Isolatie en karakterisering van extracellulaire vesicles geproduceerd door ijzer-beperkte mycobacteriën

Deze methode maakt het mogelijk mycobacterium tuberculosis te kweken onder strikte lage ijzeren omstandigheden en het zuiveren van membraanveikjes uit de lage ijzercultuur filtraat. Omdat ijzerbeperking bekend is om de productie van membraan vesicle te stimuleren, levert dit protocol een hoge overvloed aan zuivere membraanveikels op die kunnen worden gebruikt voor verdere biochemische of functionele tests. Wanneer we het protocol demonstreren met behulp van de Mycobacterium smegmatis, de niet-beschermde stam, kan dit protocol worden gevolgd in BSL-2-faciliteiten met Mycobacterium tuberculosis, de virulente stam.

Om te beginnen, bereid een liter minimaal medium door het oplossen van vijf gram monopotassium fosfaat, vijf gram L-asperine, 20 milliliter glycerol, en twee gram dextrose in 900 milliliter gedeïmiseerd water in een plastic container. Pas de pH aan op 6,8 met vijf normale natriumhydroxide en pas het volume aan op één liter met gedeïsized water. Voeg vervolgens 50 gram metalen chelaatlende hars toe en roer zachtjes met behulp van een magnetische roerbalk gedurende 24 uur bij vier graden Celsius.

De volgende dag, stop het roeren en laat de hars sediment voor ongeveer 30 minuten. Steriliseren en verwijderen van de resterende hars uit de oplossing door filtratie door middel van een 22 micron filter unit met een plastic ontvanger. Nu, vul minimaal medium met 0,5 milligram per liter zinkchloride, 40 milligram per liter magnesiumsulfaat, en 0,1 milligram per liter mangaansulfaat.

Inenting een enkele kolonie MTB in twee milliliter mycobacteriële bouillon medium aangevuld met ADN verrijking. Incubeer met agitatie bij 37 graden Celsius. Wanneer er zichtbare groei is, extract twee milliliter van de cultuur en meet de OD 540 op een spectrofotometer.

Stop de incubatie wanneer de OD 540 0,8 bereikt, wat de late logaritmische fase aangeeft. Verspreid 200 microliters van de late logaritmische cultuur op de mycobacteriële agar platen aangevuld met 0,2 glycerol, 0,5%Tween 80, en ADN. Inenting ten minste vijf platen.

Broed de platen uit op 37 graden Celsius. En na een week is de bacteriële groei zichtbaar als een samenvloeiende laag. Dan nat een steriele wattenstaafje in een laag ijzer minimaal medium.

Gebruik dit uitstrijkje om bacteriën te verzamelen uit de agar platen. Inenting van de bacteriën in 100 milliliter van laag ijzer minimale media in een buis. Verzamel voldoende bacteriën om een suspensie voor te bereiden met een OD 540 van een.

Verdun de suspensie 10 keer tot een liter met laag ijzeren minimaal medium en verdeel het in twee steriele plastic flessen. Breng vervolgens twee milliliter van de cultuur over naar een kweekbuis van vijf milliliter. Voeg 10 microliter van 10% volume volume tyloxapol toe.

Broed de culturen op 37 graden Celsius voor 14 dagen. Breng de cultuur over op vijf 225 milliliter conische centrifugebuizen en centrifuge op 2, 850 keer g gedurende zeven minuten bij 20 graden Celsius. Verzamel de cultuur supernatant met een 50 milliliter pipet en filter steriliseren door middel van een 0,22 micron filter.

Om MEV's te isoleren, breng je de kweekfiltraat over in een geroerd cel ultrafiltratiesysteem geplaatst op vier graden Celsius en filter het concentraat onder een druk van minder dan 50 PSI door een 100 kilodalton cutoff membraan. Centrifugeer vervolgens de geconcentreerde cultuur van 15.000 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant in polycarbonaat ultracentrifugatiebuizen. Centrifuge de supernatant op 100.000 keer g gedurende twee uur bij vier graden Celsius.

Verwijder daarna de supernatant en zet de membranous pellets opnieuw op in een totaal van één milliliter steriele PBS door zachte pipetting. Meng 0,5 milliliter van de pelletsuspensie met 1,5 milliliter 60%iodixanol-oplossing aan de onderkant van een polypropyleen dunne ommuurde ultracentrifugebuis. Overlay deze MVE iodixanol 45%suspensie met een milliliter van 40%35%30%25% en 20%iodixanol oplossingen en een milliliter PBS aan de bovenkant.

Centrifuge op 100.000 keer g gedurende 18 uur bij vier graden Celsius. Gebruik vervolgens een een milliliter Hamilton spuit om de een milliliter dichtheid gradiënt breuken vanaf de top te verzamelen. Verdun elke verzamelde fractie tot 20 milliliter met PBS en centrifuge op 100.000 keer g gedurende twee uur bij vier graden Celsius.

Verwijder de supernatant en resuspend in 0,5 milliliter PBS. Bewaar de buizen op vier graden Celsius. Voor het uitvoeren van membraan lipide analyse, combineren 10 microliter van elke gradiënt fractie met de fluorescerende membraan sonde TMA-DPH bij een uiteindelijke concentratie van een microgram per milliliter in 50 microliter PBS in elke put van een 96-goed zwarte plaat.

Broed de platen 20 minuten lang in op 33 graden Celsius. Meet de fluorescentie op 360 nanometer voor excitatie en 430 nanometer voor emissie. In dit protocol werden MEV's gezuiverd door differentiële sedimentatie in een dichtheidsgradiënt.

Onder de beschreven voorwaarden werden MEV's meestal gescheiden in gradiëntfractie drie, wat overeenkomt met 25%iodixanol. Vesicle-geassocieerde eiwitten werden geconcentreerd in fractie drie getoond door dot vlek analyse. Negatieve kleuring bevestigde ook de aanwezigheid van MEV's in fractie drie en nanodeeltjes analyse toonde de grootte van MEV was ongeveer 100 nanometer.

Eiwit- en lipideconcentratie genormaliseerd naar kolonievormende eenheden vertoonden een ongeveer achtvoudige toename van de MEV-opbrengst in laag ijzer ten opzichte van hoge ijzeromstandigheden. Dot blot analyse toonde een intenser signaal van MEV-geassocieerde markers in dichtheid gradiënt fracties van ijzer beperkte MTB cultuur dan van ijzer voldoende MTB culturen. Volg de instructies voor de bereiding van het minimale medium om ijzer beperkte omstandigheden te verzekeren en besmetting van de membraan vesikels met lipoprotein aggregaten te voorkomen.

De mycobacteriële membraanveikels die op deze manier gezuiverd worden, kunnen worden gebruikt voor biochemische karakterisering en functionele analyse.