Name: Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Leer een orthotopisch borstkankermodel voor triple negatieve borstkanker met GFP-tagging en bioluminescentiebeeldvorming. Deze methode verbetert de detectie van micrometastasen en de evaluatie van therapeutische effectiviteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de steun van de Intramural Research Program van de National Institutes of Health, National Cancer Institute, Bethesda MD, Kanker en Ontsteking Programma, en de Frederick National Laboratory - Small Animal Imaging Program erkennen, Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Maryland, USA.

Analyse van tumorgroei werd uitgevoerd met behulp van protocollen goedgekeurd door het Comité voor de ethiek van dierproeven van het National Cancer Institute en hield zich aan de aanbevelingen van de United States National Research Council's "Guide for the Care and Use of Laboratoriumdieren", de "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" van de United States Public Health Service en het "Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals".
1. Voorbereiding van cellen voor implantatie
OPMERKING: MDA-MB-231 menselijke borstadenocarcinomacellen (commercieel verworven) werden stabiel getransfecteerd met het luciferasegenial III en verbeterde groene fluorescerende eiwit (GFP) marker door lentivirus en gekweekt in aanwezigheid van het selectieantibioticum (puromycine) .
<ol><li>Start de celcultuur met 1 x 106 MDA-MB-231-Luc/GFP cellen en voeg 15 ml voorverwarmde (37 °C) RPMI 1640 medium met 10% foetaal runderserum (FBS) toe in een T75 kweekkolf. Houd de cellen groeien in een temperatuurgecontroleerde celkweekcouveuse op 37 °C met 5% CO2. Vervang het volledige medium minstens 2x per week. LET OP: Verstoor de celgroei niet en blijf de celgroeicondities dagelijks controleren. De cellen moeten worden subcultuur wanneer ze 85%−90% samenvloeiing bereiken om de proliferatiefase te handhaven.</li>
	<li>Een week voor de celimplantatiestap, verwijder de puromycine uit de celkweekkolf door eerst al het medium in de kweekkolf te verwijderen, dan 2x spoelen met 10 mL 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), en ten slotte het medium te vervangen door volledig medium zonder de puromycine. Tijdens de medium-toevoegen en spoelen stappen, niet storen de cellen. Vergeet niet om het volledige medium te gebruiken met de selectie antibiotica van nu af aan voor alle medium aanvulling stappen.</li>
	<li>Verwijder op de dag van het voorbereiden van de cellen op implantatie alle volledige medium voor trypsinisatie om te voorkomen dat de trypsine wordt gedeactiveerd. Voeg 5 mL trypsine toe aan de kolf om de cellen te trypsiniseren. Controleer de cellen en controleer of ze loskomen van de kweekkolf.</li>
	<li>Zodra de meerderheid van de cellen los, voeg 10 mL van volledig medium om de trypsine activiteit te neutraliseren. Breng vervolgens de celsuspensie over op een centrifugebuis van 50 mL en centrifugeer op ~150 x g naar pellet de cellen. Verwijder de supernatant na de centrifugering en voeg vervolgens 10 mL van 1x PBS toe om de cellen opnieuw op te schorten en voor te bereiden op celtelling.</li>
	<li>Tel de cellen met een celteller en pas de celconcentratie aan op 20 x 106 cellen/mL in koude 1x PBS met 25% keldermembraanmatrix. Injecteer 2 x 106 cellen in 0,1 mL 1x PBS met 25% keldermembraanmatrix in de vierde borstvetmat van elke muis. Breng extra naalden en spuiten voor de celimplantatie en houd de cel-kelder-membraan-matrix mix op ijs voorafgaand aan implantatie. LET OP: Er is dode ruimte in de spuit en naald. Afhankelijk van de lengte, het type en de grootte van de naald en spuit kan een tuberculinspuit met een naald van 0,5 in 26 G tot 70 μL dode ruimtehebben 10. Bereid 40%−50% meer celimplantatiemix voor om de dode ruimte en elk ander toevallig verlies te compenseren.</li>
</ol>2. Orthotopische borstkanker model en tumor grootte meting
<ol><li>Laat 6 weken oude vrouwelijke athymische nudemuizen ten minste 1 week voor de celimplantatie acclimatiseren aan de huisvestingsfaciliteit. OPMERKING: Het gebruik van muizen van dezelfde leeftijd vermindert de gegevensvariatie.</li>
	<li>Voor elke ronde, verdoven vijf muizen met isoflurane op 4% met gefilterde (0,2 μm) lucht met een stroomsnelheid van 1 L/min voor 3−4 min. Let op de muis ademhalingsfrequentie en patroon verandering, en gebruik een teen knijpen om ervoor te zorgen dat de muizen onder de juiste anesthesie. Zodra ze niet meer bewegen, verwijder een muis en plaats een neuskegel over zijn neus en mond met dezelfde anesthesie.</li>
	<li>Wattenstaafje de linker4e borstklier met alcohol. Met behulp van fijne rat tand tangen, til de4e borstklier iets om de 25 G naald in te voegen. Zorg ervoor dat de naald is afgeschuind omhoog en trek vervolgens iets aan de zuiger om ervoor te zorgen dat de naald geen bloedvaten raakt. Als er geen bloed in de spuit komt, blijf dan langzaam 100 μL van de cel-kelder-membraan-matrix mix injecteren in de borstvetpad. LET OP: Er verschijnt een rond, verhoogd gebied onder de huid.</li>
	<li>Wacht 10−15 s tot de matrix van het keldermembraan uithardt en verwijder de naald. Herhaal het proces met de resterende muizen in de inductiekamer. Plaats alle gebruikte naalden en spuiten in een scherpe doos.</li>
	<li>Gebruik dezelfde borstklier injectieplaats voor alle muizen. Houd de injectieplaats goed in de gaten en let op een celimplantatiemix die uit de injectieplaats lekt. OPMERKING: Binnen een paar minuten zal de muis weer bij bewustzijn komen.</li>
	<li>Laat de xenograft vrij groeien zonder enige onderbreking gedurende 7−10 dagen voorafgaand aan een tumorgroottemeting.</li>
	<li>Bestudeer alle muizen voor de xenograft grootte. Meet de tumorgrootte met een remklauw. Bepaal het tumorvolume (mm3)met de volgende vergelijking: <img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq1.jpg"> waar L de langste dimensie is en W de kortste dimensie loodrecht op L.</li>
	<li>Uitschieters identificeren en verwijderen die een standaarddeviatie van het gemiddelde overschrijden. Gebruik alleen muizen met vergelijkbare tumorgroottes voor experimenten. Verdeel de muizen willekeurig in verschillende behandelingsgroepen en begin met behandelingen.</li>
	<li>Meet de tumorgrootte 2x per week met een remklauw. Houd nota van alle fysieke veranderingen van de xenografts (d.w.z., necrose, snijwond).</li>
</ol>3. In vivo bioluminescentie en ex vivo fluorescentiebeeldvorming
OPMERKING: In deze studie worden zowel tweedimensionale bioluminescentie als fluorescentiebeeldvorming uitgevoerd op het eindpunt van het experiment. De bioluminescentie beeldvorming (BLI) werd uitgevoerd met behulp van een commerciële preklinische optische scanner uitgerust met een 16-bits gekoelde CCD-camera en verwarmde beeldvorming.
<ol><li>Voor beeldvorming verdoven tot vijf tumordragende muizen in de inductiekamer door isofluraan op 3% te plaatsen met gefilterde (0,2 μm) lucht met een debiet van 1 L/min gedurende 3−4 min. Bepaal anesthesie door een teensnufje. Zorg ervoor dat de inductiekamer in een geventileerde kap wordt gehouden om de blootstelling van het personeel aan isofluraan te minimaliseren.</li>
	<li>Dien D-luciferine (150 mg/kg) toe aan de verdoofde muizen via een intraperitoneale route met behulp van een 27 G-naald en breng een verdoofde muis over naar de beeldkamer. Bij de scannerbeeldkamer moet u de isoflurane op 2%−2,5% houden met O2 als drager met een debiet van 1 L/min. OPMERKING: Houd de lichaamstemperatuur van de muis tijdens de procedure op ~ 37 °C door een verwarmde pad onder de anesthesie-inductiekamer, beeldtafel (als het stadium niet wordt verwarmd) en de herstelkooi na procedure te houden.</li>
