Name: Lab-op-een-CD-platform voor het genereren van multicellulaire driedimensionale Spheroids (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Leer het genereren van multicellulaire 3D-spheroiden met een lab-op-een-CD-platform. Deze methode gebruikt centrifugale kracht voor efficiënte celdepositie in microwells en ondersteunt diverse cocultuurtoepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door het basis wetenschaps onderzoeksprogramma (2016R1D1A1B03934418) en het bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) van het NRK, en gefinancierd door de Koreaanse overheid, MSIT.

1. centrifugale microfluidic-gebaseerde spheroid (CMS) cultuur chip fabricage
<ol><li>Maak PC-mallen voor de bovenste en onderste lagen van de CMS-kweek chip door CNC-bewerking. Gedetailleerde afmetingen van de chip worden gegeven in Figuur 1.</li>
	<li>Meng PDMS base en PDMS Uithardings middel in een verhouding van 10:1 (w/w) gedurende 5 min en plaats in een exsiccator voor 1 uur om luchtbellen te verwijderen.</li>
	<li>Na het gieten van het PDMS mengsel in de mallen van de CMS cultuur chip, verwijder luchtbellen voor 1 h meer en genezen in een warmte kamer bij 80 ° c voor 2 h.</li>
	<li>Plaats ze in de gestofzuigd plasma reiniger met de te verlijmen oppervlakken en stel ze bloot aan luchtgeassisteerd plasma met een vermogen van 18 W gedurende 30 sec.</li>
	<li>Bind de twee lagen van de CMS cultuur chip en plaats deze in de warmte kamer bij 80 °C gedurende 30 minuten om de adhesie sterkte te verhogen.</li>
	<li>Steriliseer de CMS Culture chip in een autoclaaf sterilisator bij 121 °C en 15 psi.</li>
</ol>2. voorbereiding van de cel
<ol><li>Ontdooit de 1 mL injectieflacon met 5 × 105– 1 × 106 HASCS-of MRC-5s-cellen in een waterbad van 36,5 °c gedurende 2 minuten.</li>
	<li>Voeg 1 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) toe aan een injectieflacon en meng zachtjes met een pipet van 1.000 μL.</li>
	<li>Zet 15 mL van de DMEM voorverwarmd tot 36,5 °C in een Petri schaaltje van 150 mm diameter met behulp van een pipet en voeg de cellen uit de injectieflacon toe.</li>
	<li>Na 1 dag, aspireren de DMEM en vervangen door 15 mL verse DMEM. Verander vervolgens de media elke 2 of 3 dagen.</li>
	<li>Om de cellen los te maken van de petrischaal, Voeg 4 mL trypsine toe aan de petrischaaltjes en plaats ze in een incubator bij 36,5 °C en 5% CO2 gedurende 4 min.</li>
</ol>3. monocultuur-spheroid-vorming
<ol><li>Zet 2,5 mL van 4% (w/v) pluronic F-127-oplossing in het inlaat gat van de CMS-kweek chip (Figuur 2a) terwijl u de chip draait met 500 – 1000 rpm en draai vervolgens de chip bij 4.000 rpm gedurende 3 minuten met behulp van het CMS-systeem (Figuur 2b). Opmerking: de pluronic coating voorkomt celbevestiging aan de inlaatpoort terwijl de chip draait. Zorg ervoor dat er geen lucht in de micro putjes zit.</li>
	<li>Incuberen de CMS cultuur chip gevuld met pluronische oplossing 's nachts bij 36,5 °C in 5% CO2.</li>
	<li>Verwijder de pluronische oplossing, spoel de resterende pluronische oplossing met DMEM uit en droog de chip voor 12 uur op een schone Bank.</li>
	<li>Voeg 2,5 mL DMEM toe aan de CMS Culture chip en draai de chip bij ~ 4.000 rpm gedurende 3 min voor het voorbevochtigen van de binnenkant van de chip.</li>
	<li>Stop de rotatie en trek 100 μL van de DMEM uit om ruimte te maken voor het injecteren van de celsuspensie.</li>
	<li>Voeg 100 μL celsuspensies toe die 5 × 105 hascs of 8 × 105 MRC-5s bevatten door Pipetteer de cellen gelijkmatig te verdelen door Pipetteer 3 – 5x voor resuspensie.</li>
	<li>Draai de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 minuten om de cellen in elke titer te overvullen met een centrifugale kracht. Opmerking: overmatige rotatiesnelheid kan leiden tot het ontsnappen van de cel door de oplossing uitwerpen gaten.</li>
	<li>Kweek de cellen gedurende 3 dagen in de incubator bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid en 5% CO2, draaibaar bij 1000 – 2000 rpm. Verander elke dag het kweekmedium.</li>
</ol>4. cocultuurspheroid-vorming
<ol><li>
Concentrische sferoïden-vorming
	<ol>
<li>Voeg de eerste cellen, 2,5 × 105 hascs, en draai de chip op 3.000 rpm. Na 3 min, voeg de tweede cellen, 4 × 105 MRC-5S, en draai de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min. Injecteer een totaal van 100 μL celsuspensies door pipetteren. Wanneer de cellen worden geïnjecteerd, verschuift u de rotatiesnelheid naar 500-1000 rpm.</li>
		<li>Kweek de cellen in de incubator bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid% en 5% CO2 door te roteren op 1000 – 2000 rpm. De concentrische sferoïden worden binnen 24 uur aangemaakt. Voor lange termijn cultuur, verander het cultuurmedium elke dag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Janus spheroid-formatie
