Name: Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer een protocol voor het isoleren van microglia uit verschillende hersengebieden van een volwassen muis met FACS-sortering. Deze methode maakt diepe eencellige RNA-sequencing mogelijk voor transcriptoomanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno en Spyros Darmanis voor hun hulp bij de ontwikkeling van dit protocol. We bedanken ook de gedeelde FACS-faciliteit van Stanford, met name Meredith Weglarz en Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart van Stanford protein en Nucleic Acid Facility (PAN) voor hun geweldige ondersteuning voor het filmen. Dit werk wordt gefinancierd door de JPB Foundation en Vincent J. Coates Foundation.

Alle procedures met betrekking tot knaagdieren aan normen voldoende aan Stanford University richtlijnen, die voldoen aan nationale en staatswetten en beleid. Alle dier procedures zijn goedgekeurd door het administratief panel van Stanford University voor laboratoriumdieren verzorging.
Opmerking: Alle oplossingen en buffer composities zijn beschikbaar in de tabel van de materialen.
1. voorbereiding op de dag van de celisolatie
<ol><li>Bereid de volgende reagentia en chill ze op ijs: medium A (50 mL), magnetisch-geactiveerde celsortering (MCS) buffer (30 mL), FACS buffer (25 mL), fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 30 mL), DNase (320 μL) en RNase remmer (30 μL). Opmerking: De volumes die hier worden geleverd zijn voldoende om Microglia te isoleren van 4 hersengebieden (bijv. cortex, cerebellum, Hippocampus en striatum) van een hersen halfrond met één muis. Opschalen als er meer weefsels worden gebruikt.</li>
	<li>Plaats vier schone 2 mL Dounce homogeniseerders op ijs en voeg 2 mL medium A toe met 80 μL DNase (12.500 eenheden/mL) en 5 μL RNase-remmer in elke Dounce-homogenisator. Chill de zuigers in tubes van 15 mL.</li>
	<li>Label vier 6 cm Petri schaaltjes met hersengebieden voor weefsel inzameling en voeg 200 μL koelmedium A toe aan elk gerecht op ijs. Voeg ongeveer 5 mL medium A toe aan een 6 cm Petri schaaltje voor dissectie. Opmerking: Zorg er vóór gebruik voor dat alle reagentia steriel zijn en geschikt zijn voor RNA-toepassingen. Bank-en dissectie gereedschappen moeten schoon en besproeid zijn met RNase decontaminatieoplossing (tafel van materialen).</li>
</ol>2. hersenregio dissectie
Opmerking: Deze stap moet ~ 30 minuten duren.
<ol><li>Injecteer 400 − 500 μL ketamine/xylazine (24 mg/mL ketamine en 2,4 mg/mL xylazine) in het peritoneum van een juveniele tot volwassen podium muis (> 1 maand oud). Opmerking: Een mannelijke muis wordt hier gebruikt ter illustratie, maar beide geslachten zijn geschikt.</li>
	<li>Wacht 5 min en knijp een achterpoot om te zorgen voor een gebrek aan terugtrekking.</li>
	<li>Gebruik onmiddellijk een 26 G x 3/8 naald om transcardial perfusie uit te voeren met 20 − 30 mL ijskoude PBS totdat de buffer opraakt zonder zichtbaar bloed.</li>
	<li>Onthapitate de muis met een chirurgische schaar. Gebruik een kleine schaar om de huid open te snijden om de onder schedel bloot te leggen en snijd vervolgens door het sagittale hechtmiddel, lambdoidal hecht en coronale hecht. Gebruik de tang om beide zijden van het parietale bot en het interpariëtale bot te trekken zonder het weefsel te beschadigen en verplaats de hersenen voorzichtig in de dissectie Petri schaal met medium A.</li>
	<li>Gebruik een voorgekoeld blad om de hersenen door middel van de middenlijn in twee hemisferen te snijden. Opmerking: De vier hersengebieden die hier worden beschreven vanaf een enkele hemisfeer, leveren voldoende aantallen Microglia op voor eencellige of bulk-RNA-SEQ-toepassingen. De andere hemisfeer kan worden gebruikt voor Immunohistochemie of RNA in situ validatie.</li>
	<li>Scheid het cerebellum van de corticale LOB en de hersenstam met #55 Tang en breng het weefsel over in een collectie Petri schaaltje.</li>
	<li>Gebruik #55 tang om de hippocampus en het striatum uit de cortex zorgvuldig te ontleden en breng elk weefsel over in een collectie Petri schaaltje.</li>
</ol>3. mechanische weefsel dissociatie
Opmerking: Houd cellen en reagentia de hele tijd koel, behalve tijdens kleurings stappen. Deze stap moet ~ 30 minuten duren.
<ol><li>Hak elk hersenweefsel met een scheermesje in < 1 mm3 fijne stukjes.</li>
	<li>Gebruik 1 mL Pipet (met tips afgesneden) om weefsel stukken in de voorgekoelde Dounce homogeniseerders over te brengen, elk met 2 mL medium A met DNase en RNase remmer.</li>
	<li>Homogeniseer het weefsel door de zuiger langzaam in en uit de Dounce-homogenisator te draaien voor 6 − 10 volledige slagen, totdat er geen zichtbare brokjes aanwezig zijn. Opmerking: Douncing doodt neuronen en de meeste andere gliacellen, maar laat microglial cellen vrij intact. Zowel onvoldoende als over-douncing kan leiden tot lage opbrengst van cellen.</li>
	<li>Overdracht van gezien weefsels in 50 ml buizen door middel van 70 μm Strainers.</li>
	<li>Spoel elke Dounce homogenisator en zuiger met in totaal 6 mL koud medium A en filtreer de spoeloplossing door dezelfde zeef in de corresponderende buis.</li>
