Lab-op-een-CD-platform voor het genereren van multicellulaire driedimensionale Spheroids

Deze techniek kan worden gebruikt om celsferoïden te genereren van individuele en meerdere celtypen met behulp van een lab-on-a-CD-platform, een baanbrekend systeem voor de snelle generatie sferoïden. De techniek maakt gebruik van centrifugale kracht om cellen te deponeren in aangewezen microwells, waardoor de sequentiële opgetogenheid van meerdere celtypen voor de productie van diverse sferoïden. Voor CMS cultuur chip fabricage, eerst polycarbonaat mallen voor de bovenste en onderste lagen van de cultuur chip door computer numerieke controle bewerking.

Volgende mix PDMS base en PDMS uithardingsmiddel op een 10 tot 1 verhouding gedurende vijf minuten voor het plaatsen van het mengsel in een desiccator voor een uur om luchtbellen te verwijderen. Giet de ontgast PDMS mengsel in de CMS cultuur chip mallen, en plaats de mallen in de desiccator voor een uur om eventuele luchtbellen te verwijderen. Aan het einde van de tweede ontgassing, moet u het mengsel in een warmtekamer van 80 graden Celsius gedurende twee uur vergen voordat u de spanen in een gestofzuigd plasmareiniger plaatst met de oppervlakken die naar boven moeten worden gebonden.

Stel de kweekchips gedurende 30 seconden bloot aan met luchtondersteunde plasma bij een vermogen van 18 watt en bind de twee lagen van de chip in de warmtekamer gedurende 30 minuten vast aan 80 graden Celsius om de hechtingssterkte te verhogen. Steriliseer vervolgens de CMS-kweekchip in een autoclave bij 121 graden Celsius gedurende 15 minuten. Om de cellen voor te bereiden op sferoïde vorming, ontdooi een een-milliliter flacon met vijf tot 10 keer 10 tot de vijf cellen van belang in een 36,5 graden Celsius waterbad gedurende twee minuten alvorens een milliliter DMEM aan de cellen met zachte menging.

Voeg vervolgens de cellen toe aan een petrischaal met een diameter van 150 millimeter met 15 milliliter 36,5 graden Celsius en plaats het gerecht 24 uur in een couveuse van de celkweek. De volgende dag, vervang de supernatant met 15 milliliter verse DMEM, en breng de cellen terug naar de incubator. Om de cellen los te maken, maak de cultuur met vier milliliter trypsine gedurende vier minuten bij 36,5 graden Celsius en 5% kooldioxide, waardoor de reactie stopt met vers medium wanneer de cellen van de bodem van de schotel zijn opgetild.

Om de cellen te labelen, verwarm een geschikte celfluorescentiekleurstof op kamertemperatuur voordat u 20 microliters van watervrije dimethylsulfoxide aan de flacon toevoegt om een oplossing van één millimolar te verkrijgen. Verdun de fluorescentie tot een uiteindelijke werkconcentratie van één micromolar in DMEM en voeg de kleurstof toe aan de celsusopening van belang met zachte menging. Plaats vervolgens de cellen in de celcultuur incubator voor 20 minuten.

Voor monocultuur sferoïde vorming, eerst 2,5 milliliter van 4%Pluronic F-127 oplossing toe te voegen aan het inlaatgat van de CMS cultuur chip tijdens het draaien van de chip op 500 tot 1,000 rotaties per minuut. Wanneer alle oplossing is toegevoegd, draait u de chip drie minuten lang drie minuten op 4.000 rotaties per minuut met behulp van het CMS-systeem. Aan het einde van de rotatie, incubeer de cultuur chip 's nachts op 36,5 graden Celsius op 5%kooldioxide.

De volgende ochtend, verwijder de Pluronic oplossing, en was de cultuur chip met DMEM. Na het drogen van de chip gedurende 12 uur op een schone bank, voeg 2,5 milliliter van het medium aan de inlaatpoort, en draai de chip op 4,000 rotaties per minuut gedurende drie minuten. Vervang aan het einde van de rotatie 100 microliter van het medium in de inlaatpoort door 100 microliter van de voorbereide celsuspensie, terwijl de chip draait bij 500 tot 1.000 rotaties per minuut.

