Plus Collar Sensor</td><td>STARR Life Sciences Corp.</td><td>015022-2</td><td>Medium Collar Clip Special 7&rdquo;</td></tr><tr><td>Mouse Whole Body Plethysmography Chamber</td><td>Data Science International (DSI)</td><td>PLY3211</td><td></td></tr><tr><td>Ohio Care Plus Incubator</td><td>Ohmeda</td><td>HCHD000173</td><td></td></tr><tr><td>Operating Scissors</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>501753-G</td><td>Recht</td></tr><tr><td>Osmotische pomp</td><td>Alzet</td><td>1003D</td><td>1 &mu;L/h, 3 dagen</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Muis Leptine-eiwit</td><td>R&amp;D systems</td><td>498-OB-05M</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>Saline</td><td>RICCA Chemical</td><td>7210-16</td><td>0,9% natriumchloride</td></tr><tr><td>Steriele chirurgische hechtdraad</td><td>DemeTech</td><td>DT-639-1</td><td>Zijde, maat 6-0</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Innovative Calibration Solutions (INNOCAL)</td><td>EW 20250-91</td><td></td></tr></tbody></table>

experimentele aanpak voor het onderzoeken van leptine signalering in de carotis lichamen en de effecten ervan op de controle van de ademhaling

Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing

Een adipocyte-geproduceerde hormoon leptine is een krachtige respiratoire stimulerende middelen, die een belangrijke rol kunnen spelen bij het verdedigen van de ademhalingsfunctie bij obesitas. De carotis lichamen (CB), een belangrijk orgaan van perifere hypoxische gevoeligheid, uitdrukken de lange functionele isovorm van leptine receptor (leprb) maar de rol van leptine signalering in de controle van de ademhaling is niet volledig opgehelderd. We onderzochten de hypoxische ventilatorrespons (HVR) (1) in C57BL/6J-muizen voor en na leptine-infusie bij baseline en na de denervatie van CB; (2) in Leprb-deficiënte zwaarlijvige db/DB muizen bij baseline en na Leprb overexpressie in CBs. In C57BL/6J muizen, leptine verhoogd HVR en effecten van leptine op HVR werden afgeschaft door CB denervation. In db/DB -muizen verhoogde de leprb -expressie in CB de HVR. Daarom concluderen we dat leptine in CB werkt om reacties op hypoxie te vergroten.

Continue infusie van leptine significant toegenomen HVR in Lean C57BL/6J muizen van 0,23 tot 0,31 mL/min/g/ΔFiO2 (P < 0,001, Figuur 2)11. CSND afgeschaft de leptine-geïnduceerde toename in HVR (Figuur 2), terwijl geen verzachtende effecten van csnd op HVR werden waargenomen in Sham chirurgie groep na leptine infusie.
LepRb -expressie in de CB van leprb-deficiën...

Onze studie richt zich op de effecten van leptine signalering in carotis lichaam (CB) op de hypoxische-ventilatoire respons (HVR). We uitgevoerd ' verlies van functie ' experimenten meten van het effect van leptine op HVR na CB denervatie en ' winst van functie ' experimenten meten HVR na overexpressie van de leptine receptor in CB.

Experimentele aanpak voor het onderzoeken van leptine signalering in de carotis lichamen en de effecten ervan op de controle van de ademhaling

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The ...

Ons protocol kan worden gebruikt om de ademhalingseffecten van leptine op het halsslagaderlichaam in de perifere chemoreflex ademhalingscontrole en fysiologische reacties op hypoxie te onderzoeken. We kunnen ook de effecten van verlies en winst van halsslagader lichaam functie met behulp van chirurgische en chemische denervation en adenovirus transfectie respectievelijk. Voor het begin van de procedure, meet de temperatuur in een op maat gemaakte hele lichaam plasthemagrophy kamer, en meet de relatieve vochtigheid van het lab.Meet vervolgens het lichaamsgewicht en de rectale temperatuur van de experimentele muis. Plaats de muis in de kamer en plaats een oximeter kraag rond de geschoren hals van het dier. En zorg ervoor dat u de kamer volledig afsluit om luchtlekkages te voorkomen.Wacht ongeveer 30 minuten tot de muis stil is en de kamer zich op een constant volume bevindt. Voordat u begint met het registreren van de ademhalingssignalen en perifere zuurstofverzadiging bij normoxie. Stel het dier na 20 minuten normoxie bloot aan een constante gemengde gasstroom van 10% zuurstof en 3% kooldioxide.En begin met het registreren van de eerste cyclus van acute hypoxie in ademhalingssignale

experimental-approach-to-examine-leptin-signaling-carotid-bodies-its

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het doel is om een ​​nieuwe methode, ademhaling-control elektrische stimulatie (BreEStim) voor het beheer van neuropathische pijn en spasticiteit.