	<li>Breng de enkelvoudige cel suspensies (ongeveer 8 mL elk) over in 15 mL conische buizen en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c met rem = 5.</li>
</ol>4. myeline verwijderen
Opmerking: Deze stap moet nemen ~ 60 min.
<ol><li>Bereid 1 grote depletie kolom (LD) (voor cortex) en 3 kolommen met grote selectie (LS) (voor de andere 3 regio's) in een magnetisch scheidingsteken (tabel met materialen). Spoel elke kolom af met 3 mL MCS-buffer.</li>
	<li>Zodra centrifugeren is voltooid, Pipetteer en gooi het supernatant weg zonder de pellet te storen. Voor de weefsels van de cortex en cerebellum respendeert u cellen in 850 μL MCS-buffer met 1,8 μL RNase-remmer. Voor de weefsels van Hippocampus en striatum worden cellen in 400 μL MCS-buffer met 0,9 μL RNase-remmer hervat. Opmerking: De kolommen (LD vs. LS) en het volume dat wordt gebruikt voor resuspensie worden geoptimaliseerd op basis van de hoeveelheid myeline die aanwezig is in het weefsel. Als andere hersengebieden worden aangevallen, moeten deze voorwaarden mogelijk worden aangepast afhankelijk van de grootte van het weefsel en hoeveel myeline kan bestaan. De effectiviteit van het verwijderen van myeline kan worden geschat in stap 4,9.</li>
	<li>Voeg 100 μL myeline-verwijderings kralen toe, elk in cellen uit de cortex en de cerebellum en voeg 50 μL myeline-verwijderings kralen toe, elk in cellen van Hippocampus en striatum.</li>
	<li>Meng de cellen zachtjes met kralen en inincuberen de buisjes op ijs gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Breng het volume van de buis met corticale cellen naar 2 mL met MCS-buffer en alle andere naar 1 mL (d.w.z., voeg 1 mL voor corticale cellen toe; 500 μL voor hippocampal-en striatale cellen; u hoeft geen buffer toe te voegen aan cerebellaire-cellen).</li>
	<li>Zodra de kolommen leeg zijn van de spoel buffer, plaatst u een buis van 15 mL onder elke kolom. Laad corticale cellen (2 mL) op de LD-kolom en alle andere (1 mL elk) op de LS-kolommen. Gebruik onmiddellijk 1 mL MCS-buffer om de originele buizen te wassen en de oplossing op de corresponderende kolommen te laden.</li>
	<li>Was de LD-kolom eenmaal met 1 mL MCS-buffer en was elke LS-kolom twee keer met 1 mL MCS-buffer per wasbeurt. Doorgaan met het verzamelen van de doorstroom oplossing tijdens het wassen.</li>
	<li>Filter cellen in ronde bodem FACS buizen door middel van 35 μm zeef doppen. Opmerking: Elke buis moet verzamelen ongeveer 4 mL eencellige suspensie van myeline.</li>
	<li>Neem eventueel 10 μL celsuspensie en meng deze met 10 μL 0,4% trypeen blauwe oplossing. Onderzoek de cellen onder een 10x heldere veld microscoop om de opbrengst, overlevingskans en het niveau van de resterende myeline te schatten. Opmerking: Een succesvolle voorbereiding moet meer dan 90% levende cellen genereren (ronde in vorm en exclusief de blauwe kleurstof) met weinig tot geen myeline puin.</li>
	<li>Pellet cellen in de FACS tubes bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c, met rem = 5. Giet langzaam supernatant uit en DEP de rand van de buis op tissuepapier. Respendeer cellen in elke buis met 300 μL FACS buffer. Opmerking: Als MCS sorting de voorkeur heeft, kunnen CD11b kralen worden gebruikt om Microglia en andere myeloïde cellen te selecteren na verwijdering van myeline. Deze cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor niet op plaat gebaseerde scRNA-SEQ en in bulk RNA-SEQ. Het voorbehoud van deze alternatieve benadering is dat CD11b kralen Microglia niet scheiden van andere gerelateerde immuuncellen die ook positief zijn voor dit antigeen.</li>
</ol>5. kleuring voor het sorteren van fluorescentie-geactiveerde cellen
Opmerking: Deze stap moet nemen ~ 40 min.
<ol><li>Voeg 5 μL muis FC receptoren blok reagens (tabel van materialen) in elke buis. Inbroed voor 5 min op ijs.</li>
	<li>Voeg 1 μL CD45-PE-Cy7 en 1 μL CD11b-BV421 toe aan elke buis. Opmerking: Antilichamen met andere geconjugeerde fluoroforen mogen worden gebruikt. Antilichamen tegen TMEM119, een specifieke marker voor homeostatische Microglia9, kunnen ook worden opgenomen, maar het wordt aanbevolen om samen met CD45 en CD11b te worden gebruikt, omdat bepaalde Microglia-SUBPOPULATIES TMEM119 oppervlakte expressie kunnen verliezen.</li>
	<li>Inbroed de buisjes gedurende 10 min bij kamertemperatuur (RT) op een shaker.</li>
	<li>Voeg 2 mL FACS buffer toe om te wassen.</li>
	<li>Pellet cellen bij 4 °C, 400 x g gedurende 5 min. Giet langzaam supernatant uit en DEP de rand van de buis op tissuepapier. Respendeer cellen in elke buis met 400 μL FACS buffer met 1 μL RNase remmer en 0,5 μL propidium jodide (PI, 1:1000 verdunning).</li>
</ol>6. index FACS sorteren
Opmerking: Deze stap moet nemen ~ 1 h.
