Productie, kristallisatie en structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO

Dit protocol vergemakkelijkt de succesvolle structuurbepaling van het IKK bindingsdomein van NEMO, in zijn ongebonden vorm. En details van de productie en kristallisatie. Het protocol maakt gebruik van deze stabilisatie van de native bevestiging van het IKK bindingsdomeinfragment van NEMO, door middel van coiled-coil adapters, die kristallisatie en structuurbepaling vergemakkelijken.

De structurele biologie van NEMO, als doelwit, biedt een belangrijk voordeel bij de ontwikkeling van NEMO-remmers voor de behandeling van ontstekings- en auto-immuunziekten en kanker. Dit protocol kan worden uitgebreid tot de structuur bepaling van NEMO complexen, met peptide of kleine molecuul remmers voor drug ontdekking of optimalisatie. De eiwitreplooiing en concentratie, tijdens de eiwitproductiefase, zijn van fundamenteel belang voor het verkrijgen van een zuiver NEMO dimer.

Aggregatie beperken en oplosbaarheid garanderen onder kristallisatieomstandigheden. Het aantonen van de procedures zal Tamar en Amy, afgestudeerde studenten in ons laboratorium. Begin met het toevoegen van 20 milliliter geweldige bouillon oplossing.

En 20 microliter van een 100 milligram per milliliter voorraadoplossing van ampicilline. Op een Erlenmeyer-kolf van 125 milliliter. Gevolgd door een paar microliter van cel glycerol voorraad, van 80 graden Celsius opslag, van BL21DE3 bevoegde cellen.

Getransformeerd met vector. Na het schudden van de starter cultuur 's nachts, op 37 graden Celsius en 220 rotaties per minuut, verdunnen de cellen tot een OD600 van 0,1 en 250 milliliter van geweldige bouillon. En voeg ampicilline toe aan een uiteindelijke concentratie van 100 microgram per milliliter.

Wanneer de OD600 van de cultuur 0,8 tot 1 bereikt, voeg IPTG toe aan de cultuur, aan een 500 micromolarconcentratie. En laat de cellen vier uur groeien, bij 37 graden Celsius, tot de OD600 6 tot 10 bereikt. Aan het einde van de incubatie, sediment de cellen door centrifugatie.

En de pellet opnieuw op te schorten in 40 milliliter lyse buffer. Splits de opnieuw opgehangen cellen in twee 20 tot 25 milliliter aliquots. En gebruik een Franse pers om ongeveer 25.000 pond per vierkante centimeter druk toe te passen op de cellen, twee tot drie keer per aliquot, in een koude kamer.

Voeg vervolgens ureum toe aan de cellysates, tot een laatste concentratie van acht kies. En de celoplossing twee tot zestien uur uitbroeden op een schommelplatform, bij kamertemperatuur. De volgende ochtend, breng de lysates naar ultra-centrifuge buizen, tot ten minste driekwart vol, per buis.

En ulrta centrifuge de lysates, gedurende 45 minuten. Decanteer de supernatants in een 50 milliliter conische buis. En laad de ureum geïncubeerd supernatant op een IMAC kolom, op drie milliliter per minuut.

Wanneer alle supernatant door de kolom is gelopen, wast u de kolom voor 10 kolomvolumes, met bindingsbuffer, met drie milliliter per minuut. En voer gradiënt elutie van de NEMO-EEAA eiwit van 10 tot 500 millimolar imidazole, over een 12 kolom volume gradiënt. Het verzamelen van een milliliter aliquots van het eluaat, in een fractie collectie plaat.

Na SDS pagina analyse, trek de fracties met de pure doeleiwit en meet de eiwitconcentratie door Bradford test, volgens standaard protocol. Selecteer de ontweken fracties, die eiwitten bevatten. Om de HIS6-tag te klemmen en overtollige imidazool uit het monster te verwijderen, voegt u TEV protease, met een gewichtsverhouding van één tot 10, van TEV-gespleten eiwit toe aan het doeleiwitmonster.

En verwijd het monster 's nachts in vier liter van 20 millimolar Tris. 150 millimolar natriumchloride en twee millimolar DTT-oplossing. Laad de volgende ochtend het NEMO-EEAA-monster van TEV op een tweede IMAC-kolom met één milliliter per minuut.

Het verzamelen van de stroom door in een milliliter fracties, in een 96 kom fractie collectie plaat. Was de kolom met vijf volumes van 20 millimolar Tris, 150 millimolar natriumchloride en 10 millimolar imidazool oplossing, op één milliliter per minuut. Na de laatste wasbeurt, elute de TEV en oomaved HIS6 NEMO-EEAA, met drie kolomvolumes van 20 millimolar Tris, 150 millimolar natriumchloride, 500 millimolar imidazole en twee millimolar DTT oplossing, in een 50 milliliter kolf.

Trek de stroom door fracties, met cleaved NEMO-EEAA constructie en concentraat het monster met een geroerde cel concentrator, tot vijf milliliter. Na 's nachts dialyse zoals aangetoond, belasting vijf milliliter van het monster op 16 millimeter bij 60 centimeter grootte uitsluiting chromatografie kolommen. Indien nodig herhalen, afhankelijk van het monstervolume.