	<li>Voordat de studiemuizen worden beeldvorming, verkrijgen ze de kinetiek door drie extra tumorlagermuizen (dieren die niet aan studiegroepen zijn toegewezen) te beeldvorming met tussenpozen van 2 minuten voor een totaal van 40 min met behulp van de volgende parameters: excitatiefiltergeblokkeerd, emissiefilter-open, f/stop 1, FOV-D, medium binning (8 x 8) en automatische blootstelling. Gebruik het piekbioluminescentiesignaal dat is gemeten om het optimale tijdvenster voor beeldverwerving voor alle volgende tijdpunten te definiëren.</li>
	<li>Tijdens het uitvoeren van metastase beeldvorming, schild de hoge BLI signaal van de primaire tumor door het te bedekken met een mouw uitgesneden uit een zwarte handschoen. Verkrijg het beeld met behulp van dezelfde parameters beschreven in stap 3.3 met de ventrale kant van de muis naar de camera voor longmetastase beeldvorming en de dorsale kant van de muis naar de camera voor de hersenen metastase beeldvorming. OPMERKING: Het is essentieel om een paar verschillende merken van zwarte handschoenen te testen om degene met minimale autoluweit te kiezen.</li>
	<li>Met behulp van een scanner en data-analyse software, teken een standaard vorm gebied van belang (ROI) over de borstholte of de hersenen ervoor te zorgen dat het hele orgaan van belang is gedekt om de gemetastaseerde last te evalueren. Kwantificeer de bioluminescentie (BL) output als totale flux (fotonen/seconde).</li>
	<li>Onmiddellijk na BLI euthanaseren de muis via CO2-verstikking (volgens de acuc-richtlijnen en door de instelling goedgekeurde dierprotocollen) en haal je de long en de hersenen eruit met ontledenschaar en tangen voor ex vivo beeldvorming. OPMERKING: De long die wordt geëxtraheerd voor ex vivo beeldvorming en voor longmetastase-knobbeltelling en kan niet op dezelfde muis worden uitgevoerd vanwege onverenigbare procedures.</li>
	<li>Spoel snel alle organen af met 1x PBS om oppervlakkige bloedvlekken te verwijderen en plaats organen op een zwart plastic plaat met lage autofluorescentie. Transport organen naar een multispectrale fluorescentie scanner uitgerust met spectrale unmixing vermogen (solid-state vloeibare kristal golflengte tuning) met een 12-bits CCD camera voor GFP detectie.</li>
	<li>Verwerf multispectrale GFP-beelden (excitatiefilter = 457 ± 23 nm; emissiefilter = 490 nm lange doorgang) van de geëxtraheerde organen en niet-tumorlagercontrolemuizen door 500−720 nm te scannen bij een stapgrootte van 10 nm. Gebruik uitgesneden organen van niet-tumor dragende controle muizen te corrigeren voor autofluorescentie.</li>
	<li>Na multispectrale GFP-beeldvorming bepaalt u de optimale beeldvormingsinstellingen. Voer beeldverwerving van alle doelorganen uit en voer beeldanalyse uit (d.w.z. het genereren van een spectrale bibliotheek voor autofluorescentie en GFP voor spectrale unmixing procedure) volgens het protocol van de fabrikant.</li>
</ol>4. Moleculaire detectie van gemetastaseerde borstkankercellen
<ol><li>Na de ex vivo beeldvorming, snap bevriezen van de hele hersenen in vloeibare stikstof en bewaar op -80 °C in een vriezer tot klaar voor de DNA-extractie.</li>
	<li>Voor DNA-extractie, zet de hele hersenen in een 5 mL homogeniserenbuis met 2 mL van DNA lysis buffer. Gebruik een homogenisator met de krachtinstelling op 50 om het vastbevroren hele hersenweefsel te homogeniseren. Zodra het hersenweefsel volledig gehomogeniseerd is, moet u de 1 mL-suspensie (lysaat) overbrengen naar een DNase-vrije en RNase-vrije 2 mL microcentrifugebuis en het DNA blijven isoleren volgens het protocol van de fabrikant. OPMERKING: Om dna-verontreiniging met overdracht te minimaliseren, moet u de homogenisator na elk monster grondig reinigen door het eerst met 75% ethanol in DNase-vrij en RNase-vrij water te spoelen en vervolgens te spoelen met 1 M NaOH-oplossing, gevolgd door een spoeling met 75% ethanol in DNase-vrij en RNase-vrij water om effectief dna-residu te verminderen en te vernietigen.</li>
	<li>Voeg 0,5 mL ethanol van DNA lysis buffer toe aan het lysaat. Meng monster door inversie en bewaar op kamertemperatuur gedurende 3 min. LET OP: Niet te vaak of te krachtig omkeren. Het DNA zal zichtbaar zijn als een wol-achtig neerslag.</li>
	<li>Gebruik een pipettip om het DNA over te brengen naar een verse DNase-vrije en RNase-vrije 2 mL microcentrifuge buis. Laat het monster 1 min drogen. Voeg 1 mL 75% ethanol toe en omkeer de microcentrifugebuis 3−6x om het DNA-monster te wassen. Gooi de ethanol na elke wasbeurt weg door te pipetteren. Herhaal de wasstap 2x.</li>
	<li>Lucht droog het DNA monster voor 10 s. Voeg vervolgens 52 μL van 8 mM NaOH toe om het DNA-monster op te lossen. Pipet2 μL van het DNA-monster voor DNA-kwantitatie en gebruik de resterende 50 μL voor een real-time PCR-test na concentratieaanpassing. OPMERKING: NaOH helpt om het DNA-monster volledig te oplosbaar.</li>
	<li>Kwantitate 2 μL van elk DNA monster met een spectrofotometer en gebruik een absorptieverhouding tussen A260/280 als referentie voor kwaliteitscontrole. Bereken de DNA-concentratie met deze formule: <img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq2.jpg">
</li>
	<li>Pas de DNA-concentratie aan op 50 ng/μL. Voor elk DNA-monster, gebruik 50 ng VAN DNA als de startsjabloon voor een real-time PCR-test. Gebruik 8 mM NaOH-oplossing of DNase-vrij en RNase-vrij water om het DNA-monster te verdunnen.</li>
	<li>Ontwerp het primerpaar dat specifiek is voor de exogene groene fluorescentie-eiwit (GFP) sequentie in eigen huis met behulp van een open source primer design webportal voor real-time PCR detectie van de GFP tag in de gemetastaseerde cellen die distale sites binnenvielen en gekoloniseerd. OPMERKING: Deze studie gebruikte F: 5'-AGAACGGCAAGCAGAGAAC-3', R: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTGTTGTCG-3'.</li>
	<li>Gebruik een snelle real-time PCR reagens en een real-time PCR-machine die een snel real-time PCR-protocol ondersteunt. Voeg naast de reguliere 30 cyclusversterkingsstappen een dissociatiecurvestap toe aan het einde van de run voor de detectie van niet-specifieke versterking. OPMERKING: De volgende voorwaarden werden gebruikt voor moleculaire detectie: 95 °C 2 min hete start, 40 cycli van 95 °C 5 s, 60 °C 15 s, en ten slotte een smeltcurve analyse. De GFP amplicon is 135 bp groot.</li>
	<li>Gebruik een naïeve muis hersenen DNA (niet een MDA-MB-231 cel implantaat) als een negatieve controle. Gebruik DNA uit de MDA-MB-231-GFP/Luc cellen als een positieve controle. Voeg alle PCR-reagentia toe zonder DNA-sjabloon als ntc (no template control). OPMERKING: Voor elke PCR-test is een PCR-besturingselement nodig.</li>
</ol>5. Gemetastaseerde borstkankerceldetectie bij longen
<ol><li>Voor de muizen subgroep gekozen voor de gemetastaseerde longknobbel telling, verdoven muizen met isofluraan (zoals in stap 2.2) onmiddellijk na de ex vivo beeldvorming, het uitvoeren van een hartpunctie voor bloedafname, en vervolgens euthanaseren door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Open de borstholte met ontleden schaar en snijd langs het hart en thymus om de luchtpijp bloot te leggen.</li>
	<li>Steek een spuit van 10 mL met een 22 G-naald met Bouin's oplossing in de luchtpijp. Duw de spuitzuiger totdat de ingestorte longen zijn gezwollen met ~ 2 mL van de oplossing van de Bouin. Verwijder de spuit en naald zodra de longen zijn opgeblazen.</li>
	<li>Plaats de hele long in een buis van 15 mL met Bouin's oplossing, draai de buis een paar keer voorzichtig om en laat 24 uur weken bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Na 24 uur, verwijder de Bouin's oplossing uit de buis, spoel de long met water, en plaats het terug in de buis met 70% ethanol. Tel metastase (witte vlekken of knobbeltjes) op de oppervlakken van de longen met behulp van een ontledenmicroscoop.</li>
</ol>6. Gegevensverzameling en -analyse
<ol><li>Neem gegevens over tumorvolume op, evenals in vivo- en ex vivo-beeldvormingsgegevens, op een elektronische spreadsheet voor eenvoudige gegevensinvoer, verzameling en beheer.</li>
	<li>Breng aan het einde van het experiment alle gegevens over naar de elektronische spreadsheet en statistische software voor gegevensplotten en statistische analyses.</li>
</ol>

