Name: Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Leer hoe je multicellulaire humane primaire endometriale organoïden genereert voor reproductief gezondheidsonderzoek. Deze methode maakt fysiologische studies van hormoonrespons en ziekteprocessen buiten het lichaam mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd gefinancierd door NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) en Northwestern Feinberg school of Medicine Bridge Fund (JJK). Wij willen de noordwestelijke pathologie kern faciliteit voor de verwerking van de vaste organoïden voor paraffine insluiten erkennen. We willen het hele UG3 team erkennen, inclusief de Labs Woodruff, Burdette en Urbanek, voor de inzichtelijke discussies en samenwerkingen.

Endometrium monsters werden verzameld van premenopauzale vrouwen die routine hysterectomie ondergaan voor goedaardige baarmoeder condities bij het Northwestern University Prentice Women's Hospital, volgens een institutioneel Review Board-goedgekeurd protocol. Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle vrouwen die in de studie waren opgenomen.
1. bereiding van agarose-mallen
<ol><li>Voorafgaand aan het begin van de celisolatie, gegoten en equilibraten 1,5% agarose micro mallen (tabel van materialen) om de organoïden te huis heren volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>2. generatie van endometrium Organoïden
<ol><li>Oogst primaire stromale en epitheelcellen
	<ol>
<li>Bereid in een bioveiligheidskast met aseptische techniek enzym oplossing (2,5 mg/mL Collagenase type I + 0,1 mg/mL DNase I in 10 mL dispase [500 eenheden]) bij 37 °C, en steriel-Filtreer de oplossing met behulp van een 0,2 μm spuit filter in een conische buis van 15 mL.</li>
		<li>In een bioveiligheid Cabinet met een aseptische techniek, schraap het endometrium van de baarmoeder biopsieën en het gehakt weefsel onder de motorkap in zeer kleine stukjes met een scalpel. Opmerking: Endometrium weefsel dat ten minste 20 mm x 10 mm x 1 mm is vereist om voldoende aantal organoïden te genereren.</li>
		<li>Zet vers gehakt weefsel in de enzym oplossing in een conische buis van 15 mL. Sluit de dop en wikkel de top met een Wax Film (tabel met materialen) om besmetting te voorkomen.</li>
		<li>Zet de buis met weefsel in een waterbad of een incubator bij 37 °C gedurende 30 minuten met zacht schudden (80 − 100 rpm).</li>
		<li>Stapel een 100 μm celzeef bovenop een celzeef van 20 μm op een conische buis van 50 mL. Filtreer de oplossing door de twee zeven en spoel de conische buis van 15 mL af met 10 mL van de gebalanceerde zoutoplossing van Hank (HBSS; Tabel met materialen) en zet de wassing door de zeef om ervoor te zorgen dat alle cellen worden verzameld. Opmerking: De doorstroom vloeistof bevat stromale cellen en rode bloedcellen (~ 20 mL totaal). Epitheliale cellen worden verzameld op de 20 μm zeef. Stukjes onverteerd weefsel blijven bovenop de 100 μm zeef. Gooi onverteerd weefsel in een Biohazard afvalbak.</li>
		<li>Inverteer de 20 μm celzeef van stap 2.1.5 op een nieuwe conische buis van 50 ml en was de epitheelcellen van de zeef met 20 ml organoïde media (tabel met materialen) aangevuld met 1% pen/STREP.</li>
		<li>Centrifugeer de conische buizen van de stappen 2.1.5 en 2.1.6 bij 500 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Met de verzamelde stromale cellen verwijdert u het supernatant en rebrengt u de pellet met 10 mL rode bloedcel lysisbuffer.  Inbroed bij 37 °c gedurende 10 − 15 min. Centrifugeer de conische buis bij 500 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en laat de pellet remengen met 200 − 300 μL organoïde media (zie stap 2.2.2 voor verdere instructies).</li>
		<li>Met de verzamelde epitheliale cellen, verwijder de supernatant en opnieuw op te schorten met 100 μL organoïde media (zie stap 2.2.2 voor verdere instructies).</li>
	</ol></li>
	<li>Seeding van cellen
	<ol>
<li>Na het equilibreren van de 1,5% agarose mallen in Wells (1 mal per putje) van een 24-Wells plaat, verwijder organoïde media aan de buitenkant van de agarose mallen en kantel de weefselkweek plaat zodat het medium uit de cel zaaien kamer van de agarose gerechten ook kan worden voorzichtig verwijderd.</li>
