Name: Oligomerisatie dynamiek van celoppervlak receptoren in levende cellen door totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie gecombineerd met cijfer-en helderheids analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Leer oligomerisatie van celoppervlakreceptoren analyseren met TIRF-microscopie en N&B-analyse in levende HeLa-cellen. Deze methode maakt real-time observatie van receptorclustering en signaaltransductie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De CNIC wordt ondersteund door het ministerie van Ciencia, innovacion y Universidades en de Pro CNIC Foundation, en is een Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). We worden ook gesteund door het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling (FEDER) "una manera de hacer Europa". UC erkent de steun van de Associazione Italiana ricerca Sul cancro, de vereniging voor internationaal kankeronderzoek (nu bekend als wereldwijd kankeronderzoek) en het Italiaanse ministerie van volksgezondheid. A.T. erkent de "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" voor het gedeeltelijk ondersteunen van zijn werk met de PV Fellowship "Progetto professionalità Ivano Becchi" 2011-2012.

1. monstervoorbereiding
<ol><li>Dag 1. Zaad HeLa cellen in volledig medium bij een concentratie van 100000-200000 cel/mL in glazen bodem gerechten. Seed 6-8 repliceert gerechten. Opmerking: In dit voorbeeld wordt het medium aangevuld met 10% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 1 mM natrium pyruvate, 100 U/100 μg penicillaire/streptomycine. Er worden verschillende replicaatgerechten bereid.</li>
	<li>Dag 2-3. Wanneer cellen in subconfluency zijn, transfect de helft van de gerechten met het eiwit plasmide en de tweede helft met referentie plasmiden (monomeer en dimeer), in serumvrij medium. Opmerking: Transfectie wordt gemaakt in serumvrij medium aangevuld met antibiotica, 0,1% runderserum albumine en 25 mM HEPES-buffer, zonder fenolrood.</li>
	<li>Dag 3-4. Controleer of de gefixeerde cellen zich aan de onderkant van de gerechten hechten en het celmembraan fluorescerend is. Gooi gerechten met overwoekerde cellen weg of met een zeer lage fluorescentie. Opmerking: Laat cellen niet overgroeien. De cellen moeten goed verdeeld zijn en worden vastgehouden in het glasoppervlak van de schaal (Figuur 1A). Voorgecoate glazen bodem gerechten kunnen worden gebruikt voor het voorkeur aan celadhesie. De celcultuur wordt vóór een experiment getest op Mycoplasma besmetting. In dit voorbeeld worden cellen met een (A207K) megfp-FGFR1 plasmide getransfeerd en worden de referentiecellen met een GPI-(A207K) megfp en een GPI-(A207K) megfp-(A207K) megfp plasmiden gebruikt met behulp van standaardprotocollen. Voor levende cellen microscopie wordt een indicator vrij medium aanbevolen; 25 mM HEPES-buffer wordt toegevoegd om pH-veranderingen tijdens beeldvorming te voorkomen.</li>
</ol>2. TIRF Imaging — uitlijning van de laser lijn en optimalisatie van TIRF-verlichting
<ol><li>Vier uur voor het experiment, activeer de temperatuur Incubator van de Microscoop bij 37 °C.</li>
	<li>Schakel de Microscoop, computers en camera's in en wacht tot de camera's de juiste werktemperatuur hebben bereikt. Opmerking: De werktemperatuur van de camera die in deze studie wordt gebruikt, is-75 °C.</li>
	<li>Plaats een kleine druppel olie op het doel. Zet een monster schotel op zijn plaats. Sluit de deuren van de incubator en laat de temperatuur van de schotel equilibreren (~ 10 min).</li>
	<li>Zet de epifluorescentie lamp en de 488 nm laser aan.</li>
	<li>Selecteer de epifluorescentie contrast modus om het monster te verkennen en zoek een cel om zich te concentreren vanaf het oculair. Opmerking: Het gebruik van een fluorescerende lamp voor het doorzoeken van cellen via het oculair is niet verplicht. In plaats daarvan kan een geschikte laser lijn worden gebruikt.</li>
	<li>Selecteer het juiste filter voor het verzamelen van de groene emissie via de Microscoop camera (band pass ex 490/20 (500) band doorgeven em 525/50, of iets dergelijks.</li>
	<li>Schakel van het oculair naar de camera poort (camera #1 in Figuur 1) in de epifluorescentie modus, Verfijn de scherpstelling en verander naar de tirf-modus. Epifluorescentie en TIRF-modi kunnen worden genoemd met een andere nomenclatuur, afhankelijk van het merk van de Microscoop. Opmerking: Er kunnen problemen zijn met het scherpstellen of uitlijnen van de laser als er geen fluorescerende markeringen in de afdek interface zijn. Om de laser op de juiste manier uit te lijnen (essentieel voor goede TIRF), moet u zich concentreren op de coverslip. Het is vaak heel moeilijk om te bepalen of de dekslip scherp is. Als suggestie, focus op de randen van de cellen.</li>
	<li>Activeer de automatische uitlijning volgens de instructies van de TIRF-Microscoop. Opmerking: Kort, voor stappen van 2,4 tot 2,8, Zoek eerst de cellen door het oculair en concentreer op hen, stuur dan de emissie naar de camera poort van de TIRF-Microscoop, richt de cellen opnieuw op het scherm van de Microscoop en activeer de procedure voor laser uitlijning. De uitlijning bestaat uit het vinden van de kritische hoek waarbij de belichting wordt weer licht (Figuur 3). Commerciële microscopen kunnen enigszins verschillende uitlijnings protocollen hebben en ook volledig geautomatiseerd zijn; anderen kunnen een kleine camera hebben om de visualisatie van de kritieke hoek condities te vergemakkelijken.</li>
	<li>Kies een geschikte verlichtings diepte en Optimaliseer de richting van het veld met de klachten (Figuur 3). Opmerking: De penetratie diepte wordt constant gehouden voor alle bedieningselementen en samples.</li>
</ol>3. TIRF Imaging: opname van de tijdreeks
<ol><li>Definieer een regio van belang (ROI) van ten minste 256 x 256 pixels. Opmerking: In deze set-up wordt de opname gedaan met camera #2 onder software die rechtstreeks alleen de camera bestuurt (Zie Figuur 1 legende).</li>
	<li>Stel de belichting in op 1 MS en de EM-versterking tot 1.000 (dit is de G-factor in EQ. 12 en 13). Bij een dergelijke snelheid kan het nodig zijn om het Laser vermogen aan te passen of te verhogen. Hier is laser vermogen 0,5 mW. Opmerking: Afhankelijk van het type camera en de limieten die worden opgelegd door de diffusiecoëfficiënt van het eiwit, de intensiteit van de fluorescentie en de achtergrond, zijn de algemene criteria voor het instellen van het Laser vermogen niet om de detector te verzaderen, foto bleken te minimaliseren en vast te leggen als snel mogelijk bij een redelijke S/N. De EM-versterking wordt altijd ingesteld op het maximum van de camera (Zie Inleiding).</li>
	<li>Voer een eerste proef reeks uit onder initiële omstandigheden en schat ruwweg de S/N-waarde. De voorwaarden zijn aanvaardbaar op S/N = 2-3 of hoger, zoals gemeten in het eerste frame van de eerste tijdreeks.</li>
	<li>Gebruik de schuifregelaar van het emissiesplitsings systeem dat de camera #2 verbindt met de Microscoop voor het maskeren van een zijde van de afbeelding (Figuur 1b, Figuur 4a-b) Opmerking: In deze set-up is een multi channel Imaging connector geïnstalleerd op camera #2 om de overname van twee ruimtelijk identieke beelden tegelijk mogelijk te maken. Het systeem is uitgerust met glijbanen voor het monteren van verschillende emissie filters. Een van de schuifregelaars koppelt een zwart masker om een zijde van de afbeelding te bedekken. Het gemaskerde gebied wordt gebruikt voor de interne kalibratie van elke tijdreeks, om de camera parameters te bepalen (EQ. 12 en EQ. 13). Op deze manier is er geen behoefte aan een onafhankelijke kalibratie stap en, belangrijk, de kalibratie wordt parallel aan de opname van elke tijdreeks uitgevoerd. Bij afwezigheid van dit systeem kan de camera worden gekalibreerd door gepubliceerde protocollen33toe te passen.</li>