<ol><li>Abramson, V. G., Lehmann, B. D., Ballinger, T. J., Pietenpol, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtyping+of+triple-negative+breast+cancer%3A+implications+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Subtyping of triple-negative breast cancer: implications for therapy.</a> Cancer. 121, 8-16 (2015).</li>
<li>Zhuang, X., Zhang, H., Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+and+Microenvironment+Plasticity%3A+Double-Edged+Swords+in+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cancer and Microenvironment Plasticity: Double-Edged Swords in Metastasis.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 40 (6), 419-429 (2019).</li>
<li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Models of bone metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4260(2012).</li>
<li>Saha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+tumor+hypoxia+dynamics+of+breast+cancer+brain+metastasis+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (56), e3175(2011).</li>
<li>Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portal+Vein+Injection+Model+to+Study+Liver+Metastasis+of+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54903(2016).</li>
<li>Lim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+tumor+metastases+and+osteolytic+lesions+with+bioluminescence+and+micro+CT+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2775(2011).</li>
<li>Bauerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-modal+imaging+of+angiogenesis+in+a+nude+rat+model+of+breast+cancer+bone+metastasis+using+magnetic+resonance+imaging%2C+volumetric+computed+tomography+and+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-modal imaging of angiogenesis in a nude rat model of breast cancer bone metastasis using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e4178(2012).</li>
<li>Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+a+Murine+Orthotopic+Metastatic+Breast+Cancer+Model+and+Performing+Murine+Radical+Mastectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57849(2018).</li>
<li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+tail+vein+injection+a+relevant+breast+cancer+lung+metastasis+model%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model?</a> Journal of Thoracic Disease. 5, 385-392 (2013).</li>
<li>Bhambhani, V., Beri, R. S., Puliyel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inadvertent+overdosing+of+neonates+as+a+result+of+the+dead+space+of+the+syringe+hub+and+needle%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%3A+Fetal+and+Neonatal+Edition%22%5BJournal%5D)">Inadvertent overdosing of neonates as a result of the dead space of the syringe hub and needle.</a> Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90, F444-F445 (2005).</li>
<li>Zhang, G. L., Zhang, Y., Cao, K. X., Wang, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+Injection+of+Breast+Cancer+Cells+into+the+Mice+Mammary+Fat+Pad%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58604(2019).</li>
<li>Tavera-Mendoza, L. E., Brown, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+less+invasive+method+for+orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A less invasive method for orthotopic injection of breast cancer cells into the mouse mammary gland.</a> Laboratory Animals. 51, 85-88 (2017).</li>
<li>Paschall, A. V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Mouse+Model+of+Spontaneous+Breast+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54040(2016).</li>
<li>Kocaturk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e51967(2015).</li>
<li>Fletcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+adipose+tissue%3A+characterization+of+factors+that+change+during+tumor+progression+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Human breast adipose tissue: characterization of factors that change during tumor progression in human breast cancer.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36, 26(2017).</li>
<li>Giuliano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axillary+dissection+vs+no+axillary+dissection+in+women+with+invasive+breast+cancer+and+sentinel+node+metastasis%3A+a+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: a randomized clinical trial.</a> Journal of the American Medical Association. 305, 569-575 (2011).</li>
<li>Rummel, S., Hueman, M. T., Costantino, N., Shriver, C. D., Ellsworth, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+location+within+the+breast%3A+Does+tumour+site+have+prognostic+ability%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Ecancermedicalscience%22%5BJournal%5D)">Tumour location within the breast: Does tumour site have prognostic ability?</a> Ecancermedicalscience. 9, 552(2015).</li>
<li>Kroman, N., Wohlfahrt, J., Mouridsen, H. T., Melbye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumor+location+on+breast+cancer+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Influence of tumor location on breast cancer prognosis.</a> International Journal of Cancer. 105, 542-545 (2003).</li>
<li>Bao, J., Yu, K. D., Jiang, Y. Z., Shao, Z. M., Di, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+laterality+and+primary+tumor+site+on+cancer-specific+mortality+in+breast+cancer%3A+a+SEER+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of laterality and primary tumor site on cancer-specific mortality in breast cancer: a SEER population-based study.</a> PLoS One. 9, e94815(2014).</li>
<li>Faustino-Rocha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+rat+mammary+tumor+volume+using+caliper+and+ultrasonography+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements.</a> Lab Animal. 42, 217-224 (2013).</li>
<li>Mullen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Matrigel+to+facilitate+the+establishment+of+human+cancer+cell+lines+as+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The use of Matrigel to facilitate the establishment of human cancer cell lines as xenografts.</a> Methods in Molecular Medicine. 88, 287-292 (2004).</li>
<li>Jensen, R. L., Leppla, D., Rokosz, N., Wurster, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+augments+xenograft+transplantation+of+meningioma+cells+into+athymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Matrigel augments xenograft transplantation of meningioma cells into athymic mice.</a> Neurosurgery. 42, 130-136 (1998).</li>
<li>Mullen, P., Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+matrigel+in+the+establishment+of+ovarian+carcinoma+cell+lines+as+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The use of matrigel in the establishment of ovarian carcinoma cell lines as xenografts.</a> Methods in Molecular Medicine. 39, 199-203 (2001).</li>
<li>Fliedner, F. P., Hansen, A. E., Jorgensen, J. T., Kjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+matrigel+has+no+influence+on+tumor+development+or+PET+imaging+in+FaDu+human+head+and+neck+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts.</a> BMC Medical Imaging. 16, 5(2016).</li>
<li>Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Matrigel+on+the+tumorigenicity+of+human+breast+and+ovarian+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines.</a> International Journal of Cancer. 67, 816-820 (1996).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Institute+for+Laboratory+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> Journal of the Institute for Laboratory Animal Research. 49, 103-115 (2008).</li>
<li>Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Comparison+of+the+Sensitivity+of+Detection+of+Fluorescent+and+Bioluminescent+Reproters+in+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models.</a> Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voor de studie van TNBC bij dieren zijn twee murinemodellen ontwikkeld: de MDA-MB-231 menselijke borstadenoomcellen in immuungecompromitteerde muizen (d.w.z. athymische naaktmuizen, NSG-muizen) en de 4T1 bij immuun-competente BALB/c-muizen. Beide modellen hebben hun voordelen. De keuze van het diermodel voor een studie hangt af van de onderzoeksdoelen. Bijvoorbeeld, de MDA-MB-231 model is een menselijke TNBC cellijn geteeld in immuungecompromitteerde muizen die immuunonderdrukte menselijke borstkanker patiënten bootst. Aan de andere kant, de invasieve fenotype van orthotopische 4T1 triple-negatieve murine borstkankercellen in BALB / c muizen nauw bootst het uitgezaaide proces als het optreedt in fase IV menselijke borstkanker patiënten. In tegenstelling tot de intraveneuze celinjectie benadering, menselijke MDA-MB-231 borstkankercellen werden op dezelfde manier geïnjecteerd in de borst vet pad11,12 in de orthotopische borstkanker model11,13. De langere tumorgroei en het verworven uitgezaaide vermogen zijn fysiologisch relevanter, dus het is geen kunstmatig gemetastaseerd kankermodel4,14. Zo'n spontane metastase model nauw bootst de ontwikkeling van menselijke borstkanker, behalve voor de initiatie fase. Dit is een cruciaal model voor in vivo drugscreening en therapeutische werkzaamheidsbeoordeling bij uitgezaaide borstkanker.
De tumor implantatie plaats in de muis speelt een cruciale rol in het verstrekken van een micro-omgeving die tumorgroei en de selectie van gemetastaseerde fenotype vergelijkbaar met die welke optreedt bij de mens ondersteunt. De proximale lymfeklier en de aanwezigheid van vetweefsel zijn de belangrijkste factoren die de progressie van borstkankerbeïnvloeden 15,16. Bij een menselijke patiënt zijn de lymfeklier en het vetweefsel beide belangrijke factoren die van invloed zijn op de maligniteit en incidentie van borstkanker17,18,19. Zo kan de selectie van de juiste anatomische locatie voor de injectieplaats de relevantie van het tumormodel in vergelijking met de menselijke ziekte sterk beïnvloeden. Deze studie gebruikte de vierde borstklier als de implantatieplaats voornamelijk als gevolg van de bovengenoemde eisen en dat het anatomisch toegankelijker en gemakkelijker te manipuleren is.
Verschillende tumor volume berekeningsmethoden zijn beschikbaar, en een onderzoeker kan kiezen welke ze geschikt achten. Het algoritme geselecteerd voor deze studie is gebaseerd op de bevindingen van Faustino-Rocha et al., die verschillende tumor volume berekeningformules vergeleken en concludeerde dat de onderstaande formule is de meest nauwkeurige20.
<img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq3.jpg">
Keldermembraanmatrix is een belangrijke extracellulaire matrix die wordt gebruikt in verschillende in vitro21 en in vivo22,23 testen. Er zijn tegenstrijdige rapporten22,24,25 over de invloed van de kelder membraan matrix op xenograft maligniteit. Het lijkt alleen de oorspronkelijke vestiging van de xenograft te beïnvloeden en heeft verder geen effect op de groei van xenograft25. Voor de beschreven xenograft-implantatie werd de keldermembraanmatrix gemengd met de kankercellen om de viscositeit van de cel/gelmix voorafgaand aan implantatie te verhogen. De aanwezigheid van de keldermembraanmatrix vermindert het verlies van mengoplossing van de injectieplaats en houdt de mixoplossing op de implantatieplaats, waardoor de uniformiteit van het geïmplanteerde xenograft-volume toeneemt.
De MDA-MB-231 cellijn is een kwaadaardige vereeuwigde menselijke borst adenocarcinoma cellijn en is een populair instrument in borstkanker onderzoek vanwege zijn triple-negatieve status. Het gebruik van dual reporters (luciferase en GFP) cellijn zorgt voor meer flexibiliteit in het hanteren van de in vivo en ex vivo imaging. Het is algemeen vastgesteld dat het bioluminescentiesignaal een grotere gevoeligheid, dieptedetectie en superieur contrast (signaal-ruisverhouding) heeft dan GFP-signalen. Hierdoor is het een veel gebruikte beeldvormingsmodaliteit voor beeldvorming in het hele lichaam. Helaas wordt de detectie van bioluminescentie beperkt door een smal tijdvenster (~15−20 minuten na de injectie) waarbij de signaaldetectie lineair is. BLI signaal vermindert snel wanneer de dieren worden geëuthanaseerd. Dit wordt een experimenteel ontwerpprobleem als veel muizen geëuthanaseerd moeten worden en het oogsten van meerdere weefsels of organen nodig is. In deze studies werd bloed geoogst door directe hartpunctie, de hersenen, primaire tumor, long, en getroffen lymfeklier werden onderzocht in 40 muizen. Tegen de tijd dat de organen werden geoogst en klaar voor ex vivo beeldvorming, het bioluminescentie signaal was niet op te sporen. Daarom is GFP-detectie in deze situaties meer geschikt. De emissie van het GFP-signaal bevindt zich in het zichtbare bereik en bij deze golflengten is de signaalabsorptie als gevolg van bloed (d.w.z. hemoglobine) aanzienlijk hoger. Ook autofluorescentie in het zichtbare bereik als gevolg van NADH, lipo-pigmenten, en flavins resulteert in een aanzienlijke achtergrond die het moeilijk maakt om onderscheid te maken tussen een low-level GFP-signaal en autofluorescentie achtergrond. Het gebruik van een multispectrale fluorescentie imaging benadering in plaats van traditionele filter-pair imaging en het gebruik van spectrale unmixing algoritmen helpt identificeren echte GFP signaal in het orgaan van belang. Door de sterke punten van bioluminescentiebeeldvorming in het hele lichaam in vivo detectie en multispectrale GFP-beeldvorming in de ex vivo orgaan/weefselevaluaties te combineren, kunnen kwantificeerbare gegevens worden gemaximaliseerd in een groot cohort van muizen.
Het maakt niet uit welke aanpak is geselecteerd voor een dierstudie, het extraheren van al het bloed voorafgaand aan het ophalen van organen/weefsels wordt ten zeerste aanbevolen, vooral voor studies gericht op de gemetastaseerde belasting. Dit protocol detecteert GFP signalen van de hele bloed monsters verkregen van de muizen (gegevens niet getoond) in de orthotopische borstkanker model door real-time PCR testen. Het minimaliseren van het bloedvolume in organen/ weefsels vermindert het vals-positieve signaal in de doelorganen.
Tot slot, de orthotopische borstkanker model met behulp van de MDA-MB-231-Luc/ GFP cellen is een zeer relevant dier model dat nauw bootst de menselijke TNBC patiënt aandoening. Dit model is essentieel voor het bestuderen, monitoren en beoordelen van therapeutische werkzaamheid in een tumormicroomgeving vergelijkbaar met mensen. Het gebruik van dual reporter cellijnen verder verbetert de uitvoerbaarheid van deze orthotopische borstkanker model.

