Name: Contusie ruggenmergletsel via een microchirurgische laminectomie in de regeneratieve axolotl (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Leer een gestandaardiseerde contusiebehandeling bij axolotls voor ruggenmergregeneratieonderzoek met behulp van Ambystoma mexicanum. Deze microchirurgische laminectomie bootst klinisch trauma na.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Michael Pedersen, Universiteit van Aarhus voor zijn expertise en tijd bij het ontwikkelen van MRI-protocollen en het opzetten van het hele project. Peter Agger, Universiteit van Aarhus voor zijn expertise en tijd bij het ontwikkelen van de MRI-protocollen. Steffen ring Gard, Universiteit van Aarhus voor zijn expertise en tijd bij het ontwikkelen van de MRI-protocollen. De ontwikkeling van het SCI-model in de axolotl werd vriendelijk ondersteund door de A.P. Møller Maersk Foundation, de Riisfort Foundation, de linex Foundation en de ELRO Foundation.

Alle toepasselijke institutionele en overheidsverordeningen betreffende het ethisch gebruik van dieren werden tijdens deze studie gevolgd. De studie werd uitgevoerd onder de goedkeurings-id: 2015-15-0201-0061 door de Deense Animal experiment inspectie. Dieren waren Mexicaanse Axolotls (Ambystoma mexicanum, gemiddelde lichaamsmassa ± STD: 12,12 g ± 1,25 g).
1. voorbereiding
<ol><li>
Bereid Axolotl voor anesthesie.
	<ol>
<li>Gebruik hoogkwalitatief niet-chemisch behandeld kraanwater. Gebruik, indien niet beschikbaar, de oplossing van 40% Holtfreter.</li>
		<li>Los 200 mg ethyl 4-aminobenzoaat (benzocaïne) op in 3 mL aceton. Los deze oplossing op in 1 liter kraanwater of 40% Holtfreter's oplossing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik een standaard Petri schaaltje (100 mm in diameter) geplaatst onder een stereomicroscoop als een chirurgische tafel. Plaats een chirurgische textiel doek op de Petri schaal. Opmerking: Het gebruik van een Petri schaal als chirurgisch gebied maakt het mogelijk om het dier te bewegen en te roteren zonder het aan te raken, zodat de ruggengraat stabiel is tijdens de operatie.</li>
	<li>Bereid alle steriele microchirurgische instrumenten (d.w.z. een schaar en een anatomisch Tang).</li>
</ol>2. anesthesie
<ol><li>Plaats de axolotl in een container met benzocaïne oplossing voor ongeveer 45 min om een diepe en stabiele anesthesie te garanderen. Opmerking: De gegeven concentratie van benzocaïne zal anesthesie veroorzaken in alle maten van Axolotls.</li>
	<li>Controleer op tekenen van narcose binnen 30-45 min. Deze omvatten een volledig gebrek aan Kieuw bewegingen, rechtse reflex of reactie op tactiele of pijnlijke stimuli (zachte knijpen van Teen web).</li>
	<li>Om anesthesie te handhaven, wikkel de dieren in papieren handdoeken bevoafd in de verdovings oplossing. Bevochtig deze regelmatig met deze oplossing tijdens de chirurgische ingreep om ervoor te zorgen dat de huid en de kieuwen vochtig worden gehouden.</li>
	<li>Herstel het dier na de ingreep door het in een bakje met vers kraanwater te plaatsen. Observeer de tekenen van herstel, zoals Gill Movement en herwonnen rechts reflex, binnen 1 h16.</li>
</ol>3. microchirurgische laminectomie
Opmerking: De laminectomie wordt uitgevoerd onder een stereomicroscoop.
<ol><li>Plaats het dier in de liggende positie op de Petri schaal. Wikkel het in papieren handdoeken zodat de staart wordt blootgesteld. Opmerking: De papieren handdoeken zijn uitstekend geschikt voor het garanderen van stabiliteit gedurende de hele procedure.</li>
	<li>
Identificeer de achterpoten. Maak de eerste incisie gewoon caudal voor hen.
	<ol>
<li>Met een paar micro schaar, voer een verticale incisie van de kiel totdat de benige prominentie van de stekelige processen worden gevoeld. Opmerking: Wees heel voorzichtig bij het grijpen van de kiel en de huid met een tang, omdat deze gemakkelijk schade toebrengen aan de delicate huid.</li>
