Pneumococcus-infectie van primaire humane endotheliale cellen in constante stroming

Het gebruik van dit endotheelcelkweeksysteem maakt assimilatie van de situatie in de bloedstroom mogelijk. En met deze situatie kunnen we bacteriële infectieprocessen analyseren, inclusief de identificatie van bacteriële vectoren en ook van celvectoren die bij dit proces betrokken zijn. Deze techniek maakt de weg vrij om de impact van bacteriële infecties op de vasculaire integriteit te onderzoeken, ook met inbegrip van de impact op morfogenese mechanismen, op ontstekingsreacties en immuunregulatie.

Deze techniek vereist een speciale behandeling van de endotheelcellen en daarom is een visuele beschrijving beter dan alleen een verbale uitleg. Deze methode biedt inzicht in verschillende andere gebieden van onderzoek gecorreleerd met geperfundeerde vasculaire systemen zoals endotheelcel differentiatie, wondgenezing, tumor genesis en angiogenese. Een van de belangrijkste stappen is gestandaardiseerde celteelt en nauwkeurige behandeling van primaire endotheelcellen.

Deze techniek vereist een aantal speciale cel cultuur behandeling die niet duidelijk kon worden door alleen verbale uitleg. Om te beginnen, werken in een steriele omgeving met behulp van een schone bank. Gebruik een pipet om 100 microliter van een 2% steriel gefilterde varkens gelatine PBS-oplossing te injecteren in een enkel reservoir van een temperatuur geëquilibreerde kanaalschuif.

Plaats de gelatine gecoate kanaalplaat op een dunne polystyreen- of piepschuimplaat om een daling van de schuiftemperatuur met een Luer-spuit van één milliliter te voorkomen om 100 microliter van de vier keer 10 tot de vijfde per milliliter HUVEC-suspensie in de glijbaan toe te voegen aan zaad en de HUVEC te cultiveren. Incubeer de kanaalglijbaan met de HUVEC gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Vul daarna elk medium reservoir aan beide uiteinden van de kanaalschuif met 60 microliter ecgms-medium.

Incubeer nog een uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Vervolgens, om de microfluidic pomp aan te passen, sluit eerst de geëquilibreerde perfusie set aan op de pomp unit, vul met 13,6 milliliter ECGMS medium en start de pomp controle software. Selecteer in het menu van de fluidic unit setup de adequate perfusieset en het type kamerdia met de schuif-naar-beneden vensters.

Kies 0,007 dyne seconde per vierkante centimeter in de software voor gemiddelde viscositeit. Sluit buiten de couveuse een glazen fles gevuld met drogende silicakralen aan op de luchtdrukbuizen. Selecteer stroomparameters in het softwaremenu, stel de druk in op 40 millibar en spoel de pompbuizen door met het vloeistofmedium door de continue medium flow te starten.

We zorgen voor een strakke celbevestiging door subconfluently gekweekte HUVECs te gebruiken en richten ons bovendien op het uit het systeem halen van luchtbellen en het gebruik van onafhankelijke voeding voor het pompsysteem. Tik op de buizenaansluitingen om luchtbellen te verwijderen en ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in het pompsysteem circuleren. Voor het aansluiten van de kanaalschuif stopt u de stroomcirculatie in de pompbesturingssoftware en houdt u de mediumstroom en de perfusiebuizen vast door de buizen in de buurt van de Luer-verbinding te klemmen.

Sluit de kanaalschuif aan en vermijd luchtbellen. In de geavanceerde tabblad pompbesturingssoftware, gebruik de maker van de softwaretoolcyclus om de gewenste schuifspanningscycli voor stroomteelt te programmeren. Programmeer de schuifspanningsniveaus voor de stroomcirculatie en start op lange termijn perfusie.

Begin met vijf dyne per vierkante centimeter die overeenkomt met een stroomsnelheid van 5,44 milliliter per minuut gedurende 30 minuten, gevolgd door continue stroom bij schuifspanning van 10 dyne per vierkante centimeter wat overeenkomt met een stroomsnelheid van 10,85 milliliter per minuut. Controle evenwichtige reservoir pompen. Plaats de fluidic unit met de aangesloten kanaalschuif in een couveuse op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

Start de microscoopsoftwarecontrole en pas de principeinstellingen voor de fluorescentiemicroscopische monitoring aan door de juiste filterinstellingen te selecteren. Voor microscopische visualisatie, plaats de vloeibare eenheid in de 37 graden Celsius verwarmingskamer. Plaats de kanaalglijbaan op het podium van een voorverwarmde microscoop.