		<li>Bekijk epitheliale (vanaf stap 2.1.9) en stromale (uit stap 2.1.8) cel suspensies onder de Microscoop.  Voeg meer organoïde media toe aan zowel de epitheliale als de stromale cel suspensies 100 μL tegelijk, zodat de suspensies ruwweg gelijk zijn aan de dichtheid. Opmerking: Epitheliale cellen zullen samen klonteren, en het is niet aan te raden om epitheelcellen in te verwerken/trypsinoiseren in eencellige suspensies.</li>
		<li>Combineer 1 deel van stromale cellen met 3 delen epitheelcellen per volume.</li>
		<li>Pipetteer 50 μL (60.000 cellen) van de gecombineerde celsuspensie in de cel zaaien kamer van de agarose-mal.</li>
		<li>Voeg, zodra de agarose-mallen gevuld zijn met cellen, voorzichtig 400 μL verse organoïde-media toe aan de put van de 24-Well plaat. Opmerking: Het medium bereikt net onder het oppervlak van de agarose gerechten en zal niet leiden tot de cellen te zweven uit de mallen. Na 2 − 3 dagen zullen de cellen zich vestigen en organoïden beginnen te vormen.</li>
		<li>Verander het medium elke tweede dag met 500 μL organoïde media.</li>
		<li>Na 2-3 dagen, verander medium naar een die wordt aangevuld met 0,1 nM Estradiol (E) en 0,8 nM testosteron (T) ter bevordering van de organisatie van epitheliale en stromale cellen. Opmerking: Hoewel de organisatie van epitheliale en stromale cellen kan optreden met of zonder hormonen, meer organoïden zal organiseren in de aanwezigheid van hormonen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. het oogsten van endometrium Organoïden voor experimenten
Opmerking: Nadat het experiment is uitgevoerd, kunnen endometrium organoïden worden verwerkt voor histologie of RNA-analyse. In de volgende stappen wordt beschreven hoe u de organoïden verwerkt.
<ol><li>
Histologie
	<ol>
<li>Los 1,5% agarose op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door te koken. Laat de vloeistof agarose afkoelen tot ongeveer 50 °C.</li>
		<li>Kantel de 24-pits plaat onder een ontleed Microscoop en Pipetteer voorzichtig het medium van de buitenkant van de agarose mal. Pipetteer voorzichtig het medium uit het binnenste van de agarose mal om te voorkomen dat de organoïden worden verstoord.</li>
		<li>Pipetteer met een ontleed Microscoop voorzichtig 70-75 μL warm (50 °C) 1,5% agarose in de kamer van het agarose-schaaltje. Zorg ervoor dat u de organoïden niet verstoort.</li>
		<li>Laat afkoelen bij 4 °C gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Voeg 4% Paraformaldehyde (PFA) toe aan elke put van de 24 goed plaat en bevestig de volledige verzegelde agarose mal die organoïden 's nachts bij 4 °C bevat. Bewaar vervolgens in 70% ethanol bij 4 °C tot het proces klaar is voor het insluiten van paraffine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA-isolatie
	<ol>
<li>Kantel de 24-Well plaat onder een ontleed Microscoop en Pipetteer voorzichtig het medium uit de kamer van de agarose mal.</li>
		<li>Pipetteer 1 ml vers organoïde medium met kracht rechtstreeks in de agarose mal zodat de organoïden uit de micro putten worden gespoeld. Wees voorzichtig om niet te veel bubbels te maken.</li>
		<li>Herhaal de Pipetteer opnieuw met hetzelfde medium uit stap 3.2.2.</li>
		<li>Verzamel alle medium met de organoïden. Centrifugeer bij maximale snelheid om de organoïden te verzamelen en door te gaan naar RNA-extractie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidualization+of+the+human+endometrium%3A+mechanisms%2C+functions%2C+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li>
<li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progesterone+receptor+regulates+implantation%2C+decidualization%2C+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li>
<li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li>
<li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li>
<li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+action+in+endometrial+cancer%2C+endometriosis%2C+uterine+fibroids%2C+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li>
<li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS%2FMS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben menselijke endometriale organoïden gegenereerd die bestaan uit epitheliale en stromale cellen van het endometrium zonder het gebruik van exogene steiger materialen. Hoewel het al is aangetoond dat primaire endometrium epitheelcellen organoïden6,7, deze cellen werden ingebed in een gelatineuze matrix van eiwitten uitgescheiden door muis Sarcoom cellen (Zie tabel van materialen) om te helpen vormen spheroid-achtige structuren. Bovendien, ...