		<li>Strek de snede lateraal, zodat de incisie doorloopt de gehele breedte van de staart.</li>
		<li>Pak het stekelige proces met de tang om de juiste diepte te garanderen.</li>
		<li>Strek de verticale incisies 1 mm onder het stekelige proces aan beide zijden uit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plaats het dier aan de ene kant om ventrale en horizontale incisies uit te voeren zoals hieronder vermeld.
	<ol>
<li>Met een paar micro schaar, beginnend vanaf het ventrale punt van de verticale incisie, maak een horizontale incisie van ongeveer 15 mm voor dieren 10-20 g in gewicht. Maak de incisie langer voor grotere dieren, en korter voor kleinere dieren.</li>
		<li>Met behulp van de schaar, ontleden mediaal door de horizontale incisie totdat de wervelkolom wordt gevoeld in de middenlijn.</li>
		<li>Herhaal de stappen 3,3, 3.3.1 en 3.3.2 aan de andere zijde van het dier.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Na ontleed in het diepe mediale vlak van beide zijden, ontleden door de middellijn, waardoor de twee horizontale incisies verbinden.
	<ol>
<li>Verplaats het vrije stuk van de staart en de Kiel naar één kant, waardoor de stekelige processen worden blootgesteld (Figuur 1).</li>
		<li>Fixeren het staartstuk met natte papieren handdoeken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plaats het dier opnieuw in de liggende positie met het hoofd naar de niet-dominante kant van de chirurg.
	<ol>
<li>Met een paar tang, pak de stekelige processen net caudal aan de achterpoten. Breng een zachte lift aan, zowel omhoog als naar het hoofd van het dier.</li>
		<li>Plaats de messen van een paar microscissors horizontaal rond het proces en knip het voorzichtig af. De lift op het proces zorgt ervoor dat het nu wordt verwijderd, waardoor het ruggenmerg wordt blootgesteld.</li>
		<li>Pak het stekelige proces net caudal aan degene die net is verwijderd en herhaal stap 3.5.1 en 3.5.2. Opmerking: Dit moet een blootgestelde ruggenmerg die overeenkomt met twee wervel niveaus achterlaten. Bij het uitvoeren van de laminectomie verschijnt er vaak een witte schuimige afscheiding. Het ruggenmerg wordt gemakkelijk geïdentificeerd door zijn kenmerkende glans, samen met een schip dat langs de middenlijn loopt.</li>
		<li>Afhankelijk van de grootte van het dier, kan het blootgestelde gebied niet breed genoeg zijn. Gebruik twee paar tang, pak de laminaten aan beide zijden van het ruggenmerg en draai deze lateraal met een zachte beweging.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. het introduceren van een contusie type letsel (Figuur 2)
<ol><li>Houd het dier in de liggende positie.</li>
	<li>Gebruik de Petri schaal om het dier over te brengen naar de trauma-eenheid.</li>
	<li>Laat een assistent een zaklamp schijnen op het ruggenmerg.</li>
	<li>Plaats de contusie trauma unit cilinder boven het blootgestelde ruggenmerg met behulp van de micro-adjusters op het apparaat. Richt door de cilinder.</li>
	<li>Verlaag de cilinder tot het niveau met de laminae.</li>
	<li>Bevestig de vallende staaf aan de elektromagneet. Plaats de gewenste dalende hoogteverstelling cilinder op de trauma unit.</li>
	<li>Plaats de vallende staaf in de cilinder. Opmerking: Voor een geblindeerde studie moet de chirurg nu de kamer verlaten zonder te weten of het dier zal worden toegewezen aan een blessure of een schijn operatie groep.</li>
	<li>Schakel de elektromagneet uit. De staaf valt aan het blootgestelde ruggenmerg.</li>
	<li>Gebruik de hoogteverstelling schroef om de stang van het ruggenmerg te tillen.</li>
	<li>Bevestig het letsel door te kijken naar het ruggenmerg door de Microscoop. De geblesseerde plaats zal donkerder lijken, en bloeden uit het middenlijnvat zal duidelijk zijn.</li>
</ol>5. Maak kennis met een scherp letsel
Opmerking: Voer deze stappen uit na 3.5.4.
<ol><li>Met een paar micro schaar snijd het ruggenmerg in een perfecte verticale snede.</li>