Ongeveer een op de acht vrouwen in de Verenigde Staten zal invasieve borstkanker te ontwikkelen tijdens haar leven, en 10%−20% van deze vrouwen zal worden gediagnosticeerd met de agressieve triple negatieve borstkanker (TNBC) subtype. Terwijl primaire laesies in de meeste gevallen operatief kunnen worden verwijderd, maken de subklinische micrometastase en chemoresistentie het een hardnekkige ziekte. Belangrijk is dat de meeste patiënten met uitgezaaide TNBC uiteindelijk terugvallen, zelfs als ze een behandeling ondergingen in het vroege stadium1. Dus, kanker heterogeniteit, micrometastase, en therapeutische resistentie zijn drie grote uitdagingen het beperken van de succesvolle klinische uitkomst van TNBC-patiënten. Daarom is er een dringende noodzaak om de polymorfe moleculaire achtergrond van TNBC beter te begrijpen en effectieve therapeutische middelen te ontwikkelen die gemetastaseerde ziekten beperken.
Tumormetastase is een proces met meerdere stappen waarbij de tumorcel zijn micro-omgeving controleert en overneemt om zijn eigen verspreiding te bevorderen via membraanafbraak en tumorcelontsnapping uit de primaire laesie, via binnenkomst in (d.w.z. intravasatie) en exit uit (d.w.z. extravasatie) de vasculatuur, en uiteindelijk aanpassing en kolonisatie binnen distale beddenweefsel 2. Diermodellen zijn ontwikkeld om borstkankermetastase te bestuderen, waarbij twee methoden vaak worden toegepast: directe bloedcirculatieinjectie en orthotopische implantatie. Algemeen gebruikte methoden voor directe bloedcirculatie injectie omvatten staart ader injectie, terwijl andere benaderingen, waaronder directe hartinjectie3,directe herseninjectie4, en directe lever injectie5 zijn ook gebruikt. De directe bloedcirculatie injectie wordt vaak aangeduid als een kunstmatige metastase model, dat is snel en gemakkelijk, maar minder fysiologisch nauwkeurig omdat het omzeilt tumor ontsnappen aan de primaire laesie en intravasatie6,7,8. In vergelijking met directe injectiemodellen duurt het orthotopische borstkankermodel langer voor het optreden van detecteerbare gemetastaseerde laesies in afgelegen organen zoals de long, maar het is fysiologisch relevanter omdat het het multistep gemetastaseerde proces nauw nabootst zoals het bij mensen voorkomt. Belangrijk is dat een studie van 20139 de staartaderinjectie en orthotopische modellen vergeleek en vond dat de borstkankercellen die in de staartader werden geïnjecteerd en die geïsoleerd werden van uitgezaaide laesies na de injectie van staartaders vergelijkbare mondiale genexpressieprofielen vertoonden. Het globale genexpressieprofiel van orthoplaatselijk geïnjecteerde borstkankercellen was daarentegen dramatisch anders dan dat van uitgezaaide longlaesies als gevolg van orthoplaatselijk geïnjecteerde cellen9. Deze waarnemingen suggereren dat het orthotopische model fysiologisch relevanter is, omdat de gemetastaseerde laesies een selectieproces ondergaan dat vergelijkbaar is met het meerstapsproces van metastase zoals het bij de mens voorkomt.
Dit werk beschrijft een orthotopopische borstkanker (MDA-MB-231-Luc/GFP) model in nude muizen dat werd geoptimaliseerd in ons laboratorium voor imaging detectie technieken, alsmede de identificatie van nieuwe biomarkers en de ontwikkeling van gerichte chemotherapeutische middelen.