	<ol>
<li>Voeg 100 μL celsuspensies met de eerste cellen, 2,5 × 105 hascs, toe door pipetteren terwijl de chip op 500 – 1.000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.</li>
		<li>Inincuberen van de chip bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid en 5% CO2 door te roteren bij 1000 – 2000 rpm gedurende 3 uur.</li>
		<li>Voeg 100 μL celsuspensies met de tweede reeks cellen, 4 × 105 MRC-5S, toe door pipetteren terwijl de chip met 500 – 1000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.</li>
		<li>Kweek de cellen in de incubator bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid en 5% CO2 door te roteren op 1000 – 2000 rpm. De Janus sferoïden worden binnen 24 uur gecreëerd. Voor lange termijn cultuur, verander het cultuurmedium elke dag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sandwich-spheroid-vorming
	<ol>
<li>Voeg 100 μL celsuspensies met de eerste cellen, 1,5 × 105 hascs, toe door pipetteren terwijl de chip op 500 – 1.000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.</li>
		<li>Inincuberen van de chip bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid en 5% CO2 door te roteren bij 1000 – 2000 rpm gedurende 3 uur.</li>
		<li>Voeg 100 μL celsuspensies met de tweede cellen, 3 × 105 MRC-5S, toe door pipetteren terwijl de chip met een snelheid van 500 – 1.000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.</li>
		<li>Inincuberen van de chip bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid%, en 5% CO2 door te roteren bij 1000 – 2000 rpm gedurende 3 uur.</li>
		<li>Voeg 100 μL celsuspensies met de derde cellen, 1,5 × 105 hascs, toe door pipetteren terwijl de chip met een snelheid van 500 – 1.000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.</li>
		<li>Kweek de cellen in de incubator bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid% en 5% CO2 door te roteren op 1000 – 2000 rpm. De sandwich sferoïden worden binnen 12 uur aangemaakt. Voor lange termijn cultuur, verander het cultuurmedium elke dag.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. celkleuring
<ol><li>Verwarm de celfluorescentie kleurstof op kamertemperatuur (20 °C).</li>
	<li>Voeg 20 μL watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) per injectieflacon toe om een 1 mm oplossing te maken.</li>
	<li>Verdun de fluorescentie tot een uiteindelijke werkconcentratie van 1 μM met behulp van DMEM.</li>
	<li>Voeg de fluorescentie toe aan de celsuspensie en breng zachtjes door met een pipet.</li>
	<li>Inincuberen 20 min bij 36,5 °C, vochtigheid van > 95%, en 5% CO2.</li>
</ol>

<ol><li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems%3A+Advantages+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li>
<li>Tung, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+3D+spheroid+culture+and+drug+testing+using+a+384+hanging+drop+array%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array.</a> Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).</li>
<li>Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+in+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Spheroids in Cancer Research.</a> Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).</li>
<li>Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li>
<li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105(2014).</li>
<li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li>
<li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%2C+A%3A+Physical%22%5BJournal%5D)">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li>
<li>Park, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+centrifugal+microfluidic+device+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e1(2016).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li>
<li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li>
<li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li>
<li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li>
<li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het CMS is een gesloten systeem waarin alle geïnjecteerde cellen zonder verspilling de titer binnenkomen, wat het efficiënter en zuiniger maakt dan conventionele titer-based spheroid-generatie methoden. In het CMS-systeem wordt de media elke 12 – 24 h vervangen door een zuigopening die is ontworpen om de media in de chip te verwijderen (Figuur 3a). Tijdens het zuig proces van de media worden nauwelijks media uit de titer ontsnapt door de oppervlaktespanning tussen de media en de wand van de ...