Het menselijk endometrium lijnen de baarmoederholte en fungeert als het eerste contact voor het embryo tijdens de implantatie. Het endometrium bestaat uit Luminale en klier Epitheelcellen, ondersteunende stromale fibroblasten, endotheel cellen en immuuncellen. Samen vormen deze celtypen het endometrium weefsel dat een van de meest responsieve weefsels is voor geslachts steroïdhormonen1. De veranderingen die optreden tijdens elke menstruatiecyclus zijn opvallend. Er is een adequate groei en herinrichting van het endometrium nodig om de implantatie van embryo's mogelijk te maken. Afwijkende reactie op oestrogeen en progesteron kan resulteren in een refractair endometrium dat geen succesvolle instelling van de zwangerschap toestaat en zelfs kan resulteren in ziekten zoals endometriale neoplasie.
Om de hormoon responsen en essentiële veranderingen die zich voordoen in het endometrium te bestuderen, zijn cellen uit het baarmoederslijmvlies die uit de patiënten tijdens een operatie of endometriale biopsie zijn gepropageerd, in de celcultuur gekweekt. Endometrium stromale cellen vermenigvuldigen zich bij voorkeur gemakkelijk en propageren, en het proces van differentiatie geïnduceerd door progesteron kan in vitro worden samengevat. Als gevolg hiervan is veel geleerd tijdens dit differentiatieproces, genaamd decidualisatie2,3. Het andere belangrijke celtype in het endometrium, de Luminale en klier Epitheelcellen, echter niet groeien goed als traditionele monolagen, het verliezen van polariteit, steeds senescentie, en met beperkte proliferatieve potentieel. Als gevolg daarvan is er minder bekend van hun biologie en hun rol in het menselijk endometrium. Aangezien veel neoplasie afkomstig is van de epitheelcellen, blijven de mechanismen die gepaard gaan met hyperplasie of transformatie naar kankercellen volledig gedefinieerd. Bovendien, studies hebben vastgesteld dat hormoon respons impliceert de intieme paracrine acties tussen de epitheliale en stromale cellen van het endometrium4,5.
Onlangs werd een driedimensionale (3D) organoïde cultuur van endometrium epitheelcellen vastgesteld door twee onafhankelijke groepen van6,7, die de eerste rapporten zijn van organogeniden gevormd uit endometrium weefsel. Deze organoïden bestonden uit endometrium epitheelcellen ingebed in een eiwit matrix (tabel van materialen) en bevatte geen belangrijk hormonaal responsief compartiment van het baarmoederslijmvlies, de stromale fibroblasten. Aangezien de matrix eiwitten van lot tot lot kunnen variëren en signalering trajecten kunnen activeren die niet noodzakelijkerwijs in het weefsel voorkomen, zou het ideaal zijn om de matrix eiwitten te vervangen door componenten van het endometrium. In de huidige studie, een protocol voor het genereren van steigers-vrije menselijke endometriale organoïden van epitheliale en stromale cellen van het menselijk endometrium wordt gepresenteerd. De aanwezigheid van stromale cellen biedt niet alleen ondersteuning voor Epitheelcellen, maar biedt ook de noodzakelijke paracrine-acties die zijn vastgesteld om belangrijk te zijn voor de respons van het endometrium hormoon4,8,9 .
De nieuwe multicellulaire endometriale organoïde biedt een modelsysteem van het endometrium dat eenvoudig te genereren is en dat zowel epitheliale als stromale cellen bevat. Deze organoïden kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van hormonale veranderingen op de lange termijn en vroege gebeurtenissen van ziekte zoals tumorvorming als gevolg van hormonale onbalans of exogene insulten. De complexiteit van deze organoïden kan uiteindelijk worden uitgebreid met andere celtypen, waaronder endotheel-en immuuncellen met mogelijk myometriale cellen om de Fysiologie van het menselijk weefsel echt te nabootsen.