	<li>Selecteer de optie voor het automatisch opslaan van het camera bestand.</li>
	<li>Start de overname van de Afbeeldingsreeks. Verkrijg minimaal 700 frames met een minimale S/N-ratio van 2. Opmerking: Het aantal frames dat nodig is voor de analyse is afhankelijk van de monster stabiliteit voor fotobleaching en de spreiding van de gegevens. Daarom wordt de kwaliteit van elke tijdreeks geëvalueerd tijdens N & B-analyse.</li>
	<li>Voeg de ligand toe zonder het gerecht uit de Microscoop te halen.</li>
	<li>Selecteer een cel met een helder fluorescentie membraan en start snel de eerste tijdreeks van de kinetische run. Opmerking: Als de toevoeging van de ligand snel wordt gedaan, stelt deze eerste opname het punt = 0 tijd van de ligand kinetiek in. De software registreert het exacte tijdstip van de opname.</li>
	<li>Zoek een tweede cel en verkrijg het tweede tijdpunt van de kinetiek. Opmerking: Punt-bezoek routines zijn beschikbaar in sommige microscopen die zijn uitgerust met gemotoriseerde x-, y-en z-fasen. Deze laten het onthouden van meerdere posities op de celschaal toe en kunnen helpen bij het bijhouden van een meer constant tijdsinterval tussen de beeld reeks op verschillende cellen.</li>
	<li>Leg een nieuwe cel vast voor elk tijdpunt van de kinetische run. Opmerking: Na het vastleggen is een cel deels fotogebleekt en kan deze niet opnieuw worden afgebeeld. Hierdoor wordt de kinetiek verkregen door het combineren van tijdreeksen van veel cellen, elk gevangen op een ander tijdstip.</li>
	<li>Herhaal voor elk nieuw gerecht het Protocol van stap 2,3 tot en met 3,9. Opmerking: Voor referentie gerechten, voeg een volume van het voertuig (PBS aangevuld met 0,01% boviene serumalbumine) equivalent aan die gebruikt voor de ligand.</li>
</ol>4. nummer & helderheid (N & B): kwaliteitscontrole van de tijdreeks
<ol><li>Converteren en opslaan als. TIFF de bestanden die zijn verkregen met de camera software (sif-bestanden in dit voorbeeld).</li>
	<li>Importeren. TIFF-bestanden in de analyse software routine door het activeren van de N & B grafische gebruikersinterface (GUI) MATLAB. Opmerking: Een aangepaste MATLAB uitvoerbare N & B routine wordt hier gebruikt (N & B analyse op https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Door een geïmporteerde te openen. TIFF-bestand, genereert de routine de gemiddelde intensiteits afbeelding, het gemiddelde intensiteits profiel en u de serie frame-voor-frame (aanvullende figuur 1) inspecteren. Andere software zijn beschikbaar voor N & B-analyse (bijvoorbeeld SimFCS-software).</li>
	<li>Serie verwijderen waarvoor het gemiddelde intensiteits profiel meer dan 10% foto bleken vertoont, en reeksen waarin een duidelijke celmembraan vervorming of-vertaling is opgetreden tijdens de overname.</li>
	<li>Uitsnijd kaders die duidelijk buiten de focus liggen. Opmerking: Een bijsnijd hulpmiddel wordt in de routine geïmplementeerd om enkele of meerdere frames binnen de reeks afbeeldingen te kunnen weggooien. Deze bewerking is toegestaan omdat frame-naar-frame tijd niet essentieel is, terwijl de pixel dwelltijd (belichtingstijd) is (zie discussie).</li>
	<li>Houd voor de analyse alleen reeksen met ten minste 500 tijdframes.</li>
</ol>5. aantal & helderheid (N & B): bepaling van de camera parameters (offset, σ en S)
<ol><li>Activeer de routine Kalibreer camera.</li>
	<li>Selecteer een oppervlak van ten minste 20 x 50 pixels in de geluids regio van de melder (Figuur 4). Opmerking: De routine is afkomstig van een histogram van de waarden (ook gedefinieerd digitaal niveau, DL) en retourneert een logaritme plot van de frequentie versus digitale niveaus.</li>
	<li>In de log frequentie versus digitale niveau plot, verplaats de lineaire rode cursor om de Gaussiaan en het lineaire deel van de curve te scheiden. Opmerking: De rode cursor verdeelt de twee delen van de curve en activeert de routine die de verschuiving retourneert, wat het middelpunt is van de Gaussiaanse functie van de camera respons, de σ van de Gaussiaanse pasvorm en de S-factor, die de helling is van het lineaire deel van de camera Response e (Figuur 4C-D).</li>
</ol>6. nummer & helderheid (N & B): berekening van de B-waarden in geselecteerd regio-van-belang (ROI)
<ol><li>Activeer de B -toets. Opmerking: Deze actie genereert de afbeelding met de gemiddelde intensiteit (Figuur 5, eerste kolom) en de b-afbeelding waarin elke afzonderlijke b-waarde is gekoppeld aan de gerelateerde pixel in de afbeelding (aanvullend figuur 1).</li>
	<li>Breng een minimum binning (2 2) aan om de spreiding van de gegevens te verminderen en het B-I histogram te genereren (Figuur 5, tweede kolom). Opmerking: Het B-I-histogram vertegenwoordigt de verdeling van de B-waarden van alle pixels van de afbeelding versus de pixel intensiteit. Y = B/S; X = (<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> </img> -offset)/S (aanvullende figuur 1 en EQ. 11 en 15).</li>
	<li>Inspecteer het B-I-histogram met behulp van de interactieve vierkante cursor.</li>
	<li>Selecteer een vierkante ROI voor de analyse (afbeelding 5, derde kolom). Opmerking: De cursor synchroniseert een mobiel masker op de afbeelding met gemiddelde intensiteit, waarbij de pixels worden gemarkeerd die zijn geselecteerd binnen het vierkante cursor gebied (aanvullend figuur 1). Door deze inspectie is het mogelijk om de achtergrond en gebieden met een zeer lage intensiteit van de analyse uit te sluiten.</li>
	<li>Genereer de B-map van de geselecteerde ROI (afbeelding 5, vierde kolom).</li>
	<li>Sla het ASCII-bestand op van de B-waarden die aan de selectie zijn gekoppeld.</li>
	<li>Importeer het ASCII-bestand in een grafische software om de frequentieverdeling van de gegevens te berekenen en de gemiddelde B-waarde ± S. E te verkrijgen (Figuur 5, vijfde kolom). Opmerking: Als de gegevens homogeen zijn, benadert de frequentieverdeling van de B-waarden een Gaussiaanse verdeling.</li>
	<li>Pas EQ. 15 toe om de gemiddelde helderheid <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq18.jpg"> = <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq19.jpg"> -1 [(tellingen/molecuul) per dwelltijd] voor elke cel op elk tijdstip van de kinetische uitvoering af te leiden. Normaliseer de gegevens volgens: <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq17.jpg"> waar <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq20.jpg"> is de gemiddelde b-waarde gemeten op tijd "t" na ligand optellen, en <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq21.jpg"> is de gemiddelde b-waarde gemeten op het moment t = 0 (10-20 s na ligand optellen). Opmerking: De normalisering van de resultaten maakt de directe vergelijking van experimenten die worden uitgevoerd in verschillende dagen. Het compenseert de verschillen in de gemeten helderheid als gevolg van laser vermogen en technische schommelingen.</li>
	<li>Plot de genormaliseerde gemiddelde helderheid versus acquisitie tijd om de kinetische run te bouwen (Figuur 6).</li>
</ol>

