Oprichting en analyse van driedimensionale (3D) organoïden afgeleid van patiënt prostaatkanker Bot metastase Specimens en hun Xenografts

We beschrijven strategieën en stapsgewijze protocollen om serieel 3D-patiënt-afgeleide organoïden van botuitzaaiende prostaatkanker vast te stellen. Onze geoptimaliseerde protocollen zijn praktisch om 3D-culturen op te zetten voor experimenten met beperkt uitgangsmateriaal rechtstreeks van patiënten of door patiënten afgeleide xenografttumorweefsels. De 3D-organoïden uit dit protocol kunnen worden gebruikt als ex vivo-modellen om basismechanismen van botuitzaaiingen van prostaatkanker te begrijpen en de behandeling te testen.

De 3D organoïde cultuurmedia in dit protocol zijn specifiek voor prostaatcellen. Andere delen van onze protocollen zijn van toepassing op verschillende soorten tumorweefsels en gemetastaseerte. De doming techniek kan blijken te zijn het moeilijkste deel van dit proces.

Het beoefenen van de doming techniek zal zorgen voor een consistente grootte van de koepelvormige mengsel van organoïden, media, en Matrigel, en minimaliseren bubble vorming tijdens de steekproef schorsing. Visueel aantonen van deze methode biedt een beter begrip van hoe om te gaan met de viskeuze Matrigel voor het succesvol kweken van lagere dichtheid organoïden uit een laag aantal cellen. Begin met het opnieuw inrichten van de celpellet in het juiste volume van het keldermembraan voor een 24-put plaat setup.

Pipet op en neer voorzichtig om ervoor te zorgen dat de cellen opnieuw worden opgetrokken, dan pipette het juiste volume van de cel suspensie in het midden van een voorverwarmde weefsel cultuurplaat. Omkeren van de plaat en onmiddellijk ondersteboven in de cel cultuur incubator ingesteld op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 15 minuten. Pipette het juiste volume van voorverwarmd medium met 10 micromolar Y-27632 dihydrochloride in elke put.

Als u een drijvende koepel wilt vormen van de bijgevoegde ronde koepel, maakt u de koepel los van de plaat met behulp van een celschraper. Snijd een twee bij vier centimeter stuk paraffine film en plaats het op de top van de divots van een lege tip holding rek van een een milliliter plastic pipette tip box. Gebruik een gehandschoende wijsvinger om zachtjes op de paraffinefilm te drukken om de divots te traceren die ervoor zorgen dat ze niet door de film breken.

Spuit de paraffinefilm met 70% ethanol en zet de UV-lamp in de celkweekkap aan om de voorbereide film minstens 30 minuten te steriliseren. Ondertussen, resuspend de voorbewerkte cellen in 20 microliter van kelder membraan. Dan pipette de suspensie in de divots gevormd in de paraffine film.

Plaats de gestolde kralen en paraffine film in een zes-put plaat en pipet drie tot vijf milliliter van voorverwarmd medium met 10 micromolar Y-27632 dihydrochloride in elke put, terwijl zachtjes borstelen kralen uit van de paraffine film. Om de organoïden voor histologie te verwerken, verwijder bestaande media uit de put die ervoor zorgen dat de koepels van het keldermembraan niet worden aangezogen. Voeg een gelijk volume van de cel herstel oplossing en incubeer de plaat gedurende 60 minuten op vier graden Celsius.

Na de incubatie verjagen, verjagen de kelder membraan koepel met behulp van een pipet en plet het met een pipet tip. Verzamel de gescheiden koepel en de celterugwinningsoplossing in een buis van 1,5 milliliter. Centrifugeren de buis op 300 keer g in vier graden Celsius gedurende vijf minuten, verwijder dan de supernatant en zet het opzij.

Bewaar alle supernatants tot de laatste stap wanneer de aanwezigheid van organoïden wordt bevestigd op het gewenste volume van koude PBS en zachtjes pipette op en neer om de pellet mechanisch los te maken zonder de organoïden te verstoren. Herhaal de centrifugatie en verwijder de supernatant. Bevestig de pellet in een afgestemd volume van 4%PFA gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.

Herhaal na fixatie de centrifugatiestap en PBS-was. Voeg dan langzaam 200 microliters van warme 2%agarose toe en onmiddellijk maar onmiddellijk de celkorrel van de buismuur los zonder het te verstoren gebruikend een 25 maatnaald die aan een één milliliter spuit wordt vastgemaakt. Voor de agarose spin down methode, is het van cruciaal belang om de cel pellet los te maken van de wand van de buis direct na het toevoegen van agarose met behulp van een 25 meter naald.

Zodra de agarose volledig is gestold, los deze los van de buis met een 25-meter naald bevestigd aan een een milliliter spuit en breng het naar een nieuwe 1,5 milliliter buis. Vul de buis met 70% ethanol en ga verder met het conventionele protocol voor weefseluitdroging en paraffine inbedding. Dit protocol werd met succes gebruikt om 3D-organoïden vast te stellen van door de patiënt afgeleide xenograftmodellen van botuitzaaiende prostaatkanker en rechtstreeks uit het kankerweefsel.

De organoïden vertoonden verschillende fenotypes die zich manifesteerden als cysten, sferoïden en hogere complexiteitsorganoïden. Een hele koepel van keldermembraan en organoïden is te zien in een gestikt beeld van 25 hoge resolutie, 10X vergrotingsbeelden. Om het tumorweefsel verder te onderzoeken, werd immunofluorescente cytochemie uitgevoerd op een vijf micrometer dikke paraffinesectie van organoïden gericht op de basale epitheelcelmarkering cytokeratine-5, luminale epitheliale celmarker cytokeratine-8 en DAPI.

Dit protocol kan worden geoptimaliseerd voor andere toepassingen zoals westerse blotting, co-cultuur en flow cytometrie om kenmerken van 3D-organoïden en de effecten van medicamenteuze behandelingen te verkennen. Deze experimenten kunnen mechanismen van resistentie tegen geneesmiddelen en de werkzaamheid van nieuwe therapieën alleen of in combinatie met de huidige therapieën aanpakken. De 3D-organoïden van deze techniek behouden inter-subject en intra-subject heterogeniteit en zijn daarom een nauwkeuriger model van de ziekte bij patiënten.

Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om mechanismen van resistentie tegen geneesmiddelen, tumorigenese, metastase en therapieën te onderzoeken die voorspelbaarder kunnen zijn voor de progressie van de ziekte bij patiënten en hun reactie op therapie.