<table><tbody><tr><td>Bouins Solution</td><td>Sigma</td><td>HT10132-1L</td><td>Longmetastase nodule staining</td></tr><tr><td>D-Luciferin, Potassium Salt</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-1G</td><td>Luciferase substraat</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>ThermoFisher</td><td>10503027</td><td>DNA extractie Kit</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Spreadsheet software</td></tr><tr><td>homogenizer</td><td>Virtis</td><td>Cyclone Virtishear</td><td>Voor weefsel homogenisatie</td></tr><tr><td>IVIS SPECTRUM scanner</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>fluorescentie en BLI beeldvormingssysteem</td></tr><tr><td>Maestro GNIR-FLEX fluorescentiescanner</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>fluorescentie beeldvormingssysteem</td></tr><tr><td>MatriGel Matrix</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Bewaar op -20C en houd oud (4 C) tijdens gebruik.</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stabiele Cellijn</td><td>GenTarget</td><td>SC044</td><td>Dual Reporter humane borstkanker cellijn</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS</td><td>histologie beeldvastlegging</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>spoelbuffer</td></tr><tr><td>Primer3</td><td>MIT</td><td></td><td>Primer Ontwerp</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Statistische Analyse Software</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113803</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>ThermoFisher</td><td>61870127</td><td>Kweekmedia</td></tr><tr><td>SeniFAST SYBR Lo-ROX kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-94020</td><td>Fast Real-Time PCR Reagens</td></tr><tr><td>StepOne Plus Real-Time PCR systeem</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Real-Time PCR machine</td></tr></tbody></table>

studeren triple negatieve borstkanker met behulp van orthotopische borstkanker model