<ol><li>Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+insights+into+gonadotropin+hormone+receptor+dimerization+and+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Minerva+Ginecologica%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization.</a> Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).</li>
<li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited%3A+functional+and+pharmacological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).</li>
<li>Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+receptor+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Muscarinic receptor oligomerization.</a> Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).</li>
<li>Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+Receptor+Signaling%3A+Impact+of+Receptor+Oligomerization+on+Receptor+Function%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).</li>
<li>Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+oligomerization%3A+functional+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor oligomerization: functional considerations.</a> Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).</li>
<li>Van Craenenbroeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR+oligomerization%3A+contribution+to+receptor+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Subcellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis.</a> Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).</li>
<li>Wnorowski, A., Jozwiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homo-+and+hetero-oligomerization+of+beta2-adrenergic+receptor+in+receptor+trafficking%2C+signaling+pathways+and+receptor+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signaling+Technology%22%5BJournal%5D)">Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology.</a> Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).</li>
<li>Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+methods+to+study+membrane+receptor+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization.</a> Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).</li>
<li>Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+complementation+assays%3A+new+tools+to+study+G+protein-coupled+receptor+oligomerization+and+GPCR-mediated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).</li>
<li>Trussell, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrussell%2C+HJ+%22Academic+Press+Library+in+Signal+Processing%22">Academic Press Library in Signal Processing</a>. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+dendritic+spines+by+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).</li>
<li>Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+accurately+locate+and+count+large+numbers+of+steps+by+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).</li>
<li>Godin, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+protein+oligomerization+and+densities+in+situ+using+spatial+intensity+distribution+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).</li>
<li>Qian, H., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+molecular+aggregation+by+analysis+of+fluctuation+moments%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).</li>
<li>Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photon+counting+histogram+in+fluorescence+fluctuation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).</li>
<li>Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+particle+number+and+brightness+using+a+laser+scanning+confocal+microscope+operating+in+the+analog+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode.</a> Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).</li>
<li>Unruh, J. R., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+concentration+and+brightness+from+fluorescence+fluctuation+data+with+an+electron+multiplied+CCD+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera.</a> Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+chemical+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review.</a> Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).</li>
<li>Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).</li>
<li>Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+FCS%2C+a+novel+method+for+three-dimensional+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking.</a> Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).</li>
<li>Hinde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+dynamics+of+the+oligomeric+transcription+factor+STAT3+by+pair+correlation+of+molecular+brightness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness.</a> Nature Communications. 7, 11047(2016).</li>
<li>Waithe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+processing+and+analysis+of+conventional+confocal+microscopy+generated+scanning+FCS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data.</a> Methods. 140-141, 62-73 (2018).</li>
<li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li>
<li>Ossato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+path+to+inclusion+formation+of+huntingtin+peptides+revealed+by+number+and+brightness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis.</a> Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).</li>
<li>Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+resting+and+ligand-bound+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases+in+living+cells+using+number+and+brightness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).</li>
<li>Ming, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+Distribution+of+Klothobeta+%28KLB%29+and+fibroblast+growth+factor+receptor-1+%28FGFR1%29+in+living+cells+reveal+the+fibroblast+growth+factor-21+%28FGF21%29-induced+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).</li>
<li>Ross, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+state+of+dynamin+2+in+cell+membranes+using+TIRF+and+number+and+brightness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis.</a> Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).</li>
<li>Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+brightness+image+analysis+reveals+ATF-induced+dimerization+kinetics+of+uPAR+in+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane.</a> FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).</li>
<li>Zamai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+brightness+analysis+reveals+that+NCAM+and+FGF2+elicit+different+assembly+and+dynamics+of+FGFR1+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells.</a> Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).</li>
<li>Hassler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+correlation+spectroscopy+%28TIR-FCS%29+with+low+background+and+high+count-rate+per+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule.</a> Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).</li>
<li>Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fast+fluorescence+imaging+to+molecular+diffusion+law+on+live+cell+membranes+in+a+commercial+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51994(2014).</li>
<li>Beenken, A., Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FGF+family%3A+biology%2C+pathophysiology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The FGF family: biology, pathophysiology and therapy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).</li>
<li>Joubert, J., Sharma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+digital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Light microscopy digital imaging.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2011).</li>
<li>Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIRF+microscopy+evanescent+field+calibration+using+tilted+fluorescent+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules.</a> Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).</li>
<li>Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+incidence+angle+for+through-the-objective+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007(2012).</li>
<li>Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+limits+and+data+correction+in+number+of+molecules+and+brightness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis.</a> Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).</li>
<li>Caiolfa, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomer-dimer+dynamics+and+distribution+of+GPI-anchored+uPAR+are+determined+by+cell+surface+protein+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies.</a> Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).</li>
<li>Campbell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).</li>
<li>Cutrale, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+enhanced+number+and+brightness+to+measure+protein+oligomerization+dynamics+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells.</a> Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).</li>
<li>Dunsing, V., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fluorescence+Fluctuation+Spectroscopy+Assay+of+Protein-Protein+Interactions+at+Cell-Cell+Contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