<ol><li>Volgende standaard FACS-procedure, tekenen van poorten op basis van Scatter (met uitzondering van puin), enkelvoudige cellen, levende cellen (PI-negatief), Microglia en myeloïde cellen (CD45+, CD11b+). Opmerking: Typische microgliale cellen Express CD45 op lagere niveaus in vergelijking met andere aan de rand geassocieerde macrofagen, zoals perivasculaire en Meningeale macrofagen, en daarom gating op CD45 lage CD11b+ moet voldoende zijn als de focus van het onderzoek is genexpressie profielen in deze klassieke Microglia1,2. Bepaalde subgroepen van Microglia kunnen echter een hogere CD45-expressie hebben en dit geldt met name tijdens de ontwikkeling of in ziekte omstandigheden. Om een objectieve analyse van microgliale genexpressie te garanderen, kunnen CD45 hoge en CD45 lage immunophenotypes worden geregistreerd via index sorteerinstelling en beide populaties verzameld voor sequencing en downstream analyse. Daarnaast kan TMEM119 oppervlak expressie worden gebruikt om de homeostatische microglial populatie te targeten (zie stap 5,2) en geanalyseerd samen met CD45 niveaus en de sequentiëren resultaten.</li>
	<li>Sorteer enkelvoudige Microglia (met een nozzle van 100 μm) in 96-goed polymerase kettingreactie (PCR)-platen, die elk goed 4 μL lysisbuffer bevatten (Zie het gepubliceerde protocol14 voor meer informatie). Opmerking: Het externe RNA Control Consortium (ERCC) RNA Spike-in mix (tabel met materialen) kan worden toegevoegd bij 1:2.4 x 107 in de lysisbuffer voor kwaliteitscontrole en normalisatie doeleinden2.</li>
	<li>Draai de platen kort om en spin omlaag met behulp van een bank-top centrifuge.</li>
	<li>Vries de monsters onmiddellijk op droogijs. Bewaar de platen bij-80 °C tot de bibliotheek is voorbereid. Opmerking: Als alternatief kunnen meer cellen worden verzameld in 1,5 mL tubes met RNA extractiebuffer voor bulk RNA-SEQ. Volgens de ervaring van de auteurs zijn 3.000-cellen voldoende om bibliotheken van goede kwaliteit te genereren na het gepubliceerde protocol2,14.</li>
</ol>7. voorbereiding van een bibliotheek met één cel RNA-sequencing
Opmerking: Hier wordt het gepubliceerde protocol14 gevolgd om scrna-SEQ-bibliotheken te genereren met behulp van liquid handling Robotics en enkele modificaties. In dit artikel wordt de procedure slechts kort beschreven en worden de verschillen gemarkeerd. Verwerken van 4 platen tegelijkertijd duurt ongeveer 2,5 dagen.
<ol><li>Ontdooien platen op ijs en het uitvoeren van omgekeerde transcriptie met oligo-dT30VN primer (in de lysisbuffer) om cDNA met thermische fietsers te genereren (tabel 1): 42 °c 90 min; 70 °C 5 min; 4 °C vasthouden. Dan versterken cDNA met een extra exonuclease digestie stap aan het begin (tabel 2) met behulp van de PCR Master Mix en in situ PCR (ispcr) primers (tabel van de materialen) en de volgende PCR-voorwaarde: 37 °c 30 min; 95 °C 3 min; 23 cycli van 98 °C 20 s, 67 °C 15 s, 72 °C 4 min; 72 °C 5 min.</li>
	<li>Reinig cDNA met 18 μL magnetische kralen per put (0,7:1 ratio). Inbroed de plaat gedurende 5 minuten op een magnetische standaard en was tweemaal met vers gemaakte 80% ethanol, 80 μL per put elke keer. Na het drogen van de plaat voor 15-20 min, Elueer cDNA met 20 μL elutie buffer per put. Opmerking: Voor kwaliteitscontrole gebruikt u een fragment analysator (hoge gevoeligheid volgende-generatie sequencing [NGS] fragment analyse, 1 − 6000 BP) om de grootte verdelingen en de concentraties van cDNA te controleren, en alleen verdere proces monsters met een uitstrijkje tussen 500 − 5000 BP, en hoger dan 0,05 ng/μL.</li>
	<li>Om bibliotheken te genereren, meng u 0,4 μL van elk cDNA-monster met 1,2 μL Tn5-tagmentatie reagentia uit de bibliotheek voorbereidings Kit (tabel met materialen) in een 384-put met behulp van een nanoliter-Pipetteer machine, op 55 °c 10 min. Opmerking: Hier wordt 1/12,5 van het voorgestelde reactievolume (5 μL monster en 15 μL van tagmentatie reagentia) toegevoegd om de kosten te verlagen en ondertussen de doorvoer te verhogen. Een nanoliter Pipetteer machine (tabel met materialen) wordt gebruikt voor het overbrengen van reagentia (deze en volgende stappen) van en naar 384-well Plates.</li>
	<li>Voeg 0,4 μL neutralisatie buffer toe om de tagmentatie reactie bij RT gedurende 5 minuten te stoppen.</li>
	<li>Voeg 384 indexen (tabel met materialen, 0,4 μl voorwaarts en 0,4 μl achteruit), 1,2 μL PCR-mix toe aan monsters (elk 2 μL) en versterk de bibliotheken aan de hand van de volgende voorwaarde: 72 °c 3 min; 95 °C 30 s; 10 cycli van 95 °C 10 s, 55 °C 30 s, 72 °C 1 min; 72 °C 5 min.</li>
	<li>Zwembad alle afzonderlijke bibliotheken (Neem 1 μL elk) van dezelfde 384-goed plaat samen, en gebruik magnetische kralen (tabel van materialen, 0.7:1 ratio) om de uiteindelijke gepoolde bibliotheken te zuiveren.</li>
	<li>Gebruik een fluor meter (tabel met materialen) om de concentraties en een bioanalyzer (tabel met materialen) te meten om de grootte verdelingen van gepoolde bibliotheken vóór de sequencing te onderzoeken. Target de sequentiëren diepte bij 1.000.000 onbewerkte leesbewerkingen per cel.</li>
	<li>Volg standaard bioinformatica procedures om sequentiëren te filteren en te trimmen en uitlijning2uit te voeren. Gebruik de tabel Count en metagegevens als invoer voor clustering analyse met de Seurat pakket15.</li>
</ol>