Het is gemakkelijker om biologische in vivo micro-omgevingen te simuleren met driedimensionale (3D) spheroid-celcultuur dan met tweedimensionale (2D) celkweek (bijv. conventionele Petri schaalcelcultuur) om fysiologisch realistische experimentele resultaten1. Op dit moment beschikbare spheroid-vormings methoden omvatten de hangende druppel techniek2, vloeistofoverlay-techniek3, Carboxymethyl cellulose techniek4, op magnetische kracht gebaseerde microfluïdische techniek5, en het gebruik van bioreactoren6. Hoewel elke methode zijn eigen voordelen heeft, is verdere verbetering van de reproduceerbaarheid, productiviteit en het genereren van cocultuursspheroïden noodzakelijk. Bijvoorbeeld, terwijl de magnetische kracht gebaseerde microfluïdische techniek5 relatief goedkoop is, moeten de effecten van sterke magnetische velden op levende cellen zorgvuldig worden overwogen. De voordelen van spheroid-cultuur, met name in de studie van mesenchymale stamcel differentiatie en proliferatie, zijn gemeld in verschillende onderzoeken7,8,9.
Het centrifugale microfluïdische systeem, ook bekend als lab-on-a-CD (compact disc), is handig om de vloeistof binnen eenvoudig te regelen en de rotatie van het substraat te benutten en is dus gebruikt in biomedische toepassingen zoals immunoassays10, colorimetrische assays voor het opsporen van biochemische markers11, nucleïnezuur versterking (PCR) testen, geautomatiseerde bloedanalyse systemen12, en all-in-One centrifugale microfluïdische apparaten13. De drijvende kracht die de vloeistof bestuurt, is de centripetale kracht die wordt gecreëerd door rotatie. Bovendien kunnen meerdere functies van mengen, valving en monster splitsing eenvoudig worden gedaan in dit enkele CD-platform. In vergelijking met de bovengenoemde biochemische analysemethoden zijn er echter minder proeven uitgevoerd om cd-platforms toe te passen op kweekcellen, met name sferoïden14.
In deze studie tonen we de prestaties van het centrifugale microfluïdische spheroid-systeem (CMS) door monocultuur of cocultuur van stamcellen die afkomstig zijn van menselijke adipeus (hASC) en humane Long fibroblasten (MRC-5). Dit artikel beschrijft in detail de onderzoeksmethodologie van onze groep15. Zo kan het spheroid Culture lab-on-a-CD-platform eenvoudig worden gereproduceerd. Er wordt een CMS-genererend systeem gepresenteerd dat bestaat uit een CMS-kweek chip, een chip houder, een DC-motor, een motor bevestiging en een draaiend platform. De Motorsteun is 3D bedrukt met acrylonitril butadieen styreen (ABS). De chip houder en het roterende platform zijn CNC (computer numerieke besturing) bewerkt met de PC (polycarbonaat). De rotatiesnelheid van de motor wordt geregeld van 200 tot 4.500 rpm door het coderen van een PID (proportioneel-integraal-afgeleid) algoritme op basis van Pulsbreedtemodulatie. De afmetingen zijn 100 mm x 100 mm x 150 mm en het weegt 860 g, waardoor het gemakkelijk te hanteren is. Met behulp van het CMS-systeem kunnen sferoïden onder verschillende zwaartekracht condities worden gegenereerd van 1 x g tot 521 x g, zodat de studie van de promotie van celdifferentiatie onder hoge zwaartekracht kan worden uitgebreid van 2D-cellen16,17 naar 3D spheroid. Cocultuur van verschillende soorten cellen is ook een belangrijke technologie voor het effectief nabootsen van de in vivo omgeving18. Het CMS-systeem kan eenvoudig monocultuur-sferoïden genereren, evenals cocultuursspheroids van verschillende structuurtypen (bijv. concentrisch, Janus en sandwich). Het CMS-systeem kan niet alleen worden gebruikt in eenvoudige spheroid-studies, maar ook in 3D-organoïde-studies, om menselijke orgaan structuren te overwegen.