N & B vereist verschillende voorzorgsmaatregelen bij de keuze van het celmodel en de etiketterings strategie. Het kan alleen worden toegepast op levende cellen die stabiel blijven gehecht tijdens de opnametijd van de foto. Extra schommelingen als gevolg van de gehele cel rigide verplaatsing kunnen worden behandeld met de juiste beeld restauratie benaderingen38. Echter, in het algemeen wanneer een cel beweegt, de celmembraan ook vervormt, en structuur vervorming, produceren van grote extra varianti...

We beschrijven een totale interne reflectie fluorescentie-nummer en helderheid (TIRF-N & B) Imaging benadering voor het bepalen van de gemiddelde oligomere toestand van receptor moleculen op het plasma membraan van levende cellen, gericht op het koppelen van de receptor assemblage dynamiek aan de biologische functie van de eiwitten (Figuur 1).
Bij extracellulaire ligand binding initiëren receptoren de intracellulaire signaaltransductie afhankelijk van hun conformatie, oligomerisatie, potentiële co-receptoren en membraan samenstelling. Ondanks het belang en de alomtegenwoordigheid van de receptor oligomerisatie, herkend als een belangrijke gebeurtenis in cellulaire signalering1,2,3,4,5,6, 7, enkele methoden kunnen clustering gebeurtenissen detecteren en meten van de mate van clustering experimentaal8,9. Het confocale volume (x, y ≈ 300 nm, z ≈ 900 nm) is onvoldoende verdwenen voor het aantonen van moleculaire interactie en stoichiometrie, zelfs na optimalisatie door beeld restauratie algoritmen10. De samenstelling van de subeenheid van eiwit oligomeren kan niet op zuiver ruimtelijke basis worden opgelost, zelfs niet door super-resolutie methoden bij x, y-resolutie van 20-70 nm zoals PALM11, Storm12en STED13. Bovendien kan de tijdelijke resolutie (in de volgorde van minuten per afbeelding) kinetiek niet in het bereik van seconden volgen. Enkelvoudige molecuul stap-bleaching lost de stoichiometrie van eiwit oligomeren alleen op als ze immobiel zijn14.
Een van de meest veelzijdige methoden om dichtheid en oligomisatie van fluorescently gelabelde eiwitten binnen enkele afbeeldingen te meten, is de analyse van ruimtelijke intensiteits verdeling (SpIDA), die afhankelijk is van ruimtelijke bemonstering. Het is toepasbaar op zowel chemisch vaste als levende cellen, en maakt het mogelijk de analyse van verschillende gebieden van belang van de cel tegelijkertijd met behulp van standaard fluorescentiemicroscopie15. Als alternatief zijn moment methoden, zoals fluorescentie-correlatie spectroscopie (FCS)16, foton Counting histogram (PCH)17, en aantal en helderheid (N & B)18,19, geschikt voor kwantitatief oligomeren Metingen. Deze methoden analyseren de intensiteit van de fluorescentie schommelingen die in de tijd kunnen worden waargenomen wanneer de fluor Foren zich in en uit een verlichtings volume verspreiden. De amplitudes van de intensiteits schommelingen kunnen op unieke wijze worden beschreven door de moleculaire helderheid van de de (ε) en het gemiddelde aantal fluor Foren (n) binnen het verlichtings volume17 (Figuur 2). Normaalgesproken kan de diffusiecoëfficiënt van de fluor Foren en het gemiddelde aantal moleculen (omgekeerd gerelateerd aan de G (0)-waarde) binnen het verlichtings volume worden verkregen door FCS20. Aangezien de diffusie tijd echter alleen wordt geschaald met de kubieke wortel van de massa, is FCS niet voldoende gevoelig voor het detecteren van veranderingen in molecuulmassa21. In de praktijk, single Color FCS kan niet detecteren door dimerisatie van membraan receptoren. PCH lost mengsels van verschillende oligomeren nauwkeurig op. Met behulp van meer dan twee momenten van de amplitude-verdeling, detecteert het moleculen van verschillende helderheid die hetzelfde verlichtings volume innemen. Scanning FCS22 en ontwikkelingen, zoals de interessante pair-correlatie van moleculaire helderheid (pcomb) approach23, geïntroduceerd om het bereik van toepasbaarheid van fluorescentie correlatie methoden in biologische systemen uit te breiden24 , blijven methoden met één punt ontbreken van snelle metingen in een groot gebied van een cel, waarbij veel opeenvolgende waarnemingen bij elke pixel en het verzamelen van gegevens in de volgorde van seconden worden vereist.
N & B is een vereenvoudigde versie van PCH die alleen de eerste en tweede momenten van de amplitude van de fluorescentie verdeling beschouwt, namelijk de gemiddelde intensiteit, , en de variantie, σ2 (Figuur 2)18,19 en daarom kan het de molaire fractie van onbekende oligomeren in een mengsel niet bepalen, maar slechts schattingen van de gemiddelde oligomerisatie toestand van het mengsel. Niettemin heeft N & B het voordeel van het werken met relatief kleinere tijdreeksen beelden van levende cellen dan PCH per pixel, simpelweg door de schommelingen op de tijd van de intensiteit van de fluorescentie te bewaken. Omdat N & B de tijd per pixel tot een paar microseconden verlaagt, kan het snelle oligomerisatie kinetiek volgen op grote celgebieden, waardoor beeld verwerving op een tijdschaal van seconden in raster scanning microscopie (bijv. confocale, 2-photon) en milliseconden op camera gebaseerde microscopie (bijv. TIRFM).
Verschillende rapporten hebben aangetoond dat N & B het aantal subeenheden in eiwit clusters kwantificeren door uitgebreide celregio's. Paxillin-EGFP-clusters werden aangetroffen op de adhesieve plekken in de CHO-K1-cellen25, en de intracellulaire aggregatie van het pathogene Httex1p peptide werd beschreven in cos-7-cellen26. N & B werd toegepast voor het volgen van de ligand-gestuurde oligomisatie van de ErbB-receptor27, en het effect van de LIGAND FGF21 op Klothob (klb) en FGFR1c in HeLa-cellen28. De combinatie van tirf-beeldvorming en N & B-analyse werd gebruikt om aan te tonen dat dynamin-2 voornamelijk tetramere is in het gehele celmembraan29. We hebben N & B toegepast op zowel raster scanning als tirf-beelden om ligand-gestuurde door dimerisatie van upar en FGFR1 celmembraan receptoren30,31te bewijzen.