<ol><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Heterogeneity+of+Microglia+and+Brain+Myeloid+Cells+Revealed+by+Deep+Single-Cell+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing.</a> Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).</li>
<li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Unique+Microglia+Type+Associated+with+Restricting+Development+of+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Guerreiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+variants+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">TREM2 variants in Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).</li>
<li>Jonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+TREM2+associated+with+the+risk+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA+Sequencing+of+Microglia+throughout+the+Mouse+Lifespan+and+in+the+Injured+Brain+Reveals+Complex+Cell-State+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).</li>
<li>Van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li>
<li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+Technologies+and+Related+Computational+Data+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).</li>
<li>Svensson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+analysis+of+single-cell+RNA-sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments.</a> Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2018).</li>
<li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li>
<li>Collins, H. Y., Bohlen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Rodent+Microglia+to+Promote+a+Dynamic+Ramified+Morphology+in+Serum-free+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57122(2018).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
<li>Swartzlander, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+cell+type-specific+isolation+and+profiling+of+mouse+brains+in+inflammation+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109(2018).</li>
<li>Hennig, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Low-Cost+NGS+Library+Preparation+Using+a+Robust+Tn5+Purification+and+Tagmentation+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol.</a> G3. 8 (1), Bethesda. 79-89 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Microglia actief interactie met andere celtypen in het CZS, en ze zijn zeer gevoelig voor milieu stimuli. Om ontstekingsreacties en afwijkende veranderingen in hun genexpressie tijdens het isolatie proces te minimaliseren, is dit protocol gestroomlijnd vanuit een eerder gepubliceerde methode9, en het is nu geschikt om Microglia te isoleren van meerdere regio's van een enkele muis hersenhelft parallel. De weefsels en reagentia worden op koude temperatuur gehouden en experimenten worden tijdig uitge...