	<li>Herhaal de snede 2 mm naar de caudale kant van het lichaam. Opmerking: De lengte van het verwijderde stukje ruggenmerg kan worden aangepast volgens de vereiste van de studie. Echter, een 2 mm snede zal worden regenereerbaar10.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de sneden compleet zijn. Na voltooiing, voel de messen van de schaar schrapen langs het ventrale deel van het wervelkanaal.</li>
	<li>Til het 2 mm-stukje ruggenmerg van het wervelkanaal.</li>
</ol>6. sluiten van de chirurgische wond
<ol><li>Keer het dier terug naar de chirurgische tafel. In een geblindeerde studie, herpositioneer de kiel zodat het ruggenmerg niet zichtbaar is voor de chirurg.</li>
	<li>
Houd het dier in de liggende positie.
	<ol>
<li>Begin met het plaatsen van 10,0 nylon hechtingen van het meest caudale deel van de horizontale incisie. Sluit de wonden in één laag. Opmerking: De huid niet te strak te vatten, want het zal het toebrengen van necrose.</li>
		<li>Werken naar het verticale deel van de incisie.</li>
		<li>Bij het bereiken van de hoek, draai de Petri schaal en hechting van de andere horizontale incisie.</li>
		<li>Stel hechtingen op de verticale incisies.</li>
		<li>Plaats geen hechtingen in het bovenste deel van de Kiel, omdat de huid hier niet in staat zal zijn om vast te houden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. retourneren van het dier naar de Verdovings vrije oplossing
<ol><li>Til de Petri schaal met het dier en Dompel beide zeer zachtjes in zoet water slechts 5 cm diep en laat het dier eraf glijden. Opmerking: De ondiepe waterdiepte zorgt ervoor dat het dier niet zal proberen te zwemmen naar het oppervlak om te ademen.</li>
	<li>Verander het water tijdens de eerste week niet.</li>
	<li>Zorg er bij het voederen van de dieren voor dat het voedsel in de buurt van het hoofd van het dier wordt geplaatst. Opmerking: Het doel van deze maatregelen is om zoveel mogelijk beweging te vermijden tijdens de eerste week.</li>
</ol>8. postoperatieve echografie
<ol><li>Voorafgaand aan de beëindiging van de anesthesie, gebruik maken van een hoge frequentie echografie systeem om beelden van de verwonding die kan worden gebruikt voor de bouw van driedimensionale beelden van de SCI-site te verwerven.</li>
	<li>Bevestig de transducer aan een micro manipulator die bij voorkeur bestuurd wordt door een externe joystick.</li>
	<li>Dompel de verdoving dier in de liggende positie in een kleine container gevuld met anesthetische oplossing. Opmerking: Bevestig het dier met miniatuur zandzakken of andere apparatuur om beweging te voorkomen tijdens de scan volgorde.</li>
	<li>Lijn de punt van de transducer uit met de lengte-as van het dier en dompel het in de benzocaïne oplossing totdat het slechts een paar millimeter boven de kiel achter de achterpoten van het dier ligt.</li>
	<li>Identificeer de SCI-site. Opmerking: De wond site is gemakkelijk herkenbaar als gevolg van de ontbrekende stekelige processen direct boven het Sci.</li>
	<li>Optimaliseer de afbeelding door de echografie-instellingen aan te passen. Zorg ervoor dat de SCI-site zich in het midden van de afbeelding bevindt. Pas het gezichtsveld aan (d.w.z. de beeld diepte, de diepte verschuiving en de breedte van de afbeelding) om de SCI-site en het aangrenzende gezonde weefsel te bedekken. Pas de tweedimensionale versterking aan om het beeldcontrast te optimaliseren.</li>
	<li>Door de ultrasone transducer over de SCI-site te vegen met een elektronisch bediende micro manipulator, verkrijgt u B-modus beelden die de SCI-site bedekken op meerdere cross-sectionele segment locaties van het sagittale, met opeenvolgende segmenten met een interslice-interval van 50 μm. Verkrijg Cine-images met 500 frames met een framesnelheid van ~ 50 frames/s en een transducer frequentie van 40 MHz. Opmerking: Deze instelling vereist een elektronische micromanipulator bestuurd door een externe joystick (stap 8,2).</li>
	<li>Na het afronden van de scan sequentie keert u terug naar stap 7.</li>
</ol>

