Imaging van de humane immunologische SYNAPS

Het doel van de methode is het genereren van een immunologische synaps die een voorbeeld is van cel-naar-cel vervoeging gevormd door een antigeen-presenterende cel en een T-helper lymfocyten. Ons doel is om de eerste stadia van de immuunsynapsformatie vast te leggen en de handel in de T-helper lymfocyten vast te leggen. Deze uiteindelijk zal leiden tot gepolariseerde afscheiding op het immuunsysteem synaps.

De hier gepresenteerde aanpak omvat cel-naar-cel vervoeging, time-lapse acquisitie, breedveld fluorescentie microscopie, en de daaropvolgende beeldverwerking. Dit verbetert de signaal-ruisverhouding van de beelden, verbetert de temporele resolutie en maakt de gelijktijdige verwerving van verschillende fluorchromen in opkomende synaptische conjugaten mogelijk en vermindert fluorescentiebleken. Bovendien is het protocol compatibel met end point cell fixatie protocollen die immunofluorescentie kleuring en analyse mogelijk maken.

Dit protocol is ook compatibel met laser scanning fluorescerende microscopie en andere state-of-the-art microscopie technieken. Het aantonen van de procedure zal Ana Bello, een afgestudeerde student, Alejandro Garrido, een technicus, en Solange Moreno, een afgestudeerde student. Om deze procedure te beginnen, voeg 150 microliters fibronectin toe aan elke put van een acht microwell kamerdia en incubeer het op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten tot een uur.

Na de incubatietijd, aspirate de fibronectine en was elk goed met 200 microliters van PVS gedurende twee minuten met zachte schudden. Herhaal deze wasbeurt nog eens en laat de tweede was in de put. Breng 10 milliliter van een confluent precultuur van Raji cellen over naar een 15 milliliter V-bodembuis.

Centrifuge op 300 keer G en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en zet de celpellet voorzichtig opnieuw op in warm, compleet medium met een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter. Om de Raji cellen te labelen, breng het vereiste aantal cellen in cultuurmedium over naar een twee milliliter buis.

Voor de acht microwell kamer dia, een totaal van 1,6 milliliter cel suspensie nodig is. Voeg cell tracker blauw toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar. Resuspend de cel tracker blauw-gekleurde cellen en breng 200 microliter van de cel suspensie in elke put van de voorbereide fibronectin-gecoate kamer dia's.

Broed de kamerglijbaan op 37 graden Celsius met vijf procent kooldioxide gedurende 30 minuten tot een uur. Schud hierna voorzichtig de kamerdia's op de microscoop om ervoor te zorgen dat de Raji-cellen worden vastgetrokken. Was elke put zorgvuldig met warme, complete cel cultuur medium om overtollige cel tracker blauw te elimineren.

Zorg ervoor dat de Raji cellen worden gehecht aan de onderkant van de platen, en ze vertonen hiaten tussen elkaar en ze zijn niet samenvloeiend. 50-60% van de cel samenvloeiing is geschikt. Voeg eerst Staphylococcal Enterotoxine E toe met een concentratie van één microgram per milliliter aan elke put.

Zorg ervoor dat Raji cellen worden gepulseerd met superantigen anders de T-cel receptor van de Jurkat cellen zal niet herkennen de SCE en synaps zal niet worden gevormd. Broed de kamerglijbaan uit op 37 graden Celsius met vijf procent kooldioxide gedurende ten minste 30 minuten. Vervolgens krijgt u een eerder groeiende cultuur van Jurkat-cellen met een concentratie tussen 1 en 2 miljoen cellen per millimeter.

Observeer de cellen onder een fase contrastmicroscoop en breng de cellen vervolgens over naar een 15 milliliter V-bodembuis. Centrifuge op 300 keer G en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en zet de cellen voorzichtig opnieuw op in warm, compleet kweekmedium met een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter.

Dan handhaven van de Jurkat cellen in de cultuur op 37 graden Celsius met vijf procent kooldioxide tot klaar voor gebruik. Haal de kamerdia's met de cel tracker blauw-gelabelde Staphylococcus Enterotoxin e pulsed-adhered Raji cellen uit de incubator. Zorgvuldig aspirate de cultuur medium van elke put een voor een met een pipet geplaatst in een hoek van de put.

