Fibroblast-afgeleid 3D-matrix systeem dat van toepassing is op endotheliale buis vorming assay
26 december 2019
Het doel van deze methode is om fibroblast-afgeleide 3D-matrices te verkrijgen als een natuurlijke steiger voor volgende cellulaire assays. Fibroblasten worden in een voorbehandelde kweek plaat geseeid en gestimuleerd met ascorbinezuur voor matrix generatie. Matrices zijn decellularized en geblokkeerd voor de kweek van relevante cellen (bijv. endotheel cellen).
Dit protocol maakt het mogelijk om verschillende soorten culturen te zien en hun interacties met extracellulaire matrix te observeren. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat de matrix die u verkrijgt wordt geregenereerd door fibroblast en het zal vrij gelijkaardig zijn aan de matrix die in vivo wordt gegenereerd. Wij zijn van mening dat deze ziekte niet relevant zijn bij het gebruik van fibroblast verkrijgen van het bakken van gerechten.
Het vaststellen van een matrix uit deze cellen zou ons kunnen verlichten hoe het kan leiden, bijvoorbeeld, aanhoudende situatie. Deze methoden kunnen ook worden toegepast op bijvoorbeeld fysieke studies aan overlevenden uit matrix proprieties. Visualisatie van dit protocol is het belangrijk om een pipetting techniek van de stappen die je moet regent observeren.
Bij het uitproberen van deze methoden voor de eerste keer zal het waarschijnlijk meer tijd in beslag nemen dan verwacht. Ons advies is om zoveel mogelijk van tevoren voor te bereiden en duurperiodes te gebruiken om je klaar te maken voor volgende stappen. Begin met het bereiden van 0,2% gelatine, 1%glutaraldehyde en een molaire ethanolamine oplossingen volgens de handschrift richtingen.
Zorg ervoor dat elke oplossing voor gebruik door een filter van 0,22 micrometer wordt uitgevoerd. Bereid vervolgens ascorbinezuur en lyse buffer. Verdun de PBS pen-strep zoals beschreven in het manuscript en bereid DMEM voor met 10%FBS.
Bereid warmte gedenatureerde 2%BSA door het toevoegen van 2 gram BSA tot 100 milliliter steriel water en opwarming in een kokend water bad gedurende zeven minuten. Dan, vul FBS met penicilline, streptomycine, gentamicine, en amphotericine B.Culture recombinant telomeren doorfecteerde vereeuwigd menselijke voorhuid fibroblasten en DMEM met 10%FBS en onderhouden ze op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Om de primaire fibroblastcultuur vast te stellen, snijd de weefselmonsters in kleine stukjes van ongeveer twee tot drie milliliter blokjes en zaad ze in FPS met een hoge concentratie van antibiotica.
Wanneer de eerste fibroblasten verschijnen, vervangt u het medium door FBM-medium voor celonderhoud. Voeg twee milliliter van 0,2% gelatine oplossing aan elke put van een zes-put plaat en uitbroeden gedurende een uur voor 37 graden Celsius of 's nachts op vier graden Celsius. Na de incubatie, aspiraat de gelatine en was elk goed met twee milliliter PBS.
Voeg twee milliliter van 1% glutaraldehyde toe aan elke put en broed de plaat dertig minuten lang op kamertemperatuur uit, waardoor de gelatine wordt gekruist. Spoel de glutaraldehyde aan en was de putten vijf minuten in twee milliliter PBS. Om de resterende glutaraldehyde te blokkeren, voeg twee milliliter van een molaire ethanolamine toe en ontcubeer de plaat dertig minuten bij kamertemperatuur.
Aspirate de ethanolamine en herhaal de wasbeurten met PBS. Voeg een milliliter DMEM met 10% FPS. Als het medium onmiddellijk roze wordt, verwijder het, was de putten een keer met twee milliliter PBS en voeg nog een milliliter DMEM toe.
Zaad een milliliter fibroblast suspensie met 5 x 10 tot de vijfde cellen in elke put en cultuur de cellen tot 100% samenvloeiing wordt bereikt. Verwijder vervolgens het medium en vervang het door DMEM met 10%FBS en 50 microgram per milliliter ascorbinezuur. Vervang het medium om de twee dagen gedurende zes dagen.
Twee dagen na de laatste ascorbinezuurbehandeling verwijder het medium en was de putten met twee milliliter PBS. Voeg na de wasbeurten langzaam een milliliter voorverwarmde lysebuffer toe en ontcued de plaat vijf tot tien minuten bij kamertemperatuur tot de fibroblasten zijn gelyseerd. Zonder het verwijderen van de lysis buffer, zorgvuldig twee milliliter PBS toe te voegen aan elke put en vervolgens aanzuigen ongeveer 2,5 milliliter.