Controle van de celmorfologie en de integriteit van de HUVEC laag voorafgaand aan injectie van histamine en bacteriën aan de stroomcirculatie. De stroominstelling behouden. Induceer het vrijkomen van VWF uit endotheel levensvatbare Palade-lichamen door 136 microliter van een 100 millimolar histamine-voorraadoplossing te injecteren via een injectiepoort in het ECGMS-medium dat in de perfusieslang circuleert.

Voor immunofluorescentiedetectie van multimerized VWF-snaren injecteer u 20 microgram van een VWF-specifiek FITC-geconjugeerd antilichaam in een volume van 200 microliter PBS in het circulerende 13,6 milliliter ECGMS-medium. Voor het kwantificeren van Pneumokokkenbehechtheid aan de VWF-snaren die op HUVEC-celoppervlakken worden gegenereerd, injecteer u 1,35 keer 10 tot de achtste CFU per milliliter RFP die Pneumokokken uitdrukken in een maximaal volume van één milliliter in het ECGMS-medium met behulp van de injectiepoort. Selecteer een 63X olieonderdompelingsdoelstelling voor microscoopvergroting en pas de fluorescentiefilterinstellingen in de microscoopsoftware aan op het RFP-kanaal met een detectiefilter van 540 nanometer voor detectie van RFP-uitdrukken van Pneumokokken.

Voor kwantificering van bacteriële gehechtheid aan de VWF-snaren, maak snapshots van Z-stapels van ten minste 30 representatieve veldweergaven die elk ongeveer 10 morfologisch intacte HUVEC bevatten en de hoeveelheid Pneumokokken tellen. Om bacteriële gehechtheid na fixatie te evalueren voorafgaand aan immunofluorescente kleuring, stop de stroom, verwijder 10 milliliter ECGMS-medium uit de pompreservoirs en voeg 10 milliliter PBS toe, aangevuld met 5%paraformaldehyde en ga volgens het manuscript verder. In dit protocol beginnen de belangrijkste experimentele stappen met een preteelt van primaire endotheelcellen tot subconfluency in celkweekkolven.

Cellen worden vervolgens gezaaid in een gelatine-gecoate kanaal dia. Bacteriën worden gekweekt op agar platen, gevolgd door de teelt in een complexe vloeibare medium tot halverwege log fase. Voor microfluïde celkweek is een kanaaldia met endotheelcellen verbonden met de perfusiebuizen van een vloeibare eenheid van het pompsysteem en onderworpen aan constante stroom voor celdifferentiatie.

De generatie van de VWF-snaren werd veroorzaakt door histamine-injectie bij een afschuifspanning van 10 dyne seconde per vierkante centimeter en microscopisch gecontroleerd door immunofluorescentiedetectie met behulp van FITC-gelabelde VWF-specifieke antilichamen. Na injectie van rode fluorescentie-eiwit uitdrukken bacteriën aan het circulerende medium, Pneumokokken gehechtheid aan de VWF snaren werd microscopisch gevisualiseerd in real time door fluorescentie emissie op 450 nanometer. Na fixatie van de cellen met behulp van PFA, differentiële immunofluorescentie kleuring biedt de visualisatie van bacteriële gehechtheid op specifieke infectie tijdstippen.

De belangrijkste stap van deze procedure is het garanderen van een strakke celbevestiging op het schuifoppervlak door fysiologische afschuifspanningsniveaus aan te passen en extreme schommelingen in de pompdruk te voorkomen. Naast de microscopische visualisatie kan deze techniek worden toegepast om farmacologische effecten van nieuwe anti-infectieve te bestuderen en ook om de gevolgen op lange termijn van de vasculaire infectieprocessen te analyseren. Dit pompsysteem doorverbrandt bacteriële ziekteverwekkers door luchtdruk om elke overdracht via aerosolen te voorkomen.

Het wordt aanbevolen om de bioveiligheidsmaatregelen te volgen.