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negatieve borstkanker (TNBC) is een agressief borstkanker subtype met beperkte therapeutische opties. In vergelijking met patiënten met minder agressieve borsttumoren is de 5-jarige overlevingskans van TNBC-patiënten 77% vanwege hun karakteristieke resistente fenotype en gemetastaseerde last. Tegen dit doel, murine modellen zijn opgericht gericht op het identificeren van nieuwe therapeutische strategieën beperking van TNBC tumorgroei en uitgezaaide verspreiding. Dit werk beschrijft een praktische gids voor de TNBC orthotopopisch model waar MDA-MB-231 borstkankercellen opgehangen in een kelder membraan matrix worden geïmplanteerd in de vierde borstvet pad, die nauw bootst de kanker cel gedrag bij de mens. Meting van tumoren door remklauw, longmetastase beoordeling via in vivo en ex vivo imaging, en moleculaire detectie worden besproken. Dit model biedt een uitstekend platform om therapeutische werkzaamheid te bestuderen en is vooral geschikt voor de studie van de interactie tussen de primaire tumor en distale gemetastaseerde sites.

Tumorvolumemeting door remklauw is een gevestigde methode om de werkzaamheid van de behandeling te beoordelen (figuur 1). Het aantal geïmplanteerde cellen, het gebruik van keldermembraanmatrix, microbioom, facilitaire reinheid en injectieplaats zijn de belangrijkste factoren die van invloed zijn op de tumorgroei.
In tegenstelling tot de GFP-beeldvorming vereiste BLI de toediening van luciferasesubstraat ten minste 15−20 min voorafgaand aan BLI-beeldvorming. Bovendien beïnvloeden de muisstam, cellijn, behandelingen en luciferase reporter allemaal de bioluminescentiesignaalniveaus. Om vergelijkbare signalen tussen de studiegroepen te verkrijgen, moet dus een pre-imaging BLI kinetische studie worden uitgevoerd om de beste beeldvormingstermijn te bepalen (figuur 2).
Door de superieure signaal-achtergrondverhouding26,27, was het hele lichaam in vivo bioluminescentiebeeldvorming vrij gevoelig bij het detecteren van een metastasesignaal op laag niveau in vergelijking met de GFP-benadering ( figuur3). Bovendien, de bioluminescentie signaal verstrekt diepere penetratie dan GFP door een paar millimeter. De productie van bioluminescentiesignaal vereist echter ATP, wat een beperkende factor is bij de evaluatie van ex vivo weefselmonsters. Als de dieren snel worden verwerkt, dan kan BLI een haalbare aanpak zijn om kwantitatieve resultaten te verkrijgen op metastase. Een manier om dit te bereiken is door het verwerken van een dier tegelijk. Deze aanpak was echter niet haalbaar voor deze studie omdat een groot cohort van muizen werd gebruikt. BLI signaal werd niet gedetecteerd toen de organen werden afgebeeld rond 45 min post luciferin injectie. Het gebruik van een dubbele reporter cellijn is nuttig in deze situatie. Vanwege de stabiele aard van het GFP-molecuul zouden onderzoekers voldoende tijd hebben om het karkas te verwerken voordat de GFP-signalen van doelorganen worden opgevangen (figuur 4).
Figuur 5 geeft een real-life voorbeeld van hoe caliper tumor grootte metingen de interpretatie van de gegevens kunnen verstoren, omdat de xenograft verloor het grootste deel van de levensvatbare tumor cel inhoud, maar nog steeds zijn grote massa en vorm gehandhaafd. Histopathologisch onderzoek van die xenografts wees op necrose in de massa (Figuur 5B).
Voor onderzoekers die de beeldvormingsresultaten met betrekking tot de hersenmetastase in het orthotopische borstkankermodel uitdagen, kan moleculaire detectie door real-time PCR overtuigend bewijs leveren (Figuur 6). In dit geval was de exogene GFP DNA-sequentie de beste manier om dit probleem aan te pakken, omdat de transfected GFP DNA-sequentie van nature niet bestaat bij mensen of knaagdieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig1.jpg"> Figuur 1: Tumorvolumemeting. Tumor volume / laden met een remklauw begon op dag 10 na xenograft implantatie en vervolgens werd gemeten 2x per week tot het einde van het experiment. Foutbalken worden berekend op basis van de SEM-waarde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig2.jpg"> Figuur 2: Bepaling van het venster optimale beeldverwerving. Links: Een muis met een grote xenograft en een muis met een kleine xenograft werden geselecteerd voor de optimale luciferin kinetische bereikbepaling. Rechts: Luciferin kinetische curve verkregen door het verwerven van de beelden om de 2 min gedurende 40 min. Een plateau werd waargenomen tussen 15−22 min, die werd gebruikt als een optimale beeldverwervingtijd voor alle daaropvolgende beeldvorming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig3.jpg"> Figuur 3: Hele lichaam BLI beeldvorming. L: Hele lichaam BLI beeldvorming. M: Ventrale mening met het onderlichaam dat met een koker van een zwarte handschoen wordt behandeld. R: Dorsale weergave met het onderlichaam bedekt met een mouw van een zwarte handschoen. Een axillaire lymfekliermetastase wordt gedetecteerd in de ventrale weergave door BLI imaging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig4.jpg"> Figuur 4: Ex vivo BLI/GFP signaaldetectie. GFP signalen werden gedetecteerd in de hersenen en longen van dezelfde muis 20 min na de muis werd opgeofferd. BLI signaal werd niet gedetecteerd 45 min post luciferin injectie. Er werd geen GFP-signaal gedetecteerd in naïeve muishersenen en longen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig5.jpg"> Figuur 5: Voordelen van optische beeldvormingstechnieken ten opzichte van remklauwmetingen. (A) Representatieve afbeelding met in vivo GFP-signaaldetectie in een primaire tumor. Slechts een klein deel van de xenograft toonde GFP-signaal, wat suggereert dat een aanzienlijk deel van de massa stroma was. Dit kan niet worden bepaald door traditionele remklauwmetingen en kan leiden tot een onjuiste conclusie. Dit voorbeeld benadrukt het belang van optische beeldvorming voor de diermodelstudie. (B) Histopathologie sectie van dezelfde muis waaruit blijkt dat de necrotische regio (dat wil zeggen, binnengebied) ook bijgedragen aan de tumor grootte berekening. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig6.jpg"> Figuur 6: Analyse van de smeltcurve. De smeltcurveplot met de specificiteit van GFP-amfilicen. DNA uit de hersenen verkregen uit de MDA-MB-231-Luc/GFP-geïmplanteerde muizen en het DNA geïsoleerd uit de MDA-MB-231-Luc/GFP cellen gekweekt in cultuur (positieve controle) werden gesommeerd. De real-time PCR-test werd uitgevoerd om het GFP-gehalte in het hersenweefsel te beoordelen. (A,B) De smeltende krommen van de positieve controle en het DNA dat respectievelijk uit de muishersenen wordt gewonnen. (C) De overlappende krommen van de panelen A en B, die de pieksignalen van de muishersenen DNO's aangeven, zijn specifiek voor de exogene GFP-sequentie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Dit werk presets een geavanceerd protocol om nauwkeurig te beoordelen tumor laden door detectie van groene fluorescerende eiwitten en bioluminescentie signalen, alsmede de integratie van kwantitatieve moleculaire detectie techniek.