Fluorescentie-correlatie methoden, zoals N & B, FCS en PCH, zijn gebaseerd op de gedachte dat in een open volume het bezettings getal van deeltjes een Poisson-verdeling volgt. Omdat alleen de fotonen die de fluoroforen uitzenden kunnen worden gedetecteerd, de gemiddelde waarde voor een gemeten fluorescentie intensiteit versus tijd in een pixel van het beeld, <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> </img>, is het product van het gemiddelde aantal fluor Foren in het verlichtings volume, n, en hun moleculaire helderheid, ε17:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq2.jpg">
waarbij ε wordt uitgedrukt als het aantal fotonen dat per tijdseenheid (conventioneel per seconde) per molecuul wordt uitgezonden wanneer het molecuul zich in het midden van het verlichtings volume bevindt.
Helderheid is een eigenschap van elke de in een bepaalde overname instellen, terwijl intensiteit de som is van alle bijdragen van alle fluor Foren. Bij biologische wedstrijden zal de helderheid toenemen met de toename van het aantal fluoroforen dat samen fluctueert, wat informatie geeft over de oligomerisatie toestand van het fluorescently-gelabelde eiwit. De fluctuatie amplituden op een bepaalde pixel wordt gemeten aan de variantie van het fluorescentie signaal, σ2:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq3.jpg">
Wanneer het gemiddelde van het kwadraat van de intensiteit <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq4.jpg"> </img>, en het kwadraat van het gemiddelde van de intensiteit <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq5.jpg"> </img>, worden berekend op basis van de individuele intensiteitswaarden in elke pixel van elk frame:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq6.jpg">
waarbij K het totale aantal frames in de tijdreeks is. Experimenteel is het noodzakelijk om voor de hele Afbeeldingsreeks de variantie te berekenen die de spreiding van de individuele intensiteitswaarden op elke pixel van één afbeelding rond de gemiddelde intensiteitswaarde beschrijft. De variantie omvat alle schommelingen van verschillende oorsprongen. Bij een eerste benadering kan de variantie als gevolg van de diffusisolerende deeltjes in het verlichtings volume σ20worden gescheiden van de variantie als gevolg van de detector schot ruis, σ2d. De twee varianties zijn onafhankelijk; Zo wordt de totale variantie gegeven door hun som:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq7.jpg">
De variantie, als gevolg van moleculaire schommelingen in en uit het detectie volume, is lineair afhankelijk van de moleculaire helderheid en intensiteit:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq8.jpg">
EQ. 6 opnieuw rangschikken volgens EQ. 1:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq9.jpg">
Volgens het typische concept in fluorescentie correlatie spectroscopie, stelt vergelijking 7 dat de variantie als gevolg van het aantal schommelingen afhangt van het kwadraat van de deeltjes helderheid.
Vervolgens is de variantie als gevolg van schommelingen in de detector een lineaire functie van de gedetecteerde intensiteit, onder de aanname dat de detector onder de verzadigings limiet19wordt bediend:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq10.jpg">
In het geval van foon tellings detectoren a= 1 en c= 0 is de variantie van de detector gelijk aan de gemiddelde intensiteit:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq11.jpg">
Om deze concepten op echte metingen in levende cellen toe te passen, definiëren Gratton en collega's18 de schijnbare helderheid, B, voor elke pixel als de verhouding van de variantie over de gemiddelde intensiteit:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq12a.jpg">
B is de parameter die experimenteel wordt gemeten. In dit werk, time series beelden van FGFR1 receptoren op het plasma membraan van HeLa cellen worden gevangen door TIRF microscopie en de gemiddelde schijnbare helderheid, B, wordt bepaald door de N & B analyse. Vervolgens, na toevoeging van FGF2, opeenvolgende tijdreeksen worden gevangen om de veranderingen in de zelf-assemblage van de receptor moleculen in het membraanoppervlak na stimulatie van de receptor met de canonieke ligand te volgen.
Aangezien de detector van de TIRF-Microscoop echter een EMCCD-camera is, moet de uitdrukking voor de schijnbare helderheid worden gewijzigd als19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq13a.jpg">
waarbij Offset de intensiteit offset is van de detectie-elektronica die kenmerkend is voor de detector instellingen. De variantie en gemiddelde intensiteit voor een analoge detector worden respectievelijk gegeven door:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq14a.jpg">
waarbij G de analoge winst in digitale niveaus (DL/fotonen), S, de digitale niveaus per foton19, wordt gegeven door de helling van een intensiteit versus variantie plot voor een lichtbron met constante intensiteit (geen tijdelijke schommelingen). De γ-factor is gerelateerd aan de vorm van het pixel detectie volume. Volgens Hassler et al.32is de γ-factor gelijk aan 0,3 voor tirf-beeldvorming die werkt op de maximale Gain van de detectie camera19. De parameters offset, S en G zijn kenmerken van de camera en de Microscoop. De schijnbare helderheid, B, wordt verkregen door het herschikken van EQ. 11 volgens EQ. 12 en 13:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq15.jpg">
Experimenteel is ε een complexe functie van laserintensiteit en de detectie-efficiëntie van het systeem. Niettemin, aangezien B/S lineair afhankelijk is van ε, is het alleen belangrijk om de relatieve waarde van ε te bepalen voor een bepaalde detectiemodus:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq16.jpg">
waar ε ' evenredig is aan ε. Toch wordt een kalibratie uitgevoerd met een interne referentie.