Microglia, dat 5% − 10% van alle neurale cellen vertegenwoordigt, zijn ingezeten macrofagen verspreid over het centrale zenuwstelsel (CNS)1. Beschermd achter de bloed-hersen barrière, typische Microglia in een gezonde volwassen hersenen bevatten vele fijne processen die snel uitbreiden en intrekken om te communiceren met neuronen en andere gliacellen in het parenchym. Microglia kan ook de amoeboïde morfologie aannemen die gepaard gaat met een verhoogde fagocytische functie tijdens specifieke ontwikkelingsstadia of bij immuunproblemen bij letsel en ziekte1,2,3,4. Recente spannende ontdekkingen hebben duidelijk aangetoond dat Microglia geenszins passieve omstanders zijn van hersenen-afgeleide of pathologische signalen, maar spelen cruciale rollen bij het beheersen van de hersenontwikkeling en homeostase, bijvoorbeeld door neuronale overleving te ondersteunen, onrijpe synapsen te snoeien, het bevorderen van oligodendrocyten Lineage cellen differentiatie evenals angiogenese1. Naarmate er meer functies van Microglia worden opgehelderd, wordt de opwinding verder gevoed door onderzoek naar menselijke genetica, waaruit bleek dat veel neurodegeneratieve ziektebestrijdings genen, zoals TREM2, overwegend of uitsluitend worden uitgedrukt door Microglia5,6,7. Gezien hun betekenis in de ontwikkeling en de plausibele rol van de ziekte, is er recentelijk een enorme inspanning geleverd naar ons begrip van microglial genregulatie en-functie in de hoop nieuwe therapeutische doelstellingen voor neurodegeneratieve ziekten van1,8te vinden.
RNA-sequencing (RNA-SEQ) maakt onbevooroordeelde karakterisatie van celtypespecifieke genexpressie mogelijk, die op zijn beurt wetenschappers begeleidt om genfuncties in dichte cellulaire netwerken7te onderzoeken. RNA-SEQ was grotendeels gedaan op bulk monsters, wat leidde tot de ontdekking van een homeostatische microglial gen Signature die hen onderscheidt van andere neurale en immune cellen9. Echter, een dergelijke aanpak kan over het hoofd zien moleculaire en functionele verschillen tussen Microglia, vooral die transitief aanwezig zijn in ontwikkeling, of geassocieerd met veroudering en ziekte. Inderdaad, single-cell RNA-SEQ (scrna-SEQ) biedt de gevoeligheid en resolutie die het veld hebben veranderd door het onthullen van eerder ondergewaardeerde heterogeniteit van Microglia in een verscheidenheid van contexten2,3,10. Bovendien, vanwege de aanwezigheid van andere soortgelijke immuuncellen op de CNS-circulatie-interface, biedt scRNA-SEQ informatie die het ontwerp van nieuwe instrumenten helpt om deze gerelateerde cellen te scheiden en functioneel te ontleden met weinig voorkennis2,11.
Een divers aanbod van scRNA-SEQ platformen zijn uitgevonden, elk geschikt voor bepaalde toepassingen12. In het algemeen zijn op droplet gebaseerde methoden, zoals 10x Genomics, hoger in doorvoer met (tientallen) duizenden cellen die in elke uitvoering worden gesequentieerd, en ze zijn minder selectief voor de invoer die gemengde celpopulaties kan bevatten die een brede categorisatie vereisen. Op plaat gebaseerde methoden bieden een hogere gevoeligheid en lees diepte13,14, meestal gericht op specifieke populaties van celsortering om subtiele verschillen of zeldzame transcripten te onthullen. Gezien het kleine percentage microglial cellen, met name die ontwikkelings-of ziektegebonden subpopulaties, is het vaak wenselijk om Microglia te isoleren van een specifieke regio van belang en diepe en volledige transcriptomische informatie te verkrijgen om hun heterogeniteit te begrijpen.
Hier geven we informatie over hoe Microglia te isoleren van verschillende muizen hersengebieden die worden ontleed van een enkele halve bol, die worden gebruikt voor eencellige (of bulk) RNA-SEQ na een semi-geautomatiseerde plaat-gebaseerde bibliotheek voorbereidingsprocedure. De andere halve bol kan vervolgens worden gebruikt voor histologische validatie. Gestroomlijnd vanaf een eerder gepubliceerde methode9, is dit isolatie protocol bedoeld om de opbrengst van kleine hoeveelheid start materialen te maximaliseren en ondertussen endogene microglial genexpressie profielen te onderhouden. We gebruiken fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om Microglia (of andere gerelateerde immuuncellen van belang) te verrijken in 96-well Plates en miniaturiseren de volumes van reagentia voor bibliotheek voorbereiding om de doorvoer te verhogen. We belichten dit gevoelige scRNA-SEQ-platform, hoewel andere op platen gebaseerde strategieën kunnen worden toegepast. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast om Microglia te isoleren van andere ontleed weefsels, zoals letsel of ziekte Foci, en de leeftijd van de muis kan variëren in bijna elke postnatale fase. Efficiënt isoleren van regionale Microglia voor onderzoeken met één cel transcriptomics zal een beter begrip van hun functies in gezondheid en ziekte vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>5 M Betaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# B0300-5VL</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R0192</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 15575020</td><td></td></tr><tr><td>10X Hanks&rsquo; Balanced Salt Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 14185-052</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td><td>Kapa Biosciences</td><td>Cat# KK2602</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap</td><td>Corning</td><td>Cat# 352235</td><td></td></tr><tr><td>AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp &ndash; 6.000 bp)</td><td>Advanced Analytical</td><td>Cat# DNF-474-1000</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A8806</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>Cat# LS002007</td><td>Working solution: 12500 units/ml</td></tr><tr><td>DTT, Molecular Grade</td><td>Promega</td><td>Cat# P1171</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA Spike-In Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2002</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2003</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2004</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Exonuclease (5 U/μl)</td><td>New England BioLabs</td><td>Cat# M0262S</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat# 553142</td><td></td></tr><tr><td>Myelin removal beads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-096-433</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)</td><td>Illumina</td><td>Cat# 20024907</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 70011044</td><td></td></tr><tr><td>PCRClean DX beads</td><td>Aline Biosciences</td><td>Cat# C-1003-50</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# P3566</td><td>Staining: 1:1000</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermal Fisher Scientific</td><td>Cat# Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 101236; RRID: AB_11203704</td><td>Staining: 1:300</td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625</td><td>Staining: 1:300</td></tr><tr><td>Recombinant RNase Inhibitor</td><td>Takara Bio</td><td>Cat# 2313B</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)</td><td>Clontech</td><td>Cat# 639538</td><td>Containing 5x First strand buffer</td></tr><tr><td>Oligonucleotiden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is voor ribobases en "+" is voor een LNA base)</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>Oplossingen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer</td><td></td><td></td><td>Recept: sterieel gefilterd 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS</td></tr><tr><td>MCS buffer</td><td></td><td></td><td>Recept: sterieel gefilterd 0,5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS</td></tr><tr><td>Medium A</td><td></td><td></td><td>Recept: 15 mM HEPES, 0,5% glucose in 1X HBSS zonder fenol rood</td></tr><tr><td>Platen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific</td><td>VWR</td><td>89005-556</td><td></td></tr><tr><td>Hard-shell 96-well PCR plates</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td>Anders</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogenisator, 2 ml</td><td>Wheaton</td><td>357422</td><td></td></tr><tr><td>Large depletion column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Large selection column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>RNAzap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Strainer (70 μm)</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Fragment Analyzer</td><td>Agilent</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito HTS nanoliter pipetting robot</td><td>TTP Labtech</td><td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank&quot