<table><tbody><tr><td>Agarose HS, moleculair biologie kwaliteit</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Agarose vormen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z764043</td><td>(https://www.microtissues.com/)</td></tr><tr><td>Ammoniumchloride (NH4Cl)</td><td>Amresco</td><td>0621</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type II, poeder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Corning</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Eosine Kleurstof</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Oestrogeen Receptor (SP1), konijnen monoklonaal antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9101-S</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield met DAPI, histologie montage medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1x zonder calcium, magnesium en fenol rood</td></tr><tr><td>Hematoxyline Kleurstof Oplossing</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3530-32</td><td>Gemodificeerde Harris formulering, kwikvrij</td></tr><tr><td>Heparine oplossing</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07980</td><td>toegevoegd aan MammoCult media</td></tr><tr><td>Hydrocortison stockoplossing</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07925</td><td>toegevoegd aan MammoCult media</td></tr><tr><td>Organoïde media - Mammocult</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05620</td><td>aangevuld met 2 &micro;L/mL heparine en 5 &micro;L/mL hydrocortison</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 16% oplossing</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron Receptor, PgR 1294, ongeconjugeerd, cultuur supernatant</td><td>Agilent Technologies</td><td>M356801-2</td><td></td></tr><tr><td>Eiwit matrix - Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd muis anti-E-cadherine antilichaam</td><td>BD Biociences</td><td>610181</td><td>Clone 36</td></tr><tr><td>Recombinant anti-vimentin antilichaam [EPR3776]</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>RNA lysering en isolatie kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2060</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Testosteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86500</td><td></td></tr><tr><td>Trichrome Kleurstof</td><td>Abcam</td><td>ab150686</td><td></td></tr><tr><td>Wax film - Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van multicellulaire humane primaire endometriale organoïden

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Het menselijk endometrium is een van de meest hormonaal responsieve weefsels in het lichaam en is essentieel voor de vaststelling van de zwangerschap. Dit weefsel kan ook ziek worden en morbiditeit en zelfs de dood veroorzaken. Model systemen om menselijke endometrium biologie te bestuderen zijn beperkt tot in vitro cultuur systemen van enkele celtypen. Bovendien, de epitheelcellen, een van de belangrijkste celtypen van het endometrium, niet goed propageren of behouden van hun fysiologische eigenschappen in de cultuur, en dus ons begrip van endometriale biologie blijft beperkt. We hebben voor de eerste keer endometriale organoïden gegenereerd die bestaan uit zowel epitheliale als stromale cellen van het menselijk endometrium. Deze organoïden vereisen geen exogene steiger materialen en organiseren specifiek zodat epitheelcellen de spheroid-achtige structuur omvatten en gepolariseerd worden met stromale cellen in het midden die collageen produceren en afscheiden. Oestrogeen, progesteron en androgeen receptoren worden uitgedrukt in de epitheliale en stromale cellen en behandeling met fysiologische niveaus van oestrogeen en testosteron bevorderen de organisatie van de organoïden. Dit nieuwe modelsysteem kan worden gebruikt om normale endometriale biologie en ziekte te bestuderen op manieren die voorheen niet mogelijk waren.

Een schematische voorstelling van het protocol is afgebeeld in Figuur 1. Baarmoeder weefsel werd verkregen uit een operatie nadat het werd onderzocht door pathologen. Het baarmoederslijmvlies werd van het myometrium gescheiden door schrapen en het endometriale weefsel werd enzymatisch verteerd naar cellen zoals beschreven in het protocol. Epitheliale en stromale cellen werden toegevoegd in micro putten in de agarose mallen. Na 7 dagen in de cultuur werden organoïden behandeld met E en T gedu...

Een protocol voor het genereren van menselijke primaire endometriale organoïden die bestaan uit epitheliale en stromale cellen en behouden kenmerken van het inheemse endometrium weefsel wordt gepresenteerd. Dit protocol beschrijft methoden van uteriene weefsel verwerving tot de histologische verwerking van endometriale organoïden.

Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Het endometrium is een weefsel dat elke maand verandert in reactie op hormonen. Hormoon onbalans kan voorkomen dat embryo gehechtheid en ook ziekten zoals kanker veroorzaken. Ons protocol herbouwt het endometrium zodat het op fysiologische wijze buiten het lichaam van de vrouw kan worden bestudeerd.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een 3D-structuur van cellen bestaat uit twee hormonaal responsieve celtypes, de epitheliale en stroma cellen die specifiek organiseren en gedragen zoals ze doen in het lichaam. Omdat de organoïden weefselgedrag beter kunnen nabootsen, kunnen ze uiteindelijk worden gebruikt om verschillende geneesmiddelen te testen. De endometriumorganoïden kunnen worden gebruikt om directe effecten van de momenteel bekende risicofactoren voor kanker te bestuderen, waaronder obesitas en polycystend eierstoksyndroom.Onze organoïden benadrukken het belang van paracrineacties tussen twee celtypen. Het is belangrijk om te beginnen met een voldoende hoeveelheid weefsel. Het verkrijgen van de juiste dichtheid van epitheliale en stromal cellen kan lastig zijn.Ook de organoïden zijn vrij klein en kan moeilijk te visualiseren met IHC kleuring. Visualisatie van deze procedure is belangrijk omdat er een aantal stappen die veel gemakkelijker te begrijpen na het zien van hen. Deze omvatten het krijgen van de juiste weefsellaag van de baarmoeder, het krijgen van de juiste dichtheid van cellen te combineren, en zaaien van de agarose schimmels.Voordat u begint met celisolatie, gegoten en equilibrate 1,5%agarose micro-mallen volgens de instructies van de fabrikant om de organoïden huis. Gebruik in een bioveiligheidskast aseptische technieken om een enzymoplossing op 37 graden Celsius voor te bereiden en steriel filter de oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,2 micrometer in een conische buis van 15 milliliter. Met behulp van een scalpel, schraap endometrium uit de baarmoeder biopsieën en gehakt het weefsel in zeer kleine stukjes.Plaats het vers gehakte weefsel in de 15-milliliter conische buis met de enzymoplossing. Sluit de dop en wikkel de bovenkant van de buis met een wax film om besmetting te voorkomen. Plaats de buis in een waterbad of couveuse op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met zachtjes schudden.Stapel hierna een 100-micron celzeef op een 20-micron celzeef op een conische buis van 50 milliliter. Filter de oplossing door de twee strainers. Spoel de 15-milliliter conische buis met HBSS en zet deze was door de zeef om ervoor te zorgen dat alle cellen worden verzameld.Draai vervolgens de 20-micron celzeef om op een nieuwe conische buis van 50 milliliter en was de epitheelcellen van de zeef met 20 milliliter organoïde media aangevuld met 1%penicilline en streptomycine. Centrifuge de conische buizen op 500 G gedurende vijf minuten. Voor de verzamelde stromalcellen, verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 10 milliliter van rode bloedcel lyse buffer.Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 tot 15 minuten. Centrifugeren deze cellen op 500 G gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant en resuspend de pellet met 200 tot 300 microliter van organoïde media.Voor verzamelde epitheelcellen, verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 100 microliterten van organoïde media. Nadat de 1,5% agarose mallen zijn geëquilibreerd, verwijder de organoïde media aan de buitenkant van de agarose mallen en kantel de weefselkweekplaat, zodat het medium uit de celzaaikamer van de agarose gerechten ook zorgvuldig kan worden verwijderd. Bekijk de epitheliale en stromale celsuspensies onder een microscoop en voeg meer organoïde media toe aan de suspensies, waarbij u ervoor zorgt dat u slechts 100 microliters tegelijk toevoegt, zodat de suspensie ongeveer gelijk is aan dichtheid.Combineer vervolgens een deel van de stromale cellen met drie delen van de epitheliale cellen in volume. Pipette 50 microliters van de gecombineerde celsuspensie in de celzaaikamer van de agarosemal. Zodra de agarose mallen zijn gevuld met cellen, zorgvuldig toe te voegen 400 microliter van verse organoïde media in de putten van de 24-well plaat.Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide, zorg ervoor dat het medium elke tweede dag verandert met 500 microliter organoïde media. Na zeven dagen, verander het medium naar een die wordt aangevuld met 0,1 nanomolar estradiol en 0,8 nanomolar testosteron ter bevordering van de organisatie van de epitheliale en stromale cellen. Los eerst 1,5% agarose op in PBS door te koken.Plaats de vloeistof agarose in een bekerglas van warm water en laat het afkoelen tot ongeveer 50 graden Celsius. Onder een ontledenmicroscoop, kantelen de 24-well plaat en zorgvuldig pipette uit het medium van de buitenkant van de agarose schimmel. Dan voorzichtig pipette uit het medium uit het interieur van de agarose schimmel om te voorkomen dat het verstoren van de organoïden.Voeg voorzichtig tussen de 70 en 75 microliter warme, 1,5% agarose toe in de kamer van de agarose schotel, voorzichtig om de organoïden niet te verstoren. Laat de plaat vijf minuten afkoelen op vier graden Celsius. Voeg hierna 4% paraformaldehyde toe aan elke put van de 24-putplaat en bevestig de hele verzegelde agarose-mal 's nachts bij vier graden Celsius.De volgende dag, bewaar de plaat in 70% ethanol op vier graden Celsius tot klaar om te verwerken voor paraffine inbedding. Om te beginnen RNA isolatie, bekijk de plaat onder een ontleden microscoop. Kantel de plaat en voorzichtig pipette uit het medium uit de kamer van de agarose schimmel.Krachtig pipette een milliliter van verse organoïde medium direct in de agarose schimmel, zodat de organoïden worden gespoeld uit de microwells, voorzichtig niet te veel bubbels te creëren. Herhaal dit krachtige pipettingproces eenmaal met hetzelfde medium. Verzamel hierna al het medium met de organoïden.Centrifuge bij 500 G om de organoïden te verzamelen en over te gaan tot RNA-extractie. In deze studie worden menselijke endometriumorganoïden bestaande uit epitheliale en stromalcellen van het endometrium gegenereerd zonder het gebruik van exogene steigermaterialen. Voor histologische verwerking worden de agarosemallen die de endometriumorganoïden bevatten verzegeld met agarose, gevolgd door fixatie met 4% paraformaldehyde 's nachts.Deze mallen worden verwerkt voor standaard paraffine inbedding geneude en gekleurd voor histologie, immunofluorescentie, of immunohistochemie. De hematoxyline in eosine kleuring onthult een sferoïde-achtige structuur met een enkele laag cellen langs de buitenkant en cellen in het midden. Celspecifieke markers voor endometrium-, epitheliale en stromale cellen onthullen epitheliale cellen rond de organoïde met stromale cellen in het midden.Markers van endometriumfysiologie bevestigen dat de endometriumorganoïden bepaalde kenmerken van het inheemse weefsel behielden. Tri-chroom kleuring, die vlekken collageen blauw en cellen rood, toont de aanwezigheid van collageen in het centrum waar stromale cellen verbleven, waaruit blijkt actieve productie en afscheiding van collageen door stromale cellen vergelijkbaar met het inheemse weefsel. Bovendien, immunohistochemische kleuring onthult de aanwezigheid van oestrogeenreceptoren, androgeen receptoren, en progesteron receptoren in zowel de epitheliale en stromale cellen.Het is belangrijk om de cellen dicht te borderen, zodat we genoeg organoïden hebben voor downstream experimenten. Dit zal enige oefening vereental. Endometriumorganoïden kunnen onder verschillende omstandigheden worden gekweekt en vervolgens worden geoogst voor experimenten zoals immunohistochemie of immunofluorescentiekleuring om eiwitexpressie te bestuderen of geoogst te worden voor RNA om genexpressie te bestuderen.Ons lab onderzoekt hoe het endometrium reageert op veranderde hormoonspiegels, wat kan leiden tot endometriumhyperplasie en kanker. We kunnen deze organoïden gebruiken voor langdurige behandelingen van hormonen en pathologische aandoeningen toevoegen, zoals teveel testosteron gevonden in polycystend eierstoksyndroom, of signalen van adipocyten om door obesitas geïnduceerde endometriumveranderingen te bestuderen. Menselijke weefsels worden beschouwd als biogevaarlijk, en het zal belangrijk zijn om passende voorzorgsmaatregelen te nemen.