Ademhaling-gecontroleerde elektrische stimulatie (BreEStim) voor beheer van neuropathische pijn en spasticiteit

Afferent vagale signalering draagt belangrijke informatie over naar het centrale zenuwstelsel vanuit receptoren in organen van de buik en borstkas. De nodose ganglia van de nervus vagus bevatten veel soorten receptoren die vagale activiteit moduleren. Dit protocol beschrijft een methode voor lokale injecties van neurochemicaliën in de nodose ganglia.

Een methode van knobbelige ganglia Injectie in Sprague-Dawley rat

De centrale ademhalingsaandrijfmechanisme bevindt zich in de hersenstam. Spontane ademhalingsmotorische output van een geïsoleerde hersenstam-ruggenmerg wordt geregistreerd door het plaatsen van een elektrode op de vierde ventrale wortel. Deze experimentele aanpak is waardevol voor farmacologische onderzoeken of de beoordeling van ademhalingsproblemen en genetische manipulaties op ritmisch motoriek gedrag.

Elektrofysiologie op Geïsoleerde hersenstam ruggenmerg voorbereidingen van pasgeboren knaagdieren Hiermee Neural Network Respiratory Output Opname

Hier presenteren we een protocol gebaseerd op immunohistochemische detectie van het c-FOS-eiwit, een klassieke techniek die wordt gebruikt voor de identificatie van neuronale populaties die betrokken zijn bij specifieke fysiologische reacties in vivo en ex vivo.

De c-FOS Protein Immunohistologische Detection: Een handig hulpmiddel als een marker van Central Pathways betrokken bij specifieke fysiologische reacties<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; Ex Vivo</em

RAPID bloed verwerkingsmethode kan worden gebruikt bij mensen en hogere opbrengsten peptide niveaus en maakt de beoordeling van de juiste moleculaire vorm. Daarom zal deze methode een waardevol instrument in peptide onderzoek.

Een snelle methode voor bloedverwerkende de opbrengst aan plasma peptide niveaus in bloed verhogen

De incidentie van obesitas stijgt en verhoogt het risico van chronische longziekten. De onderliggende mechanismen en preventieve strategieën, welomschreven dier vast te stellen modellen nodig zijn. Hier bieden wij drie methoden (glucose-tolerantie-test, lichaam plethysmography en fixatie van de Long) te bestuderen van het effect van obesitas op pulmonaire resultaten in muizen.

Intraperitoneaal Glucose tolerantie Test, meting van de longfunctie, en fixatie van de longen om te bestuderen van de gevolgen van obesitas en verminderde stofwisseling op pulmonaire resultaten

Ongebreidelde luchtdruk wordt gebruikt om het patroon van het inademen van wakkere muizen te kwantificeren. We laten zien dat 15 s segmenten onder een gestandaardiseerd protocol vergelijkbare waarden weergeven als een langere duur van stille ademhaling. Deze methodologie maakt het ook mogelijk voor de kwantificering van apneu en verhoogde ademhalingen tijdens het eerste uur in de kamer.

Methode om het patroon van de ademhaling in senescente muizen te verkrijgen door ongebreidelde barometrische plethysmografie

De baroreflex is een hartslagregulatiemechanisme door het autonome zenuwstelsel als reactie op bloeddrukveranderingen. We beschrijven een chirurgische techniek om telemetriezenders te implanteren voor continue en gelijktijdige meting van elektrocardiogram en bloeddruk bij muizen. Dit kan spontane baroreflexgevoeligheid bepalen, een belangrijke prognostische marker voor hart- en vaatziekten.

Implantatie van gecombineerde telemetrische ECG- en bloeddruktransmitters om spontane baroreflexgevoeligheid bij bewuste muizen te bepalen

Hier presenteren we een protocol om specifieke hypothalamische celsubtypen in cultuur te laten groeien. De cellen kunnen worden geselecteerd op basis van opportune / unieke membraanmarkers en worden gebruikt in vele toepassingen, waaronder immunofluorescentie, elektrofysiologische en biochemische assays.

Isolatie van gerichte hypothalamus neuronen voor studies van hormonale, metabole en elektrische regulatie

Dit document beschrijft hoe u continue-stroom hypoxie kamers te gebruiken om atmosferen met bepaalde concentraties van O...

Het creëren van Defined Gasvormige omgevingen om de gevolgen van hypoxie Studie naar<em&gt; C. elegans</em

Ontdek hoe leptine signalering in de carotis lichamen de hypoxische ventilatoire respons reguleert bij muizen. Deze methode combineert chirurgische denervatie met adenovirus transfectie om ademhalingsregulatie te bestuderen.

Experimentele aanpak voor het onderzoeken van leptine signalering in de carotis lichamen en de effecten ervan op de controle van de ademhaling (Video) | JoVE Journal

Experimentele aanpak voor het onderzoeken van leptine signalering in de carotis lichamen en de effecten ervan op de controle van de ademhaling

Meer video's verkennen