Op een milliliter per minuut, en op twee millimolar Tris, 100 millimolar natriumchloride en twee millimolar DDT oplossing. Na het trekken van de breuken, die overeenkomen met de dimeric NEMO-EEAA, concentreer het monster in de geroerde celconcentraator, met een moleculair gewicht afgesneden membraan van drie kilodalton, tot een uiteindelijke concentratie van 113 micromolar. Dan, aliquot het eiwit voor opslag op vier graden Celsius, voor maximaal een maand.

Voor schaarse matrix screening, voeg 60 microliter van schaarse matrix oplossing in elk van de 96 putten van een twee druppelkamer kristallisatie plaat. Voor zitten en laten vallen damp diffusie. En voeg de eiwitoplossing toe aan een robotdruppelsetter.

Gebruik vervolgens een robotdruppelsetter, om 100 nanoliter eiwitoplossing af te geven met 1,65 milligram per milliliter, in een één-op-één verhouding met reservoiroplossing in druppel één, tot een eindvolume van 200 nanoliter. En voeg 66 nanoliter eiwitoplossing met 134 nanopleer van reservoiroplossing toe, aan een eindvolume van 200 nanoliters in druppel twee. Sluit vervolgens onmiddellijk de plaat af met drie inch brede afdichtingstape.

Bewaar vervolgens de trays in een kristallisatie imager opslag, op 20 graden Celsius. Het controleren van de beelden automatisch verzameld, op de aanwezigheid van kristallen, te beginnen twee dagen na het opslaan van de platen. Voor het genereren van zaadvoorraden, breng de hele druppel met het kristal van belang, in 50 microliter van kristallisatie voorwaarde oplossing, in de meegeleverde flacon, van een zaad generatie kit.

En vortex de zaadvoorraad, met 20 seconden pulseren en 10 seconden rust, gedurende drie minuten. Verdun vervolgens de zaadvoorraad in één tot tien stappen in serie, tot één tot 10.000. En bewaar de verdunningen op vier graden Celsius, tot verder gebruik.

Een tot twee dagen voor verzending naar synchrotron, snijd de tape van de bovenkant van de put, met het kristal van belang. En voeg 0,5 microliter kristallisatieoplossing toe met 12%één, twee propaan DiO cryoprotectant, direct aan de put. Verjagen het kristal voorzichtig met een cryo-lus.

Loop het kristal uit de put en bewaar het kristal met cryo-lus in een puck ondergedompeld in vloeibare stikstof, tot verzending voor röntgendiffractie. Na ontvangst van de röntgendiffractiegegevens verwerkt u de geschaalde intensiteiten in de STAR- en ISO-server. Met behulp van een x-ray kristallografie indexering afgesneden gemiddelde, van 1,2 voor de diffractie limiet oppervlak voor de gegevens.

En laad op Phoenix. Om de structuur te bepalen, gebruik de röntgenstructuur van GCN4 als zoekmodel voor moleculaire vervanging, met behulp van MRage in Phoenix. De 4DMD structuur, zal worden gedefinieerd als een ensemble.

En de MRage-oplossing zal met succes bouwen aan het structuurgedeelte, wat overeenkomt met de eindterminal coiled-coil adapter van NEMO-EEAA. aan het zoekmodel, voor beide kettingen in het dimer. Het over uitgedrukte eiwit verschijnt bij een band, bij ongeveer 14 kilodalton moleculaire gewichtsteller, vóór de eerste kolomzuivering IMAC.

En toont een monomeer band en een dimer band, op 14 en 28 kilodaltons, respectievelijk, na de eerste elutie. TEV decolleté is na de elutie na de elutie vrijwel compleet via de tweede IMAC-kolom. Bijna volledig als een dimer, op het verwachte molecuulgewicht.

Grootte uitsluiting chromatografie, toont een enkele piek, ontgaan tussen 60 tot 65 milliliter, die reageren op de dimer. Fijne screening produceert kristallen die kunnen worden gebruikt om een zaadvoorraad te produceren voor de productie van NEMO-EEAA-kristallen, voor het verzamelen van gegevens. Hier worden representatieve NEMO-EEAA kristallen diffractieprofielen getoond.

Structurele analyse van het NEMO-EEAA eiwit, onthult een homodimerische onregelmatige parallelle coiled-coil, ongeveer 175 angstroms in lengte. De reguliere coiled-coil regio, omvat de ideale coiled-coil adapter sequentie, aan het einde eindeinde. En de eerste twee heptads van de NEMO juiste sequentie.

Een regelmatige opgerolde spoel, is ook aanwezig op de C eindpunt. Te beginnen bij NEMO residu 97 en omvat de C terminal ideale coiled-coil adapter. De IKK beta gebonden structuur, toont een meer open coiled-coil bevestiging, om de ligand tegemoet te komen.

Met een grotere interhelical afstand door één tot 2.2 angstroms in dit gebied. De structuur van een ligand in NEMO, biedt een nieuw doel voor het ontwerp van remmers door middel van computationele methoden. En voor de visuele screening van bindingszakken met kleine moleculebibliotheken.

We hebben nu een pad voor kristallisatie van de engineered NEMO constructie in complex met kleine molecuul liganden. Om te helpen bij het ontwikkelen en optimaliseren van een nieuwe klasse van remmers.