isolatie van regiospecifieke microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige rna-sequencing

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Als Resident macrofagen in het centrale zenuwstelsel, Microglia actief controle van de ontwikkeling van de hersenen en homeostase, en hun disfuncties kunnen menselijke ziekten stimuleren. Er zijn aanzienlijke vooruitgang geboekt om de moleculaire handtekeningen van homeostatische Microglia en veranderingen van hun genexpressie te onthullen in reactie op milieu stimuli. Met de opkomst en rijping van eencellige genomische methodologieën wordt steeds meer erkend dat heterogene Microglia de verschillende rollen kan onderdoen die ze spelen in verschillende ontwikkelings-en pathologische omstandigheden. Verdere dissectie van dergelijke heterogeniteit kan worden bereikt door efficiënte isolatie van Microglia uit een bepaald gebied van belang, gevolgd door een gevoelige profilering van individuele cellen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de snelle isolatie van Microglia uit verschillende hersengebieden in een enkele volwassen muis hersen hemisfeer. We laten ook zien hoe je deze gesorteerde Microglia gebruikt voor op platen gebaseerde Deep single-cell RNA-sequencing. We bespreken het aanpassingsvermogen van deze methode voor andere scenario's en bieden richtlijnen voor het verbeteren van het systeem voor grootschalige studies.

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren en sorteren van Microglia uit verschillende hersengebieden in één volwassen geperfectiongebruikt hersen halfrond, gevolgd door scRNA-SEQ. We gebruiken douncing om eencellige suspensie te creëren en ook als een eerste stap om Microglia te verrijken. Onvoldoende of over-douncing vermindert de opbrengst. Bovendien bevatten volwassen muis hersenen hoge niveaus van myeline, die ook de sorteerefficiëntie en-opbrengst kunnen verminderen als ze niet goed worden verwijderd. Da...