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Ons protocol overwint de beperkte bioluminescentie beeldvorming venster door het opnemen van een GFP-tag die ook vergemakkelijkt de detectie en kwantificering van micrometastase door PCR-analyse. Omdat de GFP-tag het beperkte aankoopvenster voor bioluminescentie omzeilt, kunnen meer onderwerpen worden beeltenis zonder signaalverlies en is het potentieel voor fout-negatieve resultaten beperkt. Deze studie zal nuttig zijn voor onderzoekers voor de evaluatie van de therapeutische werkzaamheid van anti-kanker middelen.Deze methodologie biedt een nuttig model voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in EMT, resistentie tegen geneesmiddelen, en kanker stamcel mechanismen in verband met het uitgezaaide proces en voor de ontwikkeling van anti-kanker drugs. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex, wattenstaafje de linker vierde borstklier met alcohol en gebruik fijne rat-tand tangen om de vierde borstklier iets te tillen. Zorg ervoor dat de tip is schuin, steek een 25 meter naald bevestigd aan een een milliliter spuit met 100 microliter van cel kelder membraan matrix mix en iets intrekken van de zuiger om ervoor te zorgen dat de naald geen contact maakt met bloedvaten.Voor vergelijkende resultaten moet de injectieplaats voor tumorcellen consistent zijn tussen alle ontvangende dieren. Als er geen bloed in de spuit komt, injecteer dan langzaam het volledige volume oplossing in het borstvetkussen. Een ronde verhoogde massa zal verschijnen onder de huid.Wacht 10 tot 15 seconden tot de keldermembraanmatrix is uithard voordat u de naald verwijdert en laat de xenograft zeven tot tien dagen vrij groeien zonder onderbreking voordat een tumorgroottemeting wordt uitgevoerd. Gebruik vervolgens remklauwen om de grootte van de xenograft in alle muizen te meten en het tumorvolume te bepalen met behulp van de vergelijking zoals aangegeven. Voordat de studiedieren worden afgebeeld, beeldt u drie extra tumordragende muizen gedurende 40 minuten met intervallen van twee minuten met behulp van de parameters zoals aangegeven om de luciferine kinetiek voor de studie te verkrijgen.Gebruik het piek gemeten bioluminescentiesignaal om het optimale tijdvenster voor het verkrijgen van afbeeldingen voor alle volgende tijdstippen te definiëren. Om metastase beeldvorming uit te voeren, bedek de primaire tumor met een mouw gesneden uit een zwarte handschoen en plaats een verdoofde muis in de scanner dan beeld van de luciferin signaal met behulp van dezelfde parameters als net aangetoond met de ventrale kant van de muis naar de camera voor longmetastase beeldvorming en de dorsale kant van de muis naar de camera voor de hersenen uitzaaiingen. Met behulp van een scanner en data-analyse software, trekken een regio van belang over het afgebeelde gebied om ervoor te zorgen dat het hele orgaan van belang wordt gedekt om de evaluatie van de uitgezaaide last mogelijk te maken en kwantificeren van de bioluminescentie output als de totale flux en fotonen per seconde.Onmiddellijk na bioluminescentie signaal kwantificering, oogst de hersenen en longweefsel en snel spoelen de organen in PBS om eventuele oppervlakkige bloedvlekken te verwijderen. Plaats de organen op een lage automatische fluorescentie zwarte plastic plaat en transport de monsters naar een multi-spectrale fluorescentie scanner uitgerust met spectrale niet-mengen vermogen voor GFP detectie. Om multispectrale GFP-beelden van de geëxtraheerde organen te verkrijgen, scant u de organen van 500 tot 720 nanometer met een stapgrootte van 10 nanometer.Om weefsel auto fluorescentie profiel te verkrijgen, scan verwijderde organen van niet-geïnjecteerde controle muizen. Bovendien, beeld GFP positieve weefsels zoals primaire tumor te verwerven auto fluorescentie gemengd GFP profiel. Verwerk deze spectra volgens het protocol van de fabrikant om een spectrale bibliotheek met zuivere GFP- en automatische fluorescentieprofielen op te zetten.Na het bevestigen van de nauwkeurigheid van de spectrale bibliotheek en het scheiden van GFP signaal van weefsel auto fluorescentie achtergrond, gebruik maken van dezelfde bibliotheek om alle beelden ontlevermend op studie. Voor DNA-extractie na snap bevriezing, plaats de hele hersenen in een vijf milliliter homogeniseren buis met twee milliliter dna-lyse buffer en gebruik een homogenisator ingesteld op 50 om het weefsel te homogeniseren. Wanneer het weefsel volledig gehomogeniseerd is, breng dan een milliliter van het lysaat over naar een DNAse en RNAse vrij twee milliliter microcentrifuge buis en isoleert het DNA volgens het protocol van de fabrikant.Voeg 500 microliter van 100% ethanol toe aan het isolaat en meng het monster door inversie. Na drie minuten bij kamertemperatuur, gebruik een pipet om de wol-achtige DNA-neerslag over te brengen naar een nieuwe twee milliliter DNAse en RNAse gratis buis. Laat het monster een minuut drogen voordat u een milliliter ethanol van 75% aan de buis toevoegt en de buis drie tot zes keer omkeert om het monster te wassen.Gooi de ethanol na de laatste inversie voor het wassen van het DNA nog twee keer met verse ethanol per wasbeurt zoals net aangetoond. Na de laatste wasbeurt droogt de lucht het monster 10 seconden voordat het DNA wordt opgelost in 52 microliter van acht millimolar natriumhydroxide. Breng een twee microliter aliquot van DNA over naar een spectrofotometer flacon en kwantificeer de concentratie DNA in het monster met behulp van een absorptieverhouding tussen A260 en 280 volgens de formule.Pas de DNA-concentratie van het monster aan op 50 nanogram per microliter met extra acht millimolar natriumhydroxide en ontwerp het primerpaar dat specifiek is voor de exogene groene GFP-sequentie in eigen huis met behulp van een open-source primerontwerpwebportaal voor de real-time PCR-detectie van de GFP-tag en de gemetastaseerde cellen die de distale sites van de tumor zijn binnengedrongen en gekoloniseerd. Gebruik vervolgens een snelle real-time PCR-reagens en een real-time PCR-machine die een snel real-time PCR-protocol ondersteunt voor real-time kwantitatieve PCR-analyse van het monster. Voor de detectie van uitgezaaide borstkankercellen in de long, gebruik ontleden schaar om de borstholte te openen en snijd langs het hart en thymus om de luchtpijp bloot te stellen.Steek een 22-meter naald aan een 10 milliliter spuit met Bouin-oplossing in de luchtpijp en druk de zuiger totdat de ingestorte longen gezwollen raken met ongeveer twee milliliter van de oplossing. Verwijder de spuit en naald zodra de longen zijn opgeblazen en breng de hele long in een 15 milliliter buis met verse Bouin oplossing. Draai de buis voorzichtig een paar keer om voordat u het weefsel verlaat om 24 uur op kamertemperatuur te weken.Spoel de volgende dag de long af met water en plaats het monster in een buis van 70% ethanol. Gebruik vervolgens een ontledende microscoop om het aantal uitgezaaide witte vlekken en knobbeltjes op de oppervlakken van de longen te tellen. Tumor volume meting door remklauw is een gevestigde methode voor de beoordeling van de werkzaamheid van de behandeling.Om vergelijkbare signalen tussen studiegroepen te verkrijgen, moet een pre-imaging BLI kinetiek studie worden uitgevoerd om het beste beeldtijds tijdsbestek te bepalen. Door de superieure signaal-achtergrond verhouding, hele lichaam in vivo BLI is heel gevoelig in het detecteren van lage niveau metastase signalen in vergelijking met de GFP aanpak. Echter, als gevolg van de stabiele aard van de GFP molecuul, onderzoekers hebben voldoende tijd om het karkas te verwerken voorafgaand aan het vastleggen van de GFP signalen van doelorganen in dual reporter studies.Dit real life voorbeeld laat zien hoe remklauw tumor grootte metingen kunnen vervormen de interpretatie van de gegevens als deze xenograft verloor het grootste deel van de levensvatbare tumorcel inhoud met behoud van de grote massa en vorm. Moleculaire detectie door real-time PCR kan ook overtuigend bewijs leveren van hersenmetastase in het orthotopische borstkankermodel met exogene GFP DNA-sequencing als de transfected GFP DNA-sequentie bestaat niet van nature bij mensen of knaagdieren. De implantatieplaats moet fysiologisch en anatomisch gerelateerd zijn aan kankermaligniteit.Zowel tumor gen en eiwit expressie kan worden geëvalueerd op primaire en distale sites en gemetastaseerde cellen kunnen worden geïsoleerd voor verdere karakterisering.