<table><tbody><tr><td>3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC geïnverteerd microscoop, met smi-automatische TIRF-uitlijning. Het microscoop wordt geleverd met een 488 nm diodelaser, een 100x 1.46 olie TIRF objectief, Ex/Em Bandpass filters op 490/20 en 525/50, temperatuur/CO2 incubator en Andor DU 8285 VP EMCCD camera. Het microscoop wordt bediend door Leica LIF software.</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine uit bovien serum 98% minimum</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM zonder Fenol Rood met 25 mM HEPES</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>21063029</td><td>Gebruikt serum vrij voor microscopie</td></tr><tr><td>DMEM hoge glucose GlutaMAX I</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>10566-016</td><td>Gebruikt voor compleet medium</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td><td>Biowest, Nuaillé, Frankrijk</td><td>X0515-500</td><td></td></tr><tr><td>Emissie splitsingssysteem Photometrics DV2</td><td>TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum, gekwalificeerd, Brazilië</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>10270106</td><td>10% geïnactiveerd supplement voor compleet medium</td></tr><tr><td>Glasbodem 35 mm steriele 1.5 schalen</td><td>MatTek, Ashland, MA, USA</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>ongecoat, glas dikte 0.17 microns</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human cervix carcinoom (HeLa), serum-vrij dierlijk component (AC) cellen</td><td>Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Duitsland</td><td>CB_08011102</td><td></td></tr><tr><td>iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera bestuurd door ANDOR Solis software</td><td>Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK</td><td></td><td>Deze camera, geïnstalleerd in een extra poort van het microscoop, wordt gebruikt voor het verwerven van de N&amp;B tijd reeksen</td></tr><tr><td>Matlab Uitvoerbaar N&amp;B routine</td><td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spanje</td><td></td><td>downloaden op https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia</td></tr><tr><td>MatLab v.2018b</td><td>The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA</td><td></td><td><a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">https://www.mathworks.com/products/matlab.html</a></td></tr><tr><td>Penicilline:Streptomycine voor weefselcultuur 100x</td><td>Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA</td><td>LONZA 17-602E</td><td>supplement voor medium bij Penicilline/Streptomycine 100 U/100&micro;g.</td></tr><tr><td>pN1-mEGFP-FGFR1 expressievector</td><td>Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milaan, Italië</td><td></td><td>Zamai et al., 2019</td></tr><tr><td>pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expressievector</td><td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spanje</td><td></td><td>Hellriegel et al., 2011</td></tr><tr><td>pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expressievector</td><td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spanje</td><td></td><td>Hellriegel et al., 2011</td></tr><tr><td>Recombinant FGF2</td><td>PeproTech EC, Ltd., Londen, UK</td><td></td><td>Ligand oplossing: 20 ng/mL van FGF2 in PBS aangevuld met 0.01%BSA.</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat GIBCO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td>1 mM supplement voor medium</td></tr><tr><td>TransIt-LT1 Transfectie Reagens</td><td>MirusBio LLC, Madison, WI, USA</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0.25%), fenol rood</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Type F Immersie vloeistof 10 mL</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland</td><td>11513 859</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure BSA (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2618</td><td>0.1% supplement voor medium zonder fenol rood gebruikt voor transfecties</td></tr></tbody></table>

oligomerisatie dynamiek van celoppervlak receptoren in levende cellen door totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie gecombineerd met cijfer-en helderheids analyse

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Ondanks het belang en de alomtegenwoordigheid van de receptor oligomisatie, zijn enkele methoden van toepassing voor het detecteren van clustering gebeurtenissen en het meten van de mate van clustering. Hier beschrijven we een beeldvormings benadering om de gemiddelde oligomere toestand van mEGFP-Tagged-receptor-homo complexen in het membraan van levende cellen te bepalen. Het protocol is gebaseerd op de totale inwendige reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie gecombineerd met getal en helderheid (N & B) analyse. N & B is een methode die vergelijkbaar is met fluorescentie-correlatie spectroscopie (FCS) en foton Counting histogram (PCH), die gebaseerd zijn op de statistische analyse van de schommelingen van de fluorescentie intensiteit van fluoroforen die in en uit een verlichtings volume tijdens een observatietijd. In het bijzonder is N & B een vereenvoudiging van PCH om informatie te verkrijgen over het gemiddelde aantal eiwitten in oligomere mengsels. De intensiteit fluctuatie amplitudes worden beschreven door de moleculaire helderheid van de de en het gemiddelde aantal fluor Foren binnen het verlichtings volume. Zo beschouwt N & B alleen de eerste en tweede momenten van de amplitude verdeling, namelijk de gemiddelde intensiteit en de variantie. Dit is tegelijkertijd de sterkte en de zwakte van de methode. Omdat slechts twee momenten worden overwogen, kan N & B de molaire fractie van onbekende oligomeren in een mengsel niet bepalen, maar het schat alleen de gemiddelde oligomerisatie toestand van het mengsel. Niettemin kan het worden toegepast op relatief kleine tijdreeksen (vergeleken met andere moment methoden) van beelden van levende cellen op pixel-voor-pixel basis, simpelweg door de tijds schommelingen van de intensiteit van de fluorescentie te bewaken. Het vermindert de effectieve tijd per pixel tot een paar microseconden, waardoor acquisitie in het tijdsbereik van seconden tot milliseconden, die nodig is voor snelle oligomerisatie kinetiek. Ten slotte kunnen grote celgebieden en sub-cellulaire compartimenten worden verkend.

