Isolatie en karakterisering van patiënt-afgeleide pancreatic Ductal adenocarcinoom Organoid modellen

Deze methode is belangrijk omdat door de patiënt afgeleide organoïde modellen een krachtig en snel hulpmiddel zijn om alvleesklierkanker te bestuderen omdat ze de genetische en fenotypische heterogeniteit van deze ziekte weerspiegelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat organoïden kunnen worden geïsoleerd met een hoog slagingspercentage van een beperkte hoeveelheid kanker en ze kunnen snel worden uitgebreid in vitro voor downstream-analyse. Het bestuderen van organoïden's reactie op cytotoxische geneesmiddelen kan ons helpen begrijpen waarom tumoren resistent worden tegen therapie en om effectievere behandelingsstrategieën te definiëren.

Haal om deze procedure te starten de voorbereide 12-putplaat uit de couveuse. Met een steriele cel lifter, voorzichtig til de kelder membraan extract koepel zodanig dat het zweeft in de volledige media, terwijl ervoor te voorkomen dat schrapen de bodem van de put. Breng met behulp van een P1000 pipet de BME-koepel en de media voorzichtig over op een conische buis van 15 milliliter.

Herhaal deze stap voor elke organoïde-bevattende goed. Was voorzichtig elke put die werd geoogst met een milliliter koude basale media en breng deze was naar de buis met de organoïden. Meng de oplossing en organoïden grondig met een P1000 pipet en draai vijf minuten naar beneden op 200 keer g.

Aan de onderkant van de buis verschijnt een laag BME met organoïden in suspensie en een organoïde pellet. Verwijder voorzichtig de supernatant om te voorkomen dat de BME- en organoïde laag verloren gaat. Zet de buis op ijs.

Voeg 10 milliliter ijskoude celterugwinningsoplossing toe aan de buis en meng grondig door inversie. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten tijdens het mengen om de drie minuten door inversie. Daarna, centrifugeren op 200 keer g gedurende vijf minuten.

De organoïde pellet moet duidelijk zijn, terwijl de BME laag moet worden gegaan. Als de BME-laag kleiner is, maar nog zichtbaar is, moet u nog eens 30 minuten bij vier graden Celsius uitbroeden en de centrifugatie herhalen. Zodra de BME is gedepolymeriseerd, verwijder de cel herstel oplossing terwijl het achterlaten van de organoïde pellet.

Was de organoïden met 10 milliliter basale media door te mengen met inversie. Centrifuge op 200 keer g gedurende vijf minuten, verwijder de supernatant, en plaats de buis met de organoïde pellet op ijs gedurende ten minste vijf minuten. Optioneel, als een eencellige voorbereiding gewenst is, voeg drie milliliter trypsine aangevuld met 30 microliter DNAse I oplossing voor de organoïden.

Broed deze enzymatische reactie bij 37 graden Celsius met zachte inversie mengen om de twee minuten gedurende maximaal 10 minuten. Gebruik een Brightfield microscoop om te controleren en te bevestigen dat de eencellige dissociatie succesvol is. Om de enzymatische reactie te stoppen, voeg 10 milliliter ijskoude basale media toe en spin naar beneden op 200 keer g gedurende vijf minuten.

Verwijder vervolgens de supernatant. Was de cellen met 10 milliliter basale media door te mengen met zachte inversie. Centrifuge opnieuw op 200 keer g gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant en herhaal dit was- en centrifugingproces nog eens. Plaats de buis met de cel pellet op ijs voor ten minste vijf minuten. Voeg hierna ijskoude BME toe aan de celpellet en gebruik een P200 pipet om de oplossing voorzichtig te mengen totdat deze homogeen is.

Plaats vervolgens de punt van de pipet dicht bij de bodem van de buis en pipet op en neer ten minste vijf tot 10 keer om mechanisch breken van de organoïden. Gebruik een P200 pipet om een 100 microliter koepel te spotten in het midden van een put van een voorverwarmde 12-well plaat. Herhaal dit totdat alle BME-oplossing is afgegeven.