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Deze methode maakt onbevooroordeelde captureization van microglia genexpressie op een eencellig niveau, die kan helpen bij het verduidelijken van de moleculaire heterogeniteit van microglia in een gezonde en zieke hersenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een gedetailleerde procedure biedt voor snelle isolatie van microglia uit verschillende hersengebieden en laat zien hoe efficiënt te genereren play base de eencellige RA6 bibliotheken voor diepe sequencing. Om deze procedure te starten, bereid alle benodigde buffers en oplossingen zoals beschreven in het tekstprotocol en chill ze op ijs.Na het euthanaseren en onthoofden van de muis, gebruik kleine schaar om de huid op het hoofd open te snijden om de schedel eronder bloot te leggen. Snijd vervolgens door de sagittale hechting, lambdoïdale hechting en coronale hechting. Gebruik tangen te trekken uit beide zijden van pariëtale bot en interparietale bot zonder beschadiging van het weefsel en voorzichtig verplaatsen van de hersenen in een dissectie Petri schotel met medium A.Using een voorgekoelde mes, snijd de hersenen door de middellijn in twee hemisferen.Gebruik nummer 55 tangen om het cerebellum te scheiden van de corticale kwab en de hersenstam. Gebruik vervolgens nummer 55 tangen om de hippocampus en het striatum uit de cortex zorgvuldig te ontleden en elk weefsel over te brengen naar een apart petrischaaltje. Gebruik eerst een scheermesje om elk hersengebied in fijne stukken te hakken die minder dan een kubieke millimeter zijn.Met behulp van een een milliliter pipet met de punt afgesneden, breng de weefselstukken in voorgekoelde Dounce homogenisatoren. Homogeniseer het weefsel door de zuiger langzaam in en uit de Dounce homogenisator te draaien voor zes tot tien volle slagen totdat er geen zichtbare brokken aanwezig zijn. Breng vervolgens de gescheiden weefsels over in 50 milliliter buizen door middel van 70 micrometer strainers.Spoel elke Dounce homogenisator en zuiger met het totaal van zes milliliter koud medium A en breng de spoeling over naar een 15 milliliter buis voor centrifugatie. Centrifuge eencellige suspensie op 400 keer g en bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten met een pauze op vijf. Spoel één grote uitputtingskolom en drie grote selectiekolommen in een magnetische afscheider met drie milliliters MCS.Wanneer de centrifugatie voor de weefselmonsters is voltooid, pipet uit en gooi supernatant zonder verstoring van de pellet. De cellen opnieuw opsplitsen in de MCS-buffer die RNase-remmer bevat. Voeg 100 microliters van myeline verwijdering kralen aan elke buis met opnieuw opgehangen cellen uit de cortex en cerebellum en voeg 50 microliter van myeline verwijderen kralen aan elk van de buizen met opnieuw zwevende cellen uit de hippocampus en striatum.Broed de buizen 10 minuten op ijs. Voeg hierna MCS toe aan de buis met corticale cellen om het volume tot twee milliliter te brengen en aan de resterende buizen om elk van hun volumes tot één milliliter te brengen. Zodra de kolommen leeg zijn van spoelbuffer, laadt u twee milliliter corticale cellen op de grote uitputtingskolom en een milliliter van elkaar celopsuspensie op afzonderlijke grote selectiekolommen.Was vervolgens de grote uitputtingskolom met één milliliter MCS-buffer en was elke grote selectiekolom twee keer met behulp van één milliliter MCS-buffer voor elke wasbeurt. Filter de cellen door 35 microliter zeefdoppen in facs-buizen met ronde bodem. Centrifuge deze buizen op 400 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten om de cellen pellet.Giet vervolgens langzaam de supernatant uit en dep de rand van de buis op tissuepapier. Resuspend de cellen in elke buis met 300 microliters van FACS buffer. Voeg eerst vijf microliters van muis FC-receptoren reagens toe aan elke buis.Vijf minuten incuberen op ijs. Voeg vervolgens een microliter cd45 PE-maat zeven en één microliter CD11B BV421 toe aan elke buis. Broed de buizen op een shaker op kamertemperatuur gedurende 10 minuten.Voeg hierna twee milliliter FACS-buffer toe om te wassen. Centrifuge op 400 keer g en bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten om de cellen pellet. Resuspend de cellen in elke buis met 400 microliter facs buffer met een microliter van RNase remmer en 0,5 microliter van propidium jodide.Volgens de standaard FACS-procedure sorteer je enkele live microglia met een nozzle van 100 micrometer in PCR-platen met 96-putten die vier microliters lysebuffer in elke put bevatten. Kort vortex de platen en draai ze naar beneden met behulp van een bank top centrifuge. Bewaar de platen op min 80 graden Celsius tot de voorbereiding van de bibliotheek.Wanneer klaar om verder te gaan, ontdooien de plaat op ijs. Gebruik een thermische cycler om een eerste transcriptie uit te voeren om cDNA te genereren en de cDNA te versterken met een extra exonuclease spijsverteringsstap zoals beschreven in het tekstprotocol. Na deze, zuiveren de cDNA door het toevoegen van 18 microliter van magnetische kralen aan elke put.Broed de plaat vijf minuten op een magnetische standaard. Verwijder vervolgens de supernatant en was de monsters twee keer met vers gemaakte 80%-ethanol met behulp van 80 microliter ethanol per put voor elke wasbeurt. Om tagmentatie uit te voeren, gebruikt u een nanoliter pipettingmachine om 0,4 microliter van elk cDNA-monster gedurende 10 minuten te mengen met 1,2 microliter Tn5-tagmentatiereagentia uit de bibliotheekvoorbereidingskit in een 384-putplaat bij 55 graden Celsius.Om de tagmentatiereactie te stoppen, voegt u gedurende vijf minuten 0,4 microliter neutralisatiebuffer toe bij kamertemperatuur. Vervolgens, op 384 indexen en 1,2 microliter pcr gemengd met de monsters en versterken van de bibliotheken zoals beschreven in het tekstprotocol. Bundel alle afzonderlijke bibliotheken van dezelfde 384-put plaat samen en gebruik magnetische kralen om de uiteindelijke samengevoegde bibliotheken te zuiveren.In deze studie worden microglia geïsoleerd van de cortex, cerebellum, hippocampus en striatum van het hersenrondisfeer van een volwassen muis. De voorbereide celsuspensie wordt onderzocht onder een microscoop met behulp van trypan blauw en een hemocytometer om de opbrengst, cel levensvatbaarheid, en de werkzaamheid van myeline verwijdering te schatten voordat het uitvoeren van antilichaam vlekken. Totale cel tellingen op dit punt moet meer dan 30.000 voor de cortex en meer dan 5.000 voor de andere weefsels.Meer dan 90% van de cellen moet levensvatbaar zijn met weinig myeline puin. Een FACS machine wordt gebruikt om de microglia te sorteren, die meestal CD45 laag en CD11B positief zijn. Succesvolle isolatie moet genereren meer dan 80% microglia van alle levende eencellen, althans voor het corticale weefsel.Zodra individuele microglia worden gevangen in de lyse buffer, RNA wordt vrijgegeven en vervolgens omgekeerd getranscribeerd naar cDNA, die vervolgens wordt versterkt voor 23 cycli. Als capillaire elektroforeseplatform bieden de fragmentanalyzer en hooggevoelige NGS-fragmentkits snelle en nauwkeurige informatie over de grootteverdeling, evenals de hoeveelheid cDNA-moleculen die aanwezig zijn in elke put van een 96-putplaat. Monsters met een uitstrijkje tussen 500 en 5.000 basisparen en boven een bepaalde concentratiedrempel kunnen worden gebruikt om bibliotheken te maken.De monsters worden gesequenced tot een diepte van meer dan een miljoen ruwe leest per cel, die de detectiekracht van de eencellige RNA sequencing methodologie verzadigd. Met een mapping snelheid van ongeveer 60% over 2, 000 genen kunnen worden gedetecteerd per microgliale cel. Eerder gepubliceerde gegevens gegenereerd uit deze isolatiemethode worden gereproduceerd uit onafhankelijke experimenten, waaruit blijkt dat de gevoeligheid voor het detecteren van microglia-specifieke genen in de gesequencede populatie.Met de informatie van enkele microglia transcripties, onderzoekers kunnen ontdekken de unieke cel populaties in de context van hun belang, en verder studie van de functionele relevantie van deze nieuw geïdentificeerde populaties.