generation-of-multicellular-human-primary-endometrial-organoids

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De gehele 3D-structuur en cellulaire inhoud van organoïden, evenals hun fenotypische gelijkenis met het oorspronkelijke weefsel kan worden vastgelegd met behulp van de single-cell resolutie 3D imaging protocol hier beschreven. Dit protocol kan worden toegepast op een breed scala van organoïden variërend in oorsprong, grootte en vorm.

Single-Cell Resolutie driedimensionale beeldvorming van intacte organoïden

Hier worden vier methoden beschreven voor het genereren van testiculaire organoïden uit primaire neonatale murine-testiculaire cellen, d.w.z. extracellulaire matrix (ECM) en ECM-vrije 2D- en 3D-cultuuromgevingen. Deze technieken hebben meerdere onderzoekstoepassingen en zijn vooral nuttig voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling en fysiologie in vitro.

Extra Cellular Matrix-based en extra cellular matrix-vrije generatie van Murine Testiculaire Organoïden

We presenteren een protocol om epitheliale organoïde culturen te ontwikkelen, uitgaande van menselijke tand. De organoïden zijn robuust uitbreidbaar en recapituleren de epitheelstamcellen van de tand, inclusief hun ameloblastdifferentiatiecapaciteit. Het unieke organoïde model biedt een veelbelovend hulpmiddel om de menselijke tandheelkundige (stamcel) biologie te bestuderen met perspectieven voor tandregeneratieve benaderingen.

Organoïden van menselijke tand vestigen als een krachtig hulpmiddel voor mechanistisch onderzoek en regeneratieve therapie

Dit protocol beschrijft methodologieën om endometriumepitheelorganoïden van muizen vast te stellen voor genexpressie en histologische analyses.

Het vaststellen van 3D-endometriumorganoïden uit de baarmoeder van de muis

Dit protocol beschrijft het genereren van snelle en reproduceerbare endodermale leverorganoïden (eHEPO's). Met dit protocol kunnen eHEPO's binnen 2 weken worden geproduceerd en op lange termijn (meer dan 1 jaar) worden uitgebreid zonder hun differentiatie en functionaliteit te verliezen.

Genereren van functionele endodermale leverorganoïden

Dit protocol beschrijft het maken van driedimensionale (3D) weefselorganoïden uit primaire menselijke ovariumoppervlakte-epitheel (hOSE) cellen. Het protocol omvat isolatie van hOSE uit vers verzamelde eierstokken, cellulaire expansie van de hOSE, cryopreservatie-ontdooiprocedures en organoïde-afleiding. Immunofluorescentie, kwantitatieve analyse en het demonstreren van het nut als screeningplatform zijn inbegrepen.

Menselijke ovariële oppervlakte-epitheel organoïden als een platform om weefselregeneratie te bestuderen

Hier presenteren we een protocol om endometriumepitheliale stamcellen (reESC's) van ratten te isoleren en te kweken, waardoor endometriumorganoïden van ratten worden gegenereerd. Deze methode vergemakkelijkt in vitro studies van endometriumaandoeningen, waardoor genbewerking en andere cellulaire manipulaties mogelijk worden.

Generatie en karakterisering van baarmoederorganoïden van ratten uit endometrium-epitheliale stamcellen van ratten

We presenteren een gedetailleerd protocol om menselijke cervicale organoïden vast te stellen en genetisch te manipuleren.

Generatie en genetische manipulatie van menselijke cervicale organoïden

Dit protocol beschrijft een gedefinieerde hydrogel-gebaseerde methode om menselijke borstorganoïden te genereren die belangrijke kenmerken van mammariummorfogenese recapituleren in een gecontroleerd driedimensionaal kweeksysteem.

Een gedefinieerde hydrogel-gebaseerde methode voor het genereren van driedimensionale menselijke borstorganoïden die mammaire morfogenese recapituleren

Het modelleren van de ontwikkeling van de menselijke hersenen is belemmerd door de ongekende complexiteit van neurologisch epitheelweefsel. Hier wordt een methode beschreven voor de robuuste generatie van hersenorganoïden om vroege gebeurtenissen van de menselijke hersenontwikkeling af te bakenen en om microcefalie in vitro te modelleren.

Genereren van iPSC afgeleide Human Brain Organoids naar Early Neurodevelopmental Disorders Model

Leer hoe je multicellulaire humane primaire endometriale organoïden genereert voor reproductief gezondheidsonderzoek. Deze methode maakt fysiologische studies van hormoonrespons en ziekteprocessen buiten het lichaam mogelijk.

Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden

Meer video's verkennen