<ol><li>Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+Long-Term+Survival+After+Spinal+Cord+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Physical+Medicine+and+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury.</a> Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).</li>
<li>Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+management+and+quality+of+life+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physical+Medicine+%26+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Bladder management and quality of life after spinal cord injury.</a> American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).</li>
<li>Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stockholm+spinal+cord+injury+study%3A+1.+Medical+problems+in+a+regional+SCI+population%5BTitle%5D)+AND+%22Paraplegia%22%5BJournal%5D)">The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population.</a> Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).</li>
<li>Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+traumatic+spinal+cord+injury+in+Denmark%2C+1990-2012%3A+a+hospital-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study.</a> Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).</li>
<li>Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+and+incidence+of+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury.</a> Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).</li>
<li>Aguayo, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerative+and+regenerative+responses+of+injured+neurons+in+the+central+nervous+system+of+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).</li>
<li>Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+mesencephalic+neurons+survive+and+extend+long+axons+across+peripheral+nervous+system+grafts+inserted+into+the+adult+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum.</a> Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).</li>
<li>Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+long+spinal+axons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of long spinal axons in the rat.</a> Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).</li>
<li>Butler, E. G., Ward, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+spinal+cord+following+ablation+in+urodele+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae.</a> Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).</li>
<li>Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+control+of+miR-125b+levels+is+required+to+create+a+regeneration-permissive+environment+after+spinal+cord+injury%3A+a+cross-species+comparison+between+salamander+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat.</a> Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).</li>
<li>Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+descending+axons+in+the+spinal+cord+of+the+axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl.</a> Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).</li>
<li>McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+central+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration+from+the+implanted+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres.</a> Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).</li>
<li>Thygesen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinically+relevant+blunt+spinal+cord+injury+model+in+the+regeneration+competent+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail.</a> Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).</li>
<li>Goss, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoss%2C+RJ+%22Principles+of+Regeneration%22">Principles of Regeneration</a>. , Academic Press. New York. (1969).</li>
<li>Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axolotl+limb%3A+a+model+for+bone+development%2C+regeneration+and+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing.</a> Bone. 40 (1), 45-56 (2007).</li>
<li>Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propofol+%282%2C6-diisopropylphenol%29+is+an+applicable+immersion+anesthetic+in+the+axolotl+with+potential+uses+in+hemodynamic+and+neurophysiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments.</a> Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).</li>
<li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Progress+of+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Progress of Physiology.</a> The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Omdat het risico op letsel aan het ruggenmerg significant is, verwijderen de kritische stappen van het protocol de spineuze processen en verbreding van de benige toegang tot het Ruggenmergkanaal indien nodig. Zoals vermeld in het Protocol, het verwijderen van de meest craniale proces eerst wordt sterk aanbevolen. Dit zal betekenen dat de meer caudale processen het ruggenmerg beschermen tegen het raken van de schaar. Het wordt aanbevolen om te zorgen voor voldoende chirurgische toegang, wat betekent dat niet te klein een ...