Vervang onmiddellijk het medium door 200 microliter van de geresuspended Jurkat cellen in celkweekmedium. Als een time lapse wordt uitgevoerd, snel overgaan tot de microscoop. Zoek de chambered slide op de microscoop enscenering ober en selecteer een aantal geschikte velden.

Bereid de microscoop en incubatiekamer voor op de beeldvorming. Nadat de Jurkat cellen zijn toegevoegd aan elke put met de Raji cellen, snel lokaliseren van de microwelled kamer dia op de voorverwarmde microscoop geënsceneerde incubator en selecteer een aantal XY posities. Als er alleen een eindpuntexperiment is gepland, broed de kamerglijbaan uit op 37 graden Celsius met vijf procent kooldioxide gedurende één tot twee uur.

Controleer na de cultuurperiode op conjugaatvorming en bevestig vervolgens de conjugaten zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de cellen te repareren, voeg warme RPMI zonder FCS en zachtjes schudden. Aspirate de RMPI en voeg 200 microliters van PFA of geposeerde aceton aan elke put.

Broed de kamerglijbaan 20 minuten op kamertemperatuur of op ijs. Was vervolgens elke put twee keer met PVS en voeg 200 microliters van het blussen oplossing. In deze studie worden Jurkat-Raji immuunsynaps conjugaten gegenereerd en worden de vroege stadia van immunologische synapsvorming goed afgebeeld.

Deze strategie induceert de immunologische synapsvorming en voert tegelijkertijd de time lapse imaging uit. Representatieve synaptische Jurkat-Raji conjugates verkregen uit deze techniek worden hier getoond, met inbegrip van een beeld van het transmissiekanaal, de cel tracker blauw kanaal, en beide kanalen samengevoegd. Sommige synaptische conjugaten kunnen worden gezien, met inbegrip van die die uit slechts één Cel Van De jurkat en verscheidene cellen Raji bestaan, die complexe conjugates zijn.

Afnemende celconcentraties zullen de vorming van complexe cellulaire conjugaten omzeilen, maar bieden mogelijk niet genoeg celconjugaten voor de daaropvolgende analyse van gepolariseerd verkeer, wat op zijn beurt de kans op het vinden en beeld van opkomende synaptische conjugaten zal verminderen. Een deconvolutie van de GFP-CD63 fluorescentie kanaal beelden wordt uitgevoerd met een passende deconvolutie software met behulp van het brede veld optische optie en de juiste optische parameters. Dit gedeconvoluted kanaal werd vervolgens samengevoegd tot de cell tracker blue broad channel.

Er is een verbetering van zowel de signaal-ruisverhouding als de scherpte. Een representatieve Z-stack van een vaste immunologische synapsconjugaat wordt hier getoond. Immunofluorescentie wordt uitgevoerd met behulp van phalloidine om de F-actine, anti-CD63 te visualiseren om de MVB te visualiseren, en anti-gamma-tubuline om MTOC te visualiseren, terwijl de celtracker blauw de Raji-cellen labelde.

De optionele transfixing van de Jurkat cellen zal de visualisatie van het verkeer van de geheime korrels in levende cellen mogelijk maken. Wanneer GFP-CD63 bijvoorbeeld wordt uitgedrukt, kan de beweging van de met GFP-CD63 versierde vikjes worden opgenomen. Het protocol is compatibel met end point fixatie protocollen die verdere immunofluorescentie kleuring protocollen en analyses mogelijk te maken.

Productiveiteit experimentele modellen bestaan die imaging in het immuunsysteem synaps kan vereenvoudigen, maar deze modellen niet emuleren het complexe en onregelmatige oppervlak op de antigeen-presentator cellen die niet-fysiologische interacties kan produceren op het immuunsysteem synaps. De hier beschreven aanpak is geschikt om een aantal biologische complexiteiten die zich voordoen bij de immuunsynaps te reproduceren en te bevestigen. Superantigen is een gevaarlijk toxine dus zorg ervoor dat handschoenen te dragen, en laat de gebruikte tip op de gevaarlijke doos.