Breng de plaat vervolgens voorzichtig over naar een couveuse bij 37 graden Celsius om de BME-gel te laten stollen. Na 10 minuten, haal de plaat en voeg een milliliter van voorverwarmde organoïde complete media aan elke put. Organoïde culturen worden meestal doorgang over zeven tot 10 dagen, afhankelijk van de cultuurdichtheid en proliferatie.

Indien nodig, top-up van de culturen met 200 microliters van voorverwarmde organoïde complete media om de vijf dagen te compenseren voor groeifactor uitputting en verdamping. Na het isoleren van enkele cellen van organoïden, resuspend de enkele cellen in een milliliter van menselijke organoïde complete media. Gebruik vervolgens een geautomatiseerde celteller om de cellen te tellen om ervoor te zorgen dat de levensvatbaarheid van de cel wordt opgenomen.

Bereken het totale aantal cellen en levensvatbare cellen in de suspensie van één milliliter. Verwijder vervolgens het volume gelijk aan 400.000 cellen en breng het over naar een nieuwe buis. Voeg organoïde complete media toe aan deze buis om het volume op 7,2 milliliter te brengen.

Voor therapeutische testen, bereid cellen voor beplating door het mengen van 800 microliter BME met 7,2 milliliter organoïde complete media met de cellen op ijs. Breng het mengsel naar een reservoir gehouden op ijs en gebruik een 12-kanaals pipet om 20 microliter van dit mengsel plaat in elke put van een 384-goed plaat wat resulteert in ongeveer 1,000 cellen worden verguld per goed. Draai vervolgens een minuutlang op 100 keer g in een schommelemmer naar beneden en plaats de plaat in een weefselkweek incubator op 37 graden Celsius.

Gebruik na 24 uur een Brightfield microscoop om te controleren op de aanwezigheid van organoïden. In deze studie worden patiënt-afgeleide PDAC organoïde geïsoleerd, uitgebreid en gekenmerkt. Om de uitdagingen in verband met het isoleren van organoïden van PDAC te illustreren, wordt een representatieve organoïde cultuur van patiënt afgeleid vastgesteld uit een klein hypocellulair tumormonster.

Organoïden mogen gedurende twee weken groter worden en worden volgens het protocol doorgang gegeven om een robuustere cultuur tot stand te brengen. Enkele cellen van een gevestigde en snelgroeiende representatieve PDAC-organoïde zijn dan bereid om de uitkomst van het farmacotyping protocol aan te tonen. 1. ,,000 levensvatbare cellen zijn verguld in elke put en mogen herstellen over een periode van 24 uur voordat de cytotoxische chemotherapeutische middelen worden gesedreerd.

Een 9.0 dosistest wordt uitgevoerd in drievoud te beginnen met een lage dosis van 100 picomolar en eindigend met een hoge dosis van twee micromolar. Na een vijfdaagse behandeling worden representatieve foto's gemaakt voor putten die met het voertuig en met de hoge dosis van elk chemotherapeutisch middel worden behandeld. Onmiddellijk na het nemen van de foto's, cel levensvatbaarheid wordt beoordeeld met behulp van luminescente cel levensvatbaarheid reagens en uitgezet met behulp van grafische software.

Patiënt-afgeleide organoïden kunnen heterogene morfologieën hebben. Daarom is het belangrijk om de enzymatische dissociaties voor elke cultuur te optimaliseren. Downstream-analyse van patiënt-afgeleide modellen omvat meestal de volgende generatie sequencing van het DNA en RNA.

Indien mogelijk, valideren van de moleculaire kenmerken van de modellen met behulp van primaire weefselmonsters. Geïndividualiseerde organoïde culturen openen de mogelijkheid voor gepersonaliseerde geneeskunde benaderingen voor alvleesklierkanker patiënten. Houd er rekening mee dat gevaarlijke chemische stoffen zoals fenol-chloroform en chemotherapeutische agentia moeten worden behandeld met geschikte beschermingsmiddelen en veiligheidsuitrusting.