isolation-region-specific-microglia-from-one-adult-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

RNA-expressieprofilering van specifieke hersenregio's bij muizen vereist een nauwkeurige en reproduceerbare strategie voor weefselverzameling. Hier wordt een protocol beschreven dat gebruikmaakt van zowel coronale hersensecties als microdissectie met behulp van een weefselpons. De opbrengst en kwaliteit van het totale RNA dat uit de resulterende monsters is verkregen, bevestigen het nut van de beschreven methode.

Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio&#39;s voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling

The video demonstrates a technique for isolating microglia from the cortex of an adult mouse brain. First, the cortex undergoes segmentation and homogenization to remove neurons and other glial cells, preserving microglia. Following that, the cell suspension is exposed to anti-myelin magnetic microbeads and a magnetic field, effectively separating microglia and myeloid cells from myelin debris and cells containing myelin.

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

Hier presenteren we een protocol voor in vitro isolatie van meerdere gliacelpopulaties van een muis CNS. Deze methode maakt de segregatie van regionale microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten mogelijk om de fenotypen van elk in verschillende cultuursystemen te bestuderen.

Dissectie en isolatie van Murine Glia uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde, low-input monstervoorbereiding voor single-nucleus sequencing, inclusief de dissectie van muis superieure cervicale en stellate ganglia, celdissociatie, cryopreservatie, nucleus isolatie en hashtag barcoding.

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

Hier presenteren we een protocol om primaire microglia te isoleren en te zuiveren in diermodellen van demyeliniserende ziekten, met behulp van kolomvormige magnetisch geactiveerde celsortering.

Isolatie van primaire microglia van muizen door magnetisch geactiveerde celsortering in diermodellen van demyelinisatie

Tot op heden zijn protocollen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het centrale zenuwstelsel uit dezelfde muis een onvervulde vraag. Het protocol toont een procedure die toepasbaar is bij naïeve en experimentele auto-immuun encefalomyelitis-muizen om complexe cellulaire netwerken tijdens neuro-inflammatie te onderzoeken en tegelijkertijd het vereiste aantal muizen te verminderen.

Gelijktijdige isolatie van de belangrijkste celtypen van het centrale zenuwstelsel van volwassen auto-immuun encefalomyelitis-muizen

Dit protocol schetst de isolatie van gezuiverde astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor latere toepassingen zoals RNA-analyse en celkweek worden vergemakkelijkt. Het bevat gedetailleerde methoden en procedures voor celdissociatie die zijn ontworpen om zowel de kwaliteit als de opbrengst van geïsoleerde cellen te verbeteren.

Isolatie van pure astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomische onderzoeken

We beschrijven een protocol voor het isoleren van microgliacellen uit de hypothalamus van de muis (of gelijkwaardige kleine hersenstructuren) met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS), in een relatief korte tijd. De MACS-gesorteerde hypothalamische microglia kunnen worden gebruikt voor ex vivo-analyse en kunnen worden geplateerd om in vitro-assays uit te voeren.

Isolatie van hypothalamische microglia uit vers doorbloede volwassen muizenhersenen door magnetisch geactiveerde celsortering  

Het huidige protocol beschrijft hoe primaire hippocampale microglia van volwassen muizen kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd, gevolgd door instructies voor het uitvoeren van patch-clamp-opnames van hele cellen op deze acuut geïsoleerde cellen.

Isolatie en opname van patch-clamp met hele cellen van hippocampale microglia van volwassen muizen

Dit protocol combineert flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing om microgliale celtoestanden in het cerebellum van vroege postnatale muizenhersenen te isoleren en te karakteriseren. Het maakt gebruik van enzymatische dissociatie, Percoll-centrifugatie en immunokleuring om de heterogeniteit van microglia's te onthullen en het begrip van hun rol in de ontwikkeling en ziekte van cerebellaire patiënten te verbeteren.

Flowcytometrie en eencellige analyse voor het karakteriseren van microglia-activering bij vroege postnatale hersenontwikkeling bij muizen

Leer een protocol voor het isoleren van microglia uit verschillende hersengebieden van een volwassen muis met FACS-sortering. Deze methode maakt diepe eencellige RNA-sequencing mogelijk voor transcriptoomanalyse.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

Meer video's verkennen