<table><tbody><tr><td>3D printer</td><td>Cubicon</td><td>3DP-210F</td><td></td></tr><tr><td>Adipose-derived mesenchymale stamcellen (hASC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-011</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum-Antimyoticum</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Bevat 1% van voltooid medium en buffer</td></tr><tr><td>CellTracker Groen CMFDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>CellTracker Rood CMTPX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34552</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Computer numeriek bestuurde (CNC) draaigraver</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>DC-motor</td><td>Nurielectricity Inc.</td><td>MB-4385E</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's gemodificeerd eaggle's medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>Bevat 10% van voltooid medium</td></tr><tr><td>menselijke longfibroblasten (MRC-5)</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Inventor 2019</td><td>Autodesk</td><td></td><td>3D computerondersteund ontwerpprogramma</td></tr><tr><td>Petrischaal &Phi; 150 mm</td><td>JetBiofill</td><td>CAD010150</td><td>Oppervlaktebehandeld</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11/6/9003</td><td>Verdunnen met fosfaatgebufferde zoutoplossing tot 4% (w/v) oplossing</td></tr><tr><td>Polycarbonaat (PC)</td><td>Acrylmall</td><td>AC15PC</td><td>200 x 200 x 15 mm</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxaan (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td></td></tr></tbody></table>

lab-op-een-cd-platform voor het genereren van multicellulaire driedimensionale spheroids

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Een driedimensionale spheroid-celcultuur kan nuttiger resultaten verkrijgen in celexperimenten, omdat het de celmicroomgevingen van het levende lichaam beter kan simuleren dan de tweedimensionale celcultuur. In deze studie hebben we een elektrisch motorgestuurd lab-on-a-CD-platform (compact disc) gemaakt, een centrifugale microfluïdisch-gebaseerd spheroid (CMS)-cultuur systeem, om driedimensionale (3D) celsferoïden te maken die een hoge centrifugale kracht implementeren. Dit apparaat kan rotatiesnelheden variëren om zwaartekracht condities te genereren van 1 x g tot 521 x g. Het CMS-systeem is 6 cm in diameter, heeft 500 μm micro putten, en is gemaakt door molding met Polydimethylsiloxaan in een polycarbonaat mal premade door een computer numerieke besturings machine. Een barrière muur bij de ingang van het kanaal van het CMS-systeem maakt gebruik van centrifugale kracht om cellen gelijkmatig in de chip te verspreiden. Aan het einde van het kanaal is er een diagebied dat de cellen in staat stelt om de micro putjes in te voeren. Als demonstratie werden sferoïden gegenereerd door monocultuur en cocultuur van stamcellen en menselijke Long fibroblasten met een hoge zwaartekracht, met behulp van het systeem. Het CMS-systeem gebruikte een eenvoudig bedienings schema om cocultuurspheroids van verschillende structuren van concentrische, Janus en sandwich te produceren. Het CMS-systeem zal nuttig zijn in celbiologie en weefsel engineering studies die sferoïden en organoïde cultuur van enkele of meerdere celtypen vereisen.

De CMS cultuur chip met 6 cm diameter (Figuur 2) werd met succes gemaakt volgens het bovenstaande protocol. Eerst werd de chip afzonderlijk gemaakt van een toplaag en een onderlaag en vervolgens door plasmaverlijming aan elkaar gebonden. Resulterende sferoïden kunnen gemakkelijk worden verzameld door het loskoppelen van de chip. Het kanaal van de CMS cultuur chip bestaat uit een inlaatpoort en centrale, glijbaan en micro well regio's (Figuur 3). De cel-, medium-...

We presenteren een centrifugale microfluïdisch apparaat met motoraandrijving dat celsferioïden kan cultiveren. Met behulp van dit apparaat kunnen sferoïden van enkelvoudige of meervoudige celtypen gemakkelijk onder hoge zwaartekracht worden gecocultureerd.