Herhaal dit proces twee keer voor een totaal van drie wasbeurten. Voeg na de laatste wasbeurt twee milliliter PBS toe met penstropt. Verzegel de plaat met folie en houd deze maximaal drie maanden op vier graden Celsius.
Kweek HUVEC cellen en EMB-2 met 2%FBS tot maximale samenloop. Vervang vervolgens het medium door EBM-2 zonder FBS gedurende acht uur. Om de matrices voor te bereiden op celzaaien, verwijder ze uit de koelkast en laat ze op kamertemperatuur gedurende een uur.
Blokkeer de matrices door twee milliliter warmtegedenatureerde 2%BSA toe te voegen en broed ze een uur lang uit bij 37 graden Celsius. Vervolgens, aspirate de BSA en was ze met twee milliliter PBS. Zaad 2 x 10 tot de vijfde HUVEC cellen aan elke put van de plaat bedekt met fibroblast-afgeleide matrices.
Incubeer de cellen op 37 graden Celsius gedurende 16 uur en bestudeer de buisachtige structuren onder een standaard heldere veldmicroscoop bij 20-40x vergroting. Dit protocol werd gebruikt om de invloed van PDGF-behandeling op fibroblast-afgeleide matrixvorming te onderzoeken. De BGH derde fibroblasten die werden geïncubeerd met PDGF toonde een meer uitgelijnde celverdeling in matrices dan die geïncubeerd zonder PDGF.
Collageen 1 en fibronectine eiwitexpressie werd verhoogd in matrices afgeleid van PDGF-gestimuleerde fibroblasten en bijgevolg werd de matrixdikte verhoogd. Bovendien tonen directionaliteitsytogrammen aan dat collageen 1 en fibronectin parallelle patronen vertonen. Toen HUVEC cellen werden gezaaid op gedecellulariseerde matrices afgeleid van PDGF-gestimuleerde fibroblasten ontwikkelden ze meer capillaire-achtige structuren dan onder geen gestimuleerde omstandigheden.
Bevestigend dat matrices afgeleid van PDGF-BB fibroblasten stimuleerden bevorderen endotheelcellen activering. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om oplossingen van tevoren voor te bereiden en ervoor te zorgen dat de cellen klaar zijn voordat u begint. Naast endotheelcellen studies matrices kunnen ook worden gezaaid met epitheliale cellen en de reactie op externe factoren zoals aandoening in de media of cytotoxische drugs kunnen worden waargenomen.
Het genereren van extracellulaire matrix is cruciaal in het ontwerp van tumormacromilieu-experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol maakt de observatie van diverse celculturen en hun interacties met extracellulaire matrices mogelijk. De uit fibroblasten afgeleide matrices vertonen een sterke gelijkenis met die in vivo, waardoor ze een relevant steigerframework bieden voor cellulaire assays.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celcultuur
- Onderzoek naar de extracellulaire matrix
- Fibroblastbiologie
Achtergrond
- Fibroblasten zijn sleutelcellen bij de vorming van extracellulaire matrices.
- Het begrijpen van cel-matrixinteracties is cruciaal voor diverse biologische studies.
- Geregenereerde matrices kunnen inzicht bieden in fysiologische en pathologische condities.
- Deze methode maakt de visualisatie mogelijk van pipettechnieken die essentieel zijn voor het protocol.
Doel van de studie
- Om een natuurlijk steigerwerk te creëren voor cellulaire assays met behulp van fibroblast-afgeleide matrices.
- Om de effecten van deze matrices op verschillende celtypen te onderzoeken.
- Om het begrip van persistente aandoeningen te verbeteren door middel van matrixstudies.
Gebruikte methoden
- Fibroblasten worden uitgezaaid in voorbehandelde kweekplaten.
- Ascorbinezuur wordt gebruikt om de matrixgeneratie te stimuleren.
- Decellularisatie van de matrices wordt uitgevoerd ter voorbereiding op de celkweek.
- Relevante cellen, zoals endotheelcellen, worden gekweekt op de matrices.
Belangrijkste resultaten
- De gegenereerde matrices vertonen gelijkenissen met die in vivo aangetroffen matrices.
- Celinteracties met de matrices kunnen effectief worden geobserveerd.
- De methode biedt een betrouwbare benadering voor het bestuderen van celgedrag in een relevante omgeving.