Het algemene doel van deze studie was het vaststellen van een gecontroleerde en reproduceerbare microchirurgische methode voor het toebrengen van bot en scherp SCI aan de axolotl (Ambystoma mexicanum), het produceren van een regeneratief ruggenmergletsel model.
SCI is een ernstige aandoening die, afhankelijk van het niveau en de omvang, neurologische handicaps aan de extremiteiten veroorzaakt, samen met een verminderde blaas-en darm controle1,2,3. De meeste Sci zijn het resultaat van High Energy Blunt trauma zoals verkeersongevallen en vallen4,5. Scherpe verwondingen zijn zeer zeldzaam. Daarom is het meest voorkomende macroscopische letsel type contusies.
Het centrale zenuwstelsel van zoogdieren (CNS) is een niet-regeneratief weefsel, vandaar dat er geen herstel van neurologische weefsels na Sci wordt gezien6,7,8. Aan de andere kant, sommige dieren hebben een intrigerende vermogen om te regenereren weefsels, met inbegrip van CNS weefsel. Een van deze dieren is de axolotl. Het wordt veel gebruikt in studies van regeneratieve biologie en is van belang in het ruggenmerg regeneratie, omdat het een gewervelde9,10,11,12.
De meeste Sci-onderzoeken in de axolotl worden uitgevoerd als amputatie van de gehele staart of ablatie van een groter deel van het ruggenmerg9,10,11,12. Onlangs werd een nieuwe studie gepubliceerd over Blunt blessures13 die klinische situaties beter nabootst. Terwijl complete amputatie van het aanhangsel in de axolotl resulteert in volledige regeneratie, zijn sommige niet-amputatie-gebaseerde regeneratieve verschijnselen afhankelijk van het kritische grootte defect (CSD)14,15. Dit betekent dat verwondingen die een kritische drempel overschrijden niet worden geregenereerd. Om een regeneratief model met een hogere klinische translationele waarde te ontwikkelen, onderzocht deze studie of een botte trauma van 2 mm de CSD-limiet zou overschrijden.
Deze methode is relevant voor onderzoekers die werken aan ruggenmerg regeneratie in kleine diermodellen, vooral in de axolotl. Bovendien kan het van meer algemeen belang zijn, omdat het een manier vertoont om standaard laboratoriumapparatuur te gebruiken om een stompe trauma mechanisme te ontwikkelen dat geschikt is voor gebruik bij kleine dieren in het algemeen.

