Driedimensionale beeldvorming van bacteriële cellen voor nauwkeurige cellulaire representaties en precieze eiwit lokalisatie

Omdat bacteriën zo klein zijn, vergeten mensen vaak dat het driedimensionale objecten zijn. Ons protocol maakt de nauwkeurige reconstructie van de vormen van zowel platte als gebogen cellen mogelijk. Dit protocol vereist slechts kleine wijzigingen aan een standaardmicroscoop en ze zijn direct beschikbaar in MATLAB-scripts.

Voordat het experiment te beginnen plaats twee stapels van elk van de drie 20 bij 20 millimeter deksel glijders op de tegenovergestelde uiteinden van een enkele glazen microscoop dia. Pipette 200 microliters van agarose pad oplossing op de glijbaan en onmiddellijk en stevig plaats een tweede dia op de stapel van dek slips om de agarose plat. Na het toestaan van de agarose te stollen voor ongeveer een minuut bij kamertemperatuur voorzichtig glijden van de bovenste glijbaan en gebruik een groot uiteinde van een 200 microliter pipet tip uit te snijden individuele vijf millimeter diameter pads uit de gel.

Wanneer alle pads zijn verkregen pipet de E.coli cel cultuur meerdere malen om eventuele celklonen verstoren en om ervoor te zorgen dat de cellen homogeen worden verdeeld alvorens een microliter van subcultuur toe te voegen aan elk pad. Na het laten van de monsters lucht drogen voor vijf tot 10 minuten bevestigen dat de druppels volledig zijn geabsorbeerd in de pads voor het plaatsen van een deksel slip op de pads. Gebruik vervolgens een wattenstaafje om voorzichtig borstel een geschikte kit rond de rand van de cover slip, zorg ervoor dat de kit uit de buurt van de bovenkant van de cover slip te houden.

Onmiddellijk na het afdichten van de cover slip plaats de dia op een microscoop stadium en na vijf minuten van thermische evenwicht gebruik maken van de microscoop focus wielen om het midden van een cel in beeld te brengen. Schakel in de bijbehorende microscoopsoftware onder ND Acquisition het vakje Z in om een Z-stack te verwerven en klik op de startknop om het midden van de cel als uitgangspunt te stellen. Stel de stapgrootte in op 0,1 micrometer en het bereik op vier micrometer en zorg ervoor dat het Z-apparaat is ingesteld op het Piëzo-stadium.

Het is van cruciaal belang dat er voldoende vervaging is op zowel de boven- als onderkant van de cel, zodat de cel bijna niet van de achtergrond te onderscheiden is. Stel de fluorescerende kanalen onder het lambdavenster in op de instellingen voor de fluorescerende moleculen die in beeld worden gebracht en bevestig dat de volgorde van het experiment is ingesteld op lambda, zodat een complete Z-stack in elk kleurkanaal wordt verkregen voordat u overstapt. Klik vervolgens op Nu uitvoeren om de afbeeldingsverwerving te starten.

Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen open de bestanden in een geschikte beeldanalyse software programma. Teken een vakje rond een afzonderlijke cel en dupliceer die cel twee keer, één keer voor elk kanaal, om ervoor te zorgen dat het vak Hyperstack dupliceren is ingeschakeld en wijzig het kanaal in één of twee. Zodra beide stapels beschikbaar zijn, selecteert u Afbeeldingen, Stapels, Gereedschappen en Concatenate om de afbeeldingen te combineren.

Met het eiwitkanaal eerst en het vormkanaal tweede. Na het opslaan van de nieuwe afbeelding als een TIFF-bestand maak een map in een map op het bureaublad die de bijgesneden afbeeldingen en de cell_shape_settings_tri bevat. txt-bestand van shae-cellshape-public exampleData_tri.

Bewerk de cell_shape_settings_tri. txt-bestand om de juiste instellingen voor het experiment van belang te hebben. En voer de Cell_shape_detector3dConvTriFolder functie uit met de tekenreeks naar de maplocatie, gevolgd door het aantal van de cel waarop u moet beginnen en het aantal cellen dat moet worden uitgevoerd.

Als u wilt bevestigen dat de cellen correct zijn gereconstrueerd, voert u ScreenFits uit. Wanneer de grafische gebruikersinterface wordt geopend, klikt u op de knop Map selecteren en selecteert u de map met de reconstructiegegevensbestanden om de afzonderlijke celreconstructies visueel te screenen. Voor elke cel die misvormd lijkt of die geen volledige dekking heeft, selecteert u het vak naast de reconstructie om VLAG aan te sluiten op de naam, zodat deze kan worden uitgesloten van een downstream-analyse.

Voer verrijkingsmothingSpline uit om een verrijkingsprofiel te creëren van de relatieve concentratie van het eiwit van belang als functie van de Gaussische kromming aan het oppervlak. Selecteer vervolgens elke map met de zojuist gemaakte TRI. matbestanden en selecteer het nieuw gemaakte curvematbestand.

Deze methode is vooral handig bij het behandelen van gebogen of abnormaal gevormde cellen als een 2D-representatie kan de kromming van de cellen niet nauwkeurig weergeven. In dit experiment werd een groen fluorescerend fusie-eiwit naar het bacteriële actine-eiwit MreB gegenereerd om de precieze lokalisatie van het actine-eiwit in zowel wilde type als gemuteerde E.coli-cellen te bestuderen. Door deze metingen in 3D vastgelegde beelden konden de vormen van zowel het wilde type als de gemuteerde cellen van RodZ gereconstrueerd worden.

De lokalisatie van MreB werd toen bepaald om bij kleine Gaussische krommingen worden verrijkt, een geometrisch kenmerk dat slechts in 3D in een rodZ afhankelijke manier kan worden gemeten. Vergeet niet om ervoor te zorgen dat de Z-stack groot genoeg is dat de cellen wazig zijn aan de boven- en onderkant en dat de cellen goed van elkaar zijn verdeeld. We laten zien hoe we de geometrische lokalisatie van eiwitten in 3D kunnen meten, maar andere informatie kan worden berekend op basis van deze gegevens, zoals de grootte van tag eiwitassemblages.