- Visualisatietechnieken verbeteren het begrip van de uitvoering van het protocol.
Conclusies
- De uit fibroblasten verkregen matrices dienen als effectieve steigers voor cellulaire assays.
- Deze methode kan worden toegepast op diverse biologische studies, inclusief fysische studies naar matrixeigenschappen.
- Het begrijpen van de interacties tussen cellen en de extracellulaire matrix is essentieel voor het vooruitzetten van onderzoek in de celbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Deze methode biedt een fysiologisch relevant 3D-model van de extracellulaire matrix, afgeleid van fibroblasten, wat een meer voorspellende beoordeling van angiogene en tumorigenische fenotypes in discovery-onderzoek mogelijk maakt. Door de in vivo-matrixcompositie en -structuur na te bootsen, ondersteunt het de validatie van targets en mechanistische risicoreductie in drug development-pipelines gericht op oncologie en angiogenese. Het systeem verbetert de translationele continuïteit door de studie van matrix-gemedieerde celgedragingen onder gecontroleerde, reproduceerbare omstandigheden mogelijk te maken.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de effecten van fibroblast-gemedieerde matrixremodellering op de vorming van endotheelbuisjes te onderzoeken als een functionele readout van het angiogene potentieel.
- Operationele waarde: Ondersteunt het testen van hypothesen over pro-angiogene factoren zoals PDGF-BB op de matrixsamenstelling en de daaropvolgende endotheelresponsen.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, gedecellulariseerde matrices met kwantificeerbare depositie van collageen en fibronectine voor consistente zaaiing van endotheelcellen.
- Operationele waarde: Maakt reproduceerbare preparatie van bioactieve scaffolds mogelijk voor high-content imaging van buisvormige structuren onder brightfield-microscopie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert veranderingen in de extracellulaire matrix die worden aangestuurd door kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF) en die tumor-geassocieerde angiogenese bevorderen.
- Operationele waarde: Maakt evaluatie mogelijk van matrix-afhankelijke drug-effecten op de morfogenese van endotheelcellen in een ziekterelevant systeem.
Integratie van Pijplijn en Workflow
De fibroblast-afgeleide matrix-assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van doelwitvalidatie tot fenotypische screening en vormt een brug tussen moleculaire hits en functionele angiogene output voorafgaand aan de preklinische fase.
- Ontdekkingsbiologie: Test hoe activatietoestanden van fibroblasten de matrixarchitectuur moduleren om het gedrag van endotheelcellen te beïnvloeden.
- Screening: Levert kwantitatieve, op beeldvorming gebaseerde resultaten van buikvorming om matrixcondities tussen experimentele groepen te vergelijken.
- Analytica: Maakt richtingshistogramanalyse van de uitlijning van collageen en fibronectine mogelijk om matrixremodelleringsfenotypen te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt fibroblast-afgeleide matrixeigenschappen met angiogene signaleringspaden die relevant zijn voor de modellering van de tumormicro-omgeving.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor het beoordelen van pro- of anti-angiogene verbindingen in een fysiologisch gecontextualiseerde assay.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van angiogene targets door gebruik te maken van een matrix die nauw aansluit bij de in vivo ECM-compositie en -structuur.
- Operationele waarde: Levert een gestandaardiseerde, schaalbare methode voor het genereren van bioactieve 3D-matrices die toepasbaar is op meerdere celtypen en experimentele condities.
- Strategische waarde: Vermindert biologische fout-positieven bij angiogenesis-screening door stroma-gemedieerde matrixeffecten vroeg in de discovery-cascade te integreren.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritisering van angiogene modulatoren op basis van hun effecten op fibroblast-geremoduleerde matrices en downstream endotheliale responsen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire fibroblastkweek, biochemie van de extracellulaire matrix en decellularisatietechnieken.
- Afhankelijk van gecontroleerde stimulatie met ascorbinezuur, crosslinking met glutaraldehyde en ethanolamine-quenching voor matrixstabilisatie.
- Vereist gestandaardiseerde blokkering met hittegedenatureerde BSA en consistente protocollen voor het zaaien van cellen voor reproduceerbare assays voor de vorming van endotheliale buisjes.
- Omvat optimalisatie van de celdichtheid en incubatietijden voor HUVEC of andere endotheliale celtypen om kwantificeerbare angiogene fenotypen te bereiken.
- Beperkt door het tijdintensieve proces van matrixgeneratie (6+ dagen behandeling met ascorbinezuur) en de vereiste voor steriele, gefilterde reagentia om contaminatie te voorkomen.