<table><tbody><tr><td>25 g custom falling rod</td><td>custom home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mm PVC pipe</td><td>custom home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-64-1</td><td>Propanon</td></tr><tr><td>Axolotl (Ambystoma mexicanum)</td><td>Exoterra GmbH</td><td>N/A</td><td>12-22 cm en 10 g - 80 g, Alle stammen (wildtype, melanoïd, wit, albino, transgeen wit met GFP)</td></tr><tr><td>Benzocaïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94-09-7</td><td>ethyl 4-aminobenzoaat</td></tr><tr><td>Elektromagneet</td><td>custom home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Excel 2010 of nieuwer</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>ImageJ 1.5e of nieuwer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microchirurgische instrumenten</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pincet en schaar</td></tr><tr><td>MS550s</td><td>Fujifilm, Visualsonics</td><td>MS550s</td><td>40 MHz centrumfrequentie, transducer</td></tr><tr><td>MS700</td><td>Fujifilm, Visualsonics</td><td>MS700</td><td>50 MHz centrumfrequentie, transducer</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>elke fabrikant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zachte doek</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Elk stuk zachte doek van ongeveer 70 x 55 cm2, bijv. een theedoek</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100</td><td>Fujifilm, Visualsonics</td><td>Vevo 2100</td><td>Ultrasoon systeem met hoge frequentie</td></tr></tbody></table>

contusie ruggenmergletsel via een microchirurgische laminectomie in de regeneratieve axolotl

Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl

Het doel van deze studie is het vaststellen van een gestandaardiseerd en reproduceerbaar regeneratief botte ruggenmergletsel model in de axolotl (Ambystoma mexicanum). De meeste klinische ruggenmergletsels optreden als hoge energie botte trauma's, inducerende contusie verwondingen. Echter, de meeste studies in het ruggenmerg van Axolotl zijn uitgevoerd met scherpe trauma's. Vandaar dat deze studie bedoeld is om een meer klinisch relevant regeneratief model te produceren. Vanwege hun indrukwekkende vermogen om bijna elk weefsel te regenereren, worden Axolotls veel gebruikt als modellen in regeneratieve studies en zijn ze intensief gebruikt in ruggenmergletsel (SCI) studies. In dit protocol wordt de Axolotls verdoiliseerd door onderdompeling in een benzocaïne oplossing. Onder de Microscoop wordt een hoekige incisie bilateraal gemaakt op een niveau dat net caudal is voor de achterpoten. Vanuit deze incisie is het mogelijk om de spineuze processen te ontleden en bloot te leggen. Met behulp van een tang en een schaar wordt een laminectomie op twee niveaus uitgevoerd, waardoor het ruggenmerg wordt blootgesteld. Een aangepaste trauma-apparaat bestaande uit een vallende staaf in een cilinder is geconstrueerd, en dit apparaat wordt gebruikt voor het induceren van een contusie letsel aan het ruggenmerg. De incisies worden vervolgens gehecht, en het dier herstelt van anesthesie. De chirurgische aanpak is succesvol in het blootstellen van het ruggenmerg. Het trauma mechanisme kan contusie verwondingen veroorzaken aan het ruggenmerg, zoals bevestigd door histologie, MRI en neurologisch onderzoek. Ten slotte regenereert het ruggenmerg van het letsel. De kritieke stap van het protocol is het verwijderen van de stekelige processen zonder schade aan het ruggenmerg. Deze stap vereist opleiding om een veilige procedure te waarborgen. Bovendien is wondsluiting sterk afhankelijk van het niet toebrengen van onnodige schade aan de huid tijdens incisie. Het protocol werd uitgevoerd in een gerandomiseerde studie van 12 dieren.