Lab-op-een-CD-platform voor het genereren van multicellulaire driedimensionale Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Deze techniek kan worden gebruikt om celsferoïden te genereren van individuele en meerdere celtypen met behulp van een lab-on-a-CD-platform, een baanbrekend systeem voor de snelle generatie sferoïden. De techniek maakt gebruik van centrifugale kracht om cellen te deponeren in aangewezen microwells, waardoor de sequentiële opgetogenheid van meerdere celtypen voor de productie van diverse sferoïden. Voor CMS cultuur chip fabricage, eerst polycarbonaat mallen voor de bovenste en onderste lagen van de cultuur chip door computer numerieke controle bewerking.Volgende mix PDMS base en PDMS uithardingsmiddel op een 10 tot 1 verhouding gedurende vijf minuten voor het plaatsen van het mengsel in een desiccator voor een uur om luchtbellen te verwijderen. Giet de ontgast PDMS mengsel in de CMS cultuur chip mallen, en plaats de mallen in de desiccator voor een uur om eventuele luchtbellen te verwijderen. Aan het einde van de tweede ontgassing, moet u het mengsel in een warmtekamer van 80 graden Celsius gedurende twee uur vergen voordat u de spanen in een gestofzuigd plasmareiniger plaatst met de oppervlakken die naar boven moeten worden gebonden.Stel de kweekchips gedurende 30 seconden bloot aan met luchtondersteunde plasma bij een vermogen van 18 watt en bind de twee lagen van de chip in de warmtekamer gedurende 30 minuten vast aan 80 graden Celsius om de hechtingssterkte te verhogen. Steriliseer vervolgens de CMS-kweekchip in een autoclave bij 121 graden Celsius gedurende 15 minuten. Om de cellen voor te bereiden op sferoïde vorming, ontdooi een een-milliliter flacon met vijf tot 10 keer 10 tot de vijf cellen van belang in een 36,5 graden Celsius waterbad gedurende twee minuten alvorens een milliliter DMEM aan de cellen met zachte menging.Voeg vervolgens de cellen toe aan een petrischaal met een diameter van 150 millimeter met 15 milliliter 36,5 graden Celsius en plaats het gerecht 24 uur in een couveuse van de celkweek. De volgende dag, vervang de supernatant met 15 milliliter verse DMEM, en breng de cellen terug naar de incubator. Om de cellen los te maken, maak de cultuur met vier milliliter trypsine gedurende vier minuten bij 36,5 graden Celsius en 5% kooldioxide, waardoor de reactie stopt met vers medium wanneer de cellen van de bodem van de schotel zijn opgetild.Om de cellen te labelen, verwarm een geschikte celfluorescentiekleurstof op kamertemperatuur voordat u 20 microliters van watervrije dimethylsulfoxide aan de flacon toevoegt om een oplossing van één millimolar te verkrijgen. Verdun de fluorescentie tot een uiteindelijke werkconcentratie van één micromolar in DMEM en voeg de kleurstof toe aan de celsusopening van belang met zachte menging. Plaats vervolgens de cellen in de celcultuur incubator voor 20 minuten.Voor monocultuur sferoïde vorming, eerst 2,5 milliliter van 4%Pluronic F-127 oplossing toe te voegen aan het inlaatgat van de CMS cultuur chip tijdens het draaien van de chip op 500 tot 1,000 rotaties per minuut. Wanneer alle oplossing is toegevoegd, draait u de chip drie minuten lang drie minuten op 4.000 rotaties per minuut met behulp van het CMS-systeem. Aan het einde van de rotatie, incubeer de cultuur chip 's nachts op 36,5 graden Celsius op 5%kooldioxide.De volgende ochtend, verwijder de Pluronic oplossing, en was de cultuur chip met DMEM. Na het drogen van de chip gedurende 12 uur op een schone bank, voeg 2,5 milliliter van het medium aan de inlaatpoort, en draai de chip op 4,000 rotaties per minuut gedurende drie minuten. Vervang aan het einde van de rotatie 100 microliter van het medium in de inlaatpoort door 100 microliter van de voorbereide celsuspensie, terwijl de chip draait bij 500 tot 1.000 rotaties per minuut.Draai vervolgens de chip op 3.000 rotaties per minuut gedurende drie minuten om de cellen in elke