Tissue-Engineered Graft voor circumferential slokdarmreconstructie bij ratten

Circumferential slokdarm reparatie is technisch uitdagend in een rat model, noodzakelijk de ontwikkeling van weefsel-engineered slokdarm die de regeneratie van slokdarmslijmvlies en spier zonder slokdarm anastomose lekkage mogelijk maakt. We hebben een tweelaags buisbiediger geïmplementeerd als proefmodel, bestaande uit binnennanofiber en een buitenste 3D-printen streng in combinatie met een microvasculaire anastomose om speeksellekkage na transplantatie te minimaliseren. Conventionele standaard slokdarmreconstructie wordt geassocieerd met een breed scala aan complicaties en morbiditeit.

Daarom kan slokdarmweefsel engineering een veelbelovende alternatieve strategieën voor het ontwikkelen van een inheemse patiënt slokdarm modellen. De combinatie van hybride steiger, bioreactor teelt, en een orale voeding systeem kan worden toegepast op elk systeem dat een soortgelijke verontreinigde omgeving met zijn continue mechanische druk heeft. Begin met het steriliseren van een 3D-geprinte slokdarmsteiger met een blootstelling van een uur aan ultraviolet licht, een 10-minuten weken in ethanol, en drie wasbeurten met PBS.

Na de laatste wasbeurt, plaats de twee-gelaagde buisvormige steiger in een niet-adherent 24-well weefsel cultuurplaat, en voorzichtig maar gelijkmatig een keer 10 toe te voegen aan de zes vet-afgeleide menselijke mesenchymale stamcellen per milliliter van kelder membraan matrix aangevuld met groeimedium aan het binnenoppervlak van het steiger. Gebruik een pulsatiele stroom bioreactor systeem om stevig vast te stellen de cel-gezaaide buisvormige steiger aan de acrylhouder in de kweekkamer van de bioreactor, en voeg 500 milliliter groeimedium aan de kamer. Breng vervolgens 1 dyne per centimeter in het kwadraat van flow-geïnduceerde schuifspanning aan onder een vochtige atmosfeer met 5% kooldioxide.

Na vijf dagen, gebruik maken van een LIVE / DEAD Viability Assay Kit om de celreacties op het binnenoppervlak van het steiger te bepalen volgens de standaard protocollen, en beeld van de cellen door confocale microscopie. Voordat u met de chirurgische ingreep begint, bevestigt u een gebrek aan reactie op pedaalreflex bij de verdoofde rat en plaatst u het dier in de supinepositie op een steriel laken. Gebruik tondeuses om het haar van de chirurgische plaats te verwijderen en de blootgestelde huid te desinfecteren met sequentiële BETADINE en 70% ethanolscrubs.

Voor T-tube plaatsing, maak een middellijn huid en spier incisie in de buik van de rat, en gebruik een scalpel mes om een drie-millimeter opening in de voorste maagwand te creëren. Steek de punt van een siliconen T-buis in de defect site om het te repareren aan de maagwand, en zorgvuldig hecht de buis aan de maagspierweefsel. Hecht de buikwand met 4-0 VICRYL hechting.

Steek het distale uiteinde van de geïmplanteerde T-buis voorzichtig door de onderhuidse tunnel in de achterkant van de nek en gebruik een angiocatheter om een heparinedop aan te sluiten op het einde van de T-buis om te voorkomen dat de maaginhoud naar achteren stroomt. Wanneer de dop op zijn plaats is, gebruik 4-0 polyglactine hechtingen om alle lagen van de buikhuid te sluiten, en plaats de rat in een metabole kooi met controle tot volledige recumbency. Een week na de T-buis plaatsing, bereid de rat voor chirurgie zoals aangetoond.

Plaats de rat onder de microscoop en maak een voorste mediane nekincisie in de blootgestelde gedesinfecteerde huid. Scheid de bandspieren om de tracheoesophageal structuur bloot te leggen. Isoleer de linkerkant van de slokdarm van de luchtpijp.

Scheid zorgvuldig het bovenste deel van de slokdarm van de schildklier en gebruik een chirurgische schaar om een vijf millimeter lang volledig omtrek te creëren dat alle lagen van de slokdarm bevat. Steek vervolgens een 9-0 hechting tussen de rechter inferoposterior marge van de bovenste slokdarm rest en steiger, en blijven hechten van rechts naar links tussen de bovenste slokdarm overblijfsel en het steiger om een microanastomose te creëren aan de bovenkant van de distale slokdarm defect. Dan, anastomose het schavot op dezelfde manier als de bovenste marge van de onderste slokdarm overblijfsel.

Wanneer de anastomoses zijn voltooid, leg de omliggende schildklier flap over de getransplanteerde site om een vasculaire levering aan en stabiel onderhoud van de graft te garanderen. Steek vervolgens de onderhuidse spier en het huidweefsel met een 4-0 VICRYL-hechting en plaats de rat in een metabole kooi op een infraroodopwarmingsapparaat met monitoring tot volledige recumbency. Na een gelijkmatige toepassing op de binnenwand van het schavot via injectie, de menselijke mesenchymale stamcel ingebed kelder membraan matrix toont de verwachte mesenchymale stamcel morfologie zoals beoordeeld door het scannen van elektronenmicroscopie.

Na slokdarmtransplantatie bij ratten met volledige circumferential slokdarmdefecten zoals aangetoond, is het transplantaat bedekt met een schildklierflap voor stabiele fixatie en vasculaire toevoer naar de geïmplanteerde locatie. De slokdarm getransplanteerde ratten blijven op 340 gram tot ongeveer negen dagen na de procedure, waarna de dieren snel in gewicht afnemen als gevolg van verschillende oorzaken, wat resulteert in de dood op dag 15. Hoewel de meeste ratten niet-slokdarmobstructie ontwikkelen veroorzaakt door haarballen, is er over het algemeen geen grof bewijs van perforatie, anastomoselekkage met fistel, seromaaccumulatie, abccesvorming of omliggende wekedelennecrose bij een experimenteel dier.

Re-epithelialisatie van de transplantatie site kan worden bevestigd door immunofluorescentie vlekken voor keratine, en de geregenereerde collageen laag en de elastine vezels kunnen duidelijk worden waargenomen door timchrome masson vlekken. Regeneratie van de slokdarmspierlaag blijkt ook uit een overvloedige neovascularisatie zoals beoordeeld door desmin immunohistochemische analyse. Het succes van deze procedure is afhankelijk van het stabiele onderhoud van de T-buis via fixatie achter de nek om voeding te leveren tijdens de slokdarmreconstructie.

Om de vroege mortaliteit te overwinnen die kenmerkend is voor deze procedure, kan organoïde of vroege vascularisatietechnologie na de slokdarmimplantatie worden toegepast om te helpen bij de functionele slokdarmreconstructie.