Het doel van het protocol is om een SCI te produceren dat de motorische en sensorische functies van de verwonding zal verlamen. Omdat de axolotl regeneratie-competent is, herstelt de functie binnen enkele weken, waardoor onderzoekers CNS regeneratie kunnen bestuderen tijdens een korte tijdspanne.
Anesthesie werd verstrekt voor 45 min aan alle dieren, en geen afleveringen van premature herstel werden ervaren. Alle dieren hersteld binnen een uur en toonde geen tekenen van schade door anesthesie ...

Dit manuscript presenteert protocollen voor het chirurgisch toebrengen van gecontroleerde bot en scherpe ruggenmergletsels aan een regeneratieve Axolotl (Ambystoma mexicanum).

Contusie ruggenmergletsel via een microchirurgische laminectomie in de regeneratieve axolotl

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma ...

Dit protocol is de eerste om een gestandaardiseerde kneuzing type letsel in axolotl ruggenmerg regeneratie onderzoek te introduceren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het het trauma in de dagelijkse kliniek nabootst, waardoor de kans groter wordt dat een toekomstige bevinding kan worden vertaald. De kneuzing letsel apparaat kan worden gebruikt in een ander klein dier model van dwarslaesie.De chirurgische techniek is moeilijk, vooral de laminectomie. Daarom is het raadzaam om de procedure op een groot aantal dieren ex vivo te trainen voordat u overgaat tot een in vivo operatie. Om te beginnen, het opzetten van een chirurgische tafel door het plaatsen van een standaard Petri schotel onder een stereo microscoop, op de top van een chirurgische textiel doek.Plaats de verdoofde axolotl in de gevoelige positie op de petrischaal en wikkel het in papieren handdoeken, zodat de staart wordt blootgesteld. Identificeer de achterste ledematen en gebruik een micro schaar om de eerste incisie net caudal aan hen te maken. Maak de verticale incisie van de kiel tot de benige bekendheid van de spineuze processen worden gevoeld.Breid de snede zijdelings uit, zodat de incisie de gehele breedte van de staart doorkruist en de spineuze processen met tangen grijpt om de juiste diepte te garanderen. Vervolgens strek de verticale incisie een millimeter onder het spinous proces aan beide zijden. Plaats het dier aan de ene kant, en vanaf het ventrale punt van de verticale incisie, maak een horizontale incisie van ongeveer 15 millimeter voor dieren die 10 tot 20 gram in gewicht.Gebruik de schaar om onmiddellijk te ontleden door de horizontale incisie totdat de wervelkolom wordt gevoeld in de middellijn. Zet het dier vervolgens aan de andere kant en herhaal het proces. Na het ontleden in de diepe mediale vlak van beide zijden, ontleden door de middellijn om de twee horizontale insnijdingen te verbinden.Beweeg vervolgens het vrije stuk staart en kiel naar één kant om de spineuze processen bloot te leggen. Plaats het dier in de gevoelige positie met het hoofd naar de niet-weelderige kant van de chirurg, en gebruik een paar tangen om de spineuze processen te grijpen, net caudal aan de achterste ledematen. Breng een zachte lift omhoog en naar het hoofd van het dier.Plaats de messen van een micro schaar horizontaal rond het proces en snijd het voorzichtig door, waardoor het ruggenmerg wordt blootleggen. Pak het spineuze proces caudal aan de ene net verwijderd, en herhaal het proces. Het is absoluut noodzakelijk dat u een constante lift op het spinous proces houdt om ervoor te zorgen dat het geen schade aan het ruggenmerg toebrengt wanneer verwijderd.Als het blootgestelde gebied niet breed genoeg is, gebruik dan twee paar tangen om de laminae aan beide zijden van het ruggenmerg te grijpen en ze zijdelings te draaien met een zachte beweging. Bij het verwijderen van het spineuze proces kan het nodig zijn om dit in meerdere stappen te doen. Daarom kan het blootstellen van het ruggenmerg enkele minuten duren.Om een kneuzing type letsel te introduceren, gebruik maken van een petrischaaltje om het dier over te dragen aan de trauma-eenheid en schijnen een zaklamp op het ruggenmerg. Plaats vervolgens de kneuzingstrauma-eenheidscilinder boven het blootgestelde ruggenmerg met behulp van de microregelaars en laat de cilinder zakken totdat deze vlak is met de laminae. Bevestig de vallende staaf aan de elektromagneet en plaats de gewenste vallende hoogteverstellingscilinder op de trauma-eenheid.Plaats vervolgens de vallende staaf op de cilinder, schakel de elektromagneet uit om de staaf op het blootgestelde ruggenmerg te laten vallen en gebruik de schroef van de hoogteverstelling om de staaf weer omhoog te tillen. Als de invoering van een scherpe blessure, snijd het ruggenmerg in een perfecte verticale snede, herhaal dan de bezuinigingen twee millimeter aan de staartzijde van het lichaam. Voel de messen van de schaar schrapen langs het ventrale deel van het ruggenmergkanaal om ervoor te zorgen dat de sneden compleet zijn, en til het stuk ruggenmerg uit het kanaal.Om de chirurgische wond te sluiten, plaatst u 10 punt O nylon hechtingen van het meest caudale deel van de horizontale incisie die de wonden in één laag sluit en werkt naar het verticale deel van de incisie. Wanneer een hoek wordt bereikt, draai de petrischaal en hecht de andere horizontale incisie, dan stel hechtingen op de verticale incisies. Gebruik voorafgaand aan het beëindigen van anesthesie een hoge frequentie echografie om beelden van de verwonding te verwerven.Lijn de punt van de transducer af op de lengteas van het dier en dompel het onder in de benzocaine-oplossing totdat het slechts een paar millimeter boven de kiel achter de achterste ledematen van het dier is. Identificeer de plaats van de verwonding en verwerf beelden volgens de manuscriptrichtingen. Als je klaar bent, breng je de axolotl terug naar de verdovingsvrije oplossing door de petrischaal onder te dompelen in vijf centimeter diep zoet water en het dier eraf te laten glijden.De dwarslaesie die met behulp van dit protocol werd veroorzaakt, werden gevalideerd met behulp van hematoxylin en eosine-vlekken op gewonde en schijnoxolotls. Om regeneratie te bevestigen, werden histologische secties negen weken na de blessure voorbereid. De beelden toonden een herstelde dwarslaesieverbinding in de gewonde dieren.Letsel en regeneratie we zijn ook gevolgd door het onderzoeken van neurologische functie. De reactie van het dier op stimulatie van de staart werd gescoord met hogere scores die wijzen op hogere tactiele en nociceptieve zintuiglijke functies. Onder de gewonde dieren, was er een verlies van neurologische functie drie weken na letsel, en een geleidelijke restauratie binnen negen weken.De dwarslaesie werd ook gevisualiseerd met behulp van ultrasone grafische beeldvorming, die het mogelijk maakte voor visualisatie van de rugslagader als een marker van de integriteit van het vat. Hi-field MRI-scans werden onmiddellijk uitgevoerd na de blessure en op drie, zes en negen weken. Deze scans waren in staat om oedeem en herstel van de integriteit van het ruggenmerg te visualiseren.De scans onmiddellijk na letsel, waren gevoelig voor lawaai. Patiënt en zorgvuldige chirurgie zal de weg vrijmaken voor een succesvol resultaat na laminectomie zonder vroegtijdige schade aan het ruggenmerg. Na deze procedure kunnen verschillende in vivo methoden worden toegepast, zoals beeldvorming en elektrofysiologische technieken.

contusion-spinal-cord-injury-via-microsurgical-laminectomy

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Neurale voorloper transplantatie is een veelbelovende strategie voor de bescherming en / of vervangen van verloren / disfunctionele cervicale diafragma motorische neuronen in het ruggenmerg letsel (SCI) en de motor neuron ziekte, amyotrofe laterale sclerose (ALS). Wij bieden een protocol voor de cel levering aan cervicale ruggenmerg ventrale hoorn in knaagdiermodellen van ALS en SCI.