De resultaten voor twee representatieve HeLa-mEGFP-FGFR1 cellen die in hetzelfde cultuur gerecht zijn geseelde, worden weergegeven in Figuur 5 en aanvullende tabel 1. De twee cellen werden gevangen op tijd 0 min (Figuur 5a, boven) en 7 min (Figuur 5a, onder) na toevoeging van de FGF2 ligand.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

We beschrijven een beeldvormings aanpak voor de bepaling van de gemiddelde oligomere toestand van mEGFP-Tagged-receptor oligomeren geïnduceerd door ligand binding in het plasma membraan van levende cellen. Het protocol is gebaseerd op de totale inwendige reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie gecombineerd met getal en helderheid (N & B) analyse.

Oligomerisatie dynamiek van celoppervlak receptoren in levende cellen door totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie gecombineerd met cijfer-en helderheids analyse

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Receptor clustering is alomtegenwoordig en vaak noodzakelijk voor het signaleren van een cascade activering. Er zijn echter weinig methoden beschikbaar om de mate van clustering te meten. We gebruiken totale interne reflectiefluorescentie, TIRF-microscopie, om de verspreiding van FGFR1-mEGFP-moleculen in het plasmamembraan van levende cellen te volgen.Vervolgens passen we getalhelderheid, de N&B-analyse, toe om de dynamiek van gestimuleerde receptorclustering te beschrijven. TIRF is ideaal voor snelle temporele beeldvorming van moleculaire gebeurtenissen die zich in de buurt van het celoppervlak voordoen, terwijl N&B de gemiddelde oligomerische toestand van fluorescerende moleculen bepaalt op basis van waar diffusie in en uit het verlichtingsvolume van de microscoop. Inderdaad, dit is een hulpmiddel om de ruimtelijke temporele organisatie van de receptoren aan het celoppervlak waar ze signaleren te verbinden.N&B heeft alleen toegang nodig tot een microscoop met een snelle acquisitiemodule. U analyseren groot gebied van levende cellen met alleen de basiskennis van fluorescentie fluctuatie methoden. Deze methode kan worden toegepast op eiwitten die dimers of clusters vormen en kan stoichiometrisch worden gelabeld met de fluorescerende kleurstof.Als de eiwitten zich in intracellulaire compartimenten bevinden, worden andere soorten microscopen gebruikt voor het verkrijgen van de beelden. Het is belangrijk om een constructie voor te bereiden die de monomerische vorm van de fluorofoof uitdrukt voor het meten onder experimentele omstandigheden van de zuivere monomeerhelderheid als een controle. Op de eerste dag, zaad HeLa cellen in 1,5 milliliter van het volledige medium bij een concentratie van 100, 000 tot 200, 000 cellen per milliliter in glazen bodem schotels.Zaad zes tot acht repliceren gerechten, en incubeer in een couveuse op 37 graden Celsius. Op de tweede of derde dag hebben cellen subconfluency bereikt. Voeg serumvrij medium met eiwitplasmid toe aan de helft van de gerechten en voeg referentieplasmiden met de monomeer en dimer toe aan de tweede helft van de gerechten om de cellen te transfecteren.Controleer na één dag of de doorgelichte cellen aan de onderkant van de schotels worden bevestigd en het celmembraan fluorescerend is. Gooi gerechten weg met overwoekerde cellen of met een zeer lage fluorescentie. Vier uur voor het experiment, activeer de temperatuur incubator van de microscoop op 37 graden Celsius.Zet de microscoop, computers en camera's aan en wacht tot de camera's de juiste werktemperatuur van min 75 graden Celsius hebben bereikt. Plaats een kleine druppel olie op de objectieflens. Doe een monsterschotel in de couveuse van de microscoop en sluit de deuren van de couveuse om de temperatuur van de schotel gedurende 10 minuten te laten equiliberen.Zet de epifluorescentielamp en de 488 nanometerlaser aan. Selecteer de contrastmodus voor epifluorescentie om het monster te verkennen en zoek in een cel om zich te concentreren vanuit de ooglens. Selecteer het juiste filter voor het verzamelen van de groene emissie door de microscoopcamera met bandpass Ex 490/20 500 en bandpass Em 525/50 of iets dergelijks.Schakel over van de oculaire naar het nokkenrapport in de epifluorescentiemodus. Verfijn de focus en verander naar de TIRF-modus. Activeer vervolgens de automatische uitlijning volgens de instructies van de TIRF-microscoop.Kies een geschikte verlichtingsdiepte en optimaliseer de richting van het evanescente veld. Schakel over naar een tweede camera. Definieer een gebied van belang van ten minste 256 bij 256 pixels.Stel de belichting in op één milliseconde en de EM-versterking op 1.000. Pas het laservermogen aan op 0,5 milliwatt. Het is noodzakelijk om enige informatie te hebben over de diffusiecoëfficiënt van het eiwit, omdat de blootstellingstijd korter moet zijn dan de gemiddelde tijd die de fluorescerende moleculen in het lumineerde volume doorbrengen.Voer een eerste proefreeks uit onder initiële omstandigheden en schat ruwweg de signaal-ruiswaarde. De omstandigheden zijn aanvaardbaar bij signaal-naar-ruis gelijk aan twee tot drie of hoger, zoals gemeten in de eerste tijdreeks. Gebruik vervolgens de schuifregelaar van het emissiesplitsende systeem dat camera nummer twee verbindt met de microscoop voor het maskeren van een kant van het beeld.Selecteer de optie Automatisch opslaan van het camerabestand. Start de aankoop van de beeldreeks voor minimaal 700 frames bij een minimale signaal-ruisverhouding van twee. Zonder het nemen van de schotel uit de microscoop, voeg de ligand.Selecteer een cel met een helder fluorescentiemembraan en begin snel met de eerste reeks van de kinetische run. Zoek een tweede cel en verwerf het tweede tijdspunt van de kinetiek. Leg een nieuwe cel vast voor elk tijdstip van de kinetische run.Herhaal voor elk nieuw gerecht de uitlijning van de laserlijn en optimalisatie van de TIRF-verlichting. Converteer en sla nu de beeldbestanden die met de camerasoftware zijn aangeschaft, om als tif-bestanden. Importeer tif-bestanden in de analysesoftwareroutine door het N&B grafische gebruikersinterfase MATLAB te activeren.Verwijderreeksen waarvoor het gemiddelde intensiteitsprofiel meer dan 10% fotobleaching en reeksen toont waarin er een duidelijke celmembraanvervorming of vertaling tijdens aanwinst is geweest. Frames bijsnijden die duidelijk onscherp zijn. Bewaar voor de analyse alleen serie met ten minste 500 tijdsbestek.Bepaal eerst de cameraparameters. Activeer de routine kalibreren camera. Selecteer een gebied van ten minste 20 bij 50 pixels in het gebied met detectorlawaai.Verplaats in de logfrequentie versus het digitale niveau plot de lineaire rode cursor om de Gaussian af te bakenen in het lineaire deel van de curve. Activeer de B-toets. Pas een minimum binning van 2.2 toe om de verspreiding van de gegevens te verminderen en het B-I histogram te genereren.Gebruik de iteratieve vierkante cursor om het B-I histogram te inspecteren. Selecteer een vierkante ROI voor de analyse en genereer de B-kaart van de geselecteerde ROI. Sla vervolgens het ASCII-bestand op van de B-waarden die aan de selectie zijn gekoppeld.Importeer de ASCII in een grafische software om de frequentieverdeling van de gegevens te berekenen en de gemiddelde B-waarde plus of min S.E.Apply the epsilon equation to derive the average brightness for each cell at each time point of the kinetic run. Normaliseer de gegevens volgens de normalisatievergelijking, waarbij B't de gemiddelde B-waarde is gemeten op tijd t na ligand toevoeging en B'0 is de gemiddelde B-waarde gemeten op het moment dat t gelijk is aan nul, wat 10 tot 20 seconden is na ligand additino. Plot de genormaliseerde gemiddelde helderheid versus acquisitietijd om de kinetische run op te bouwen.In deze studie worden representatieve resultaten van twee HeLa-cellen in hetzelfde gerecht die mEGFP-FGR1 uitdrukken die op tijd nul zijn vastgelegd en zeven, na toevoeging van 20 nanogram per milliliter FGF2, hier getoond. Vergeleken met de referentieconstructies, GPI-mEGFP en GPI-mEGFP-mEGFP dimer, toont de gehele analysesequentie de gemiddelde intensiteit van de tijdreeks. Plot van alle B-waarden.B-I histogram. B-kaart van de gekozen ROI. En de bijbehorende B-verdeling histogram.Na stimulatie met 20 nanogram per milliliter FGF2, representatieve kinetische runs met de gemiddelde helderheid als functie van de tijd beschrijft het langzame proces van dimerisatie die gedurende enkele minuten aanhoudt op het celoppervlak. Wanneer gestimuleerd met 50 microgram per milliliter van NCAM-Fc, het kinetische profiel onthult snelle en cyclische overgangen van de receptor in oligomerische mengsels, die ook bereikt helderheid waarden boven die van de dimer. Een genormaliseerde gemiddelde waarde van drie wordt herhaaldelijk waargenomen.Het is belangrijk om de extra varianten te minimaliseren als gevolg van geen moleculaire schommelingen en bleken. En cellen moeten goed worden nageleefd aan de glazen bodem schotel, niet overwoekerd, en niet opgestapeld. Als we geïnteresseerd zijn in een eiwit dat zich sneller verspreidt in intracellulaire compartimenten, kunnen we sneller nul keer toepassen en scannen op focale of multifoton microscopen gebruiken op beeld in de cel.Met onze aanpak minimaliseren we de schadelijke effecten van fotobleaching wanneer we de dynamiek van gebeurtenissen zoals dimerization willen verkennen. Deze gebeurtenissen beheersen een verscheidenheid aan cellulaire reacties en zijn zeer moeilijk te bewijzen in levende cellen met andere technieken.