Draai vervolgens de chip op 3.000 rotaties per minuut gedurende drie minuten om de cellen in elke microwell te vangen door centrifugale kracht voordat u de chip drie dagen in de celkweek incubator plaatst, waardoor het medium wordt vernieuwd zoals elke dag wordt aangetoond. Voor de generatie van concentrische sferoïde cocultuur, voeg de eerste populatie van cellen in 100 microliter van medium aan de inlaatpoort van de chip, terwijl de chip draait op 500 tot 1, 000 rotaties per minuut, gevolgd door drie minuten rotatie bij 3,000 rotaties per minuut. Voeg aan het einde van de rotatie 100 microliter van de tweede celpopulatie toe terwijl de chip draait op 500 tot 1.000 rotaties per minuut en draai de chip nog drie minuten op 3.000 rotaties per minuut.

Wanneer beide volumes van cellen zijn geïnjecteerd, plaats de chip in de celcultuur incubator op 1,000 tot 2,000 rotaties per minuut gedurende 24 uur. Voor de Janus sferoïde formatie, voeg 100 microliter van de eerste populatie van cellen, terwijl de chip draait op 500 tot 1,000 rotaties per minuut, gevolgd door drie minuten op 3,000 rotaties per minuut. Plaats aan het einde van de rotatie de chip in de celkweek incubator voor rotatie op 1.000 tot 2.000 rotaties per minuut gedurende drie uur.

Voeg aan het einde van de incubatie 100 microliters van de tweede populatie cellen toe, terwijl de chip drie minuten lang draait op 500 tot 1.000 rotaties per minuut voordat de chip draait bij 3.000 rotaties per minuut gedurende drie minuten. Plaats vervolgens de cellen in de celkweek incubator op 1.000 tot 2.000 rotaties per minuut gedurende 24 uur. Voor sandwich sferoïde vorming, voeg eerst 100 microliter van de eerste cel populatie, terwijl de chip draait op 500 tot 1,000 rotaties per minuut, gevolgd door drie minuten rotatie bij 3, 000 rotaties per minuut.

Plaats aan het einde van de rotatie de chip twee uur lang op een rotator in de celkweek incubator bij 1.000 tot 2.000 rotaties per minuut voordat u 100 microliter van de tweede populatie cellen toevoegt, terwijl de chip draait op 500 tot 1.000 rotaties per minuut. Draai de chip drie minuten lang op 3,000 RPM en plaats de chip terug in de couveuse voor een incubatie van drie uur met rotatie. Voeg vervolgens nog eens 100 microliter van de eerste celpopulatie toe, terwijl de chip draait op 500 tot 1.000 rotaties per minuut, en draai en kweek de cellen zoals net aangetoond gedurende 12 uur.

Volgens het protocol zoals aangetoond, kan een CMS-kweekchip met een diameter van zes centimeter met succes worden vervaardigd. Het kanaal van de CMS-cultuurchip bestaat uit een inlaatpoort en centrale, dia- en microwell-regio's. Time-lapse beelden van twee soorten celkweek genomen bij 2.000 rotaties per minuut voor de eerste 24 uur van de cultuur binnen individuele CMS-chips, zoals aangetoond, tonen de succesvolle vorming van sferoïden.

Beeldvorming van de microwells na drie dagen van cultuur blijkt dat de sferoïden tonen een uitstekende uniformiteit en sfericiteit. Gecocultuur sferoïden met conentric, Janus, en sandwich structuren kunnen ook worden gegenereerd. Bovendien, celculturen blootgesteld aan hoge zwaartekracht voor zeven dagen, gevolgd door levende / dode vlekken, tonen aan dat de meeste cellen overleven op lange termijn cultuur binnen de chips.

De bovenste en onderste lagen van de CMS-kweekchip moeten zorgvuldig worden uitgelijnd wanneer ze zijn gebonden, anders is het aantal cellen in elke microwell mogelijk niet gelijk. Deze studie kan de toegangsdrempel voor cocultuur sferoïde onderzoek verlagen en kan op grote schaal worden gebruikt in cocultuurstudies, bijvoorbeeld voor het screenen van nieuwe geneesmiddelen van belang.