Intraspinale Cel Transplantatie voor Targeting Cervicale ventrale hoorn van Amyotrofische Lateraal Sclerose en traumatisch ruggenmergletsel

Source: Elzat, E. Y. Y., et al., Establishing a Mouse Contusion Spinal Cord Injury Model Based on a Minimally Invasive Technique. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the method for inducing a contusion injury at the T9 level spinal cord in a mouse model, using a spinal cord injury coaxial platform. A weight is dropped on the T9 level spinal cord that creates a contusion that immediately causes tissue discoloration and swelling.

Inducing a Spinal Cord Contusion in a Mouse Model Using a Spinal Cord Injury Coaxial Platform

Dwarslaesie is een traumatische aandoening die ernstige morbiditeit en hoge sterfte veroorzaakt. In dit werk beschrijven we in detail een kneuzing model van dwarslaesie bij muizen, gevolgd door een transplantatie van neurale stamcellen.

Neurale stamceltransplantatie bij Experimentele Contusive Model van Spinal Cord Injury

Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van een reproduceerbare spinale cord compressie letsel (SCI) in de neonatale muis. Het model biedt een voordelige platform voor het bestuderen van mechanismen van adaptieve plasticiteit die ten grondslag liggen aan spontane functionele herstel.

Een Neonatale Mouse Spinal Cord Injury Compressie Model

Hier tonen we de prestaties van een minimale ruggenmerg letsel model in een volwassen muis die de centrale kanaal niche huisvesting endogene neurale stamcellen (NSCs spaart). Laten we zien hoe de bepaling van de neurosphere kan worden gebruikt voor het kwantificeren van activering en migratie van definitieve en primitieve NSCs na verwonding.

Een test van de Neurosphere voor de evaluatie van de activering van de endogene neurale stamcellen in een muismodel van minimale dwarslaesie

Hier is een protocol voor het uitvoeren van tijd-en ruimtebeperkt gen knock-out in Axolotl ruggengraat koorden door het injecteren van CAS9-gRNA complex in het ruggenmerg centrale kanaal gevolgd door elektroporation.

Directe gen knock-out van Axolotl ruggenmerg neurale stamcellen via Elektroporation van CAS9 proteïne-gRNA complexen

Xenopus laevis kikkervis ruggenmergtranssectie is een relevante letselmethode om dwarslaesie en regeneratie te bestuderen door een dwarse snede te maken die het ruggenmerg volledig doorsnijdt op thoracale niveau.

Ruggenmerg transsectie in Xenopus laevis Kikkervis

Hier beschrijven we een nieuwe, snelle techniek voor het modelleren van open ruggenmergletsel bij ratten die laminectomie elimineert. Laterale hemisectie wordt uitgevoerd terwijl u door een microscoop kijkt. De techniek is veelzijdig en kan ook worden gebruikt in de cervicale, thoracale en lumbale regio's van het ruggenmerg van andere dieren.

Een minimaal invasieve, snelle laterale hemisectietechniek van het ruggenmerg voor het modelleren van open ruggenmergletsels bij ratten

Minimaal invasieve technieken en een eenvoudig laboratoriumapparaat verbeteren de reproduceerbaarheid van het ruggenmergletselmodel door operatieve schade aan de proefdieren te verminderen en anatomisch morfologisch onderhoud mogelijk te maken. De methode is de moeite waard omdat de betrouwbare resultaten en reproduceerbare procedure het onderzoek naar de mechanismen van ziekteherstel vergemakkelijken.

Het opzetten van een muiskneuzingsletselmodel op basis van een minimaal invasieve techniek

Het doel van deze studie was om een veilige en reproduceerbare chirurgische aanpak te standaardiseren voor het uitvoeren van een volledige transversale amputatie van de mandibula in Ambystoma mexicanum voor de studie van craniofaciaal weefselregeneratie.

Ontwerp en standaardisatie van een model voor mandibulair letsel voor de studie van craniofaciaal weefselregeneratie in het Ambystoma mexicanum model

Leer een gestandaardiseerde contusiebehandeling bij axolotls voor ruggenmergregeneratieonderzoek met behulp van Ambystoma mexicanum. Deze microchirurgische laminectomie bootst klinisch trauma na.

Contusie ruggenmergletsel via een microchirurgische laminectomie in de regeneratieve axolotl

Meer video's verkennen