oligomerization-dynamics-cell-surface-receptors-living-cells-total

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.

Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie is een krachtige aanpak van de structuren te observeren in de buurt van het celoppervlak bij hoge contrast en temporele resolutie. We laten zien hoe TIRF kan worden gebruikt om eiwitten dynamiek te studeren aan de cortex van de celwand-ingesloten bacteriën en schimmels cellen.

Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Source: Winkle, C. C., et al. Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for visualizing exocytic events in cortical neurons. A pH-sensitive green fluorescent protein (GFP) marker fluoresces upon vesicle fusion, with selective TIRF excitation capturing membrane-proximal exocytosis in time-lapse imaging.

Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Visualization of Exocytic Events 

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Ruimtelijke verdeling en temporele dynamica van plasmamembraaneiwitten en lipiden is een populair onderwerp in de biologie. Hier wordt dit probleem aangepakt door een ruimte-tijdelijke beeldfluctuatieanalyse die conceptueel dezelfde fysische grootheden levert als enkeldeeltjevolgen, maar gebruik maakt van kleine moleculaire labels en standaard microscoopopstellingen.

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

Antilichamen die zich aan target receptoren van het celoppervlak binden kunnen verlenen bevleesdheid en clustering wijzigingen. Deze dynamische veranderingen hebben gevolgen voor het karakteriseren van Geneesmiddelenontwikkeling in de doelcellen. Dit protocol maakt gebruik van de confocal microscopie en afbeelding correlatie spectroscopie via ImageJ/FIJI te kwantificeren van de omvang van de receptor clustering op het celoppervlak.

Confocale microscopie onthult cel oppervlakte Receptor aggregatie via afbeelding correlatie spectroscopie

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Hier presenteren we een protocol voor één deeltje beeldanalyse waarmee kwantitatieve evaluatie van diffusie coëfficiënten, soorten van beweging en cluster grootte van enkele deeltjes ontdekt door fluorescentie microscopie bijhouden.

Beeldverwerking Protocol voor de analyse van de verspreiding en de clustergrootte van membraan receptoren door fluorescentie microscopie

Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie resonantie energie transfer (smFRET) experimenten op G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) met behulp van site-specifieke etikettering via onnatuurlijke aminozuur (OCG) incorporatie. Het protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor smFRET-monstervoorbereiding, experimenten en gegevensanalyse.

Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET

Leer oligomerisatie van celoppervlakreceptoren analyseren met TIRF-microscopie en N&B-analyse in levende HeLa-cellen. Deze methode maakt real-time observatie van receptorclustering en signaaltransductie mogelijk.

Oligomerisatie dynamiek van celoppervlak receptoren in levende cellen door totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie gecombineerd met cijfer-en helderheids analyse (Video) | JoVE Journal

Oligomerisatie dynamiek van celoppervlak receptoren in levende cellen door totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie gecombineerd met cijfer-en helderheids analyse

Meer video's verkennen