studying-triple-negative-breast-cancer-using-orthotopic-breast-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

De video toont de orthotopische inentingstechniek voor borstkanker in een muismodel. Deze techniek produceert een hoge tumorigenesesnelheid met minder variabiliteit in tumorgrootte en vorm in vergelijking met subcutane of niet-chirurgische injectie.

Orthotopische injectie: weefselspecifieke kankercellen implanteren in een volwassen muis

Kanker is een complexe ziekte die wordt beïnvloed door het weefsel rondom de tumor en lokale pro- en anti-inflammatoire mediatoren. Daarom kan orthotroop injectie modellen plaats subcutane modellen nuttig om de progressie van kanker te bestuderen op een wijze die beter nabootst humane pathologie.

Orthotopische Injectie van borstkankercellen in de uiervet Pad van Muizen tumorgroei te bestuderen.

Een orthotope borstkanker primaire tumor model en chirurgische verwijdering van de primaire tumor de muis het leven uit te breiden tot spontane metastase genereren beschreven. De tumorgroei en progressie worden gecontroleerd en gekwantificeerd luciferase fluorescentiebeeldvorming.

Een orthotope Muis Model van Spontane uitzaaiing van borstkanker

Wij introduceren een lymfkliertest orthotopic borst kanker en radicale mastectomie model met bioluminescentie technologie te kwantificeren van de last van de tumor om na te bootsen menselijke borst kanker progressie.

Het genereren van een lymfkliertest Orthotopic uitgezaaide borst kanker Model en het uitvoeren van lymfkliertest radicale mastectomie

Hier presenteren we een protocol om het implantaat van borstkankercellen in de borstklier vet pad in een eenvoudige, minder invasief, en gemakkelijk te bedienen manier, en deze orthotopic borst kanker muismodel met een juiste borstklier vet pad omgeving kan worden gebruikt voor het onderzoeken van verschillende aspecten van kanker.

Orthotopic injectie van borstkankercellen in de borstklier vet Pad muizen

Patient-derived xenograft (PDX) modellen en transplanteerbare genetisch gemanipuleerde muismodellen getrouw de menselijke ziekte samenvatten en zijn voorkeursmodellen voor fundamenteel en translationeel borstkankeronderzoek. Hier wordt een methode beschreven om borsttumorfragmenten orthotopisch in het borstvetkussen te transplanteren om tumorbiologie te bestuderen en de respons van geneesmiddelen te evalueren.

Orthotopische transplantatie van borsttumoren als preklinische modellen voor borstkanker

Hier beschrijven we een niet-invasieve monitoringmethode met luciferase en groene fluorescerende eiwitexpressie in verschillende borstkankercellijnen. Dit protocol biedt een techniek om tumorvorming en gemetastaseerde kolonisatie in realtime bij muizen te volgen.

Monitoring van borstkankergroei en gemetastaseerde kolonievorming bij muizen met behulp van bioluminescentie

Het huidige protocol beschrijft intratibia osteosarcoom celinjectie om muismodellen te genereren met orthotopisch osteosarcoom en pulmonale metastase laesies.

Intratibiale osteosarcoomcelinjectie om orthotopisch osteosarcoom en longmetastase muismodellen te genereren

Het identificeren van nieuwe geneesmiddeldoelen die overgaan van preklinisch onderzoek naar menselijke proeven is een wetenschappelijke prioriteit. Daartoe beschrijven we hier een functionele genoombenadering voor het onderzoeken van de impact van gendepletie op kankerstamlijnsferoïden, die menselijke kankers beter modelleren in vivo.

Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer

Er werd een chirurgische procedure ontwikkeld om mamma-tumorcellen via injectie in de poortader in de muizenlever af te leveren. Dit model maakt onderzoek naar late stadia van levermetastase mogelijk bij een volledig immuuncompetente gastheer, inclusief extravasatie van tumorcellen, zaaien, overleven en metastatische uitgroei in de lever.

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

Leer een orthotopisch borstkankermodel voor triple negatieve borstkanker met GFP-tagging en bioluminescentiebeeldvorming. Deze methode verbetert de detectie van micrometastasen en de evaluatie van therapeutische effectiviteit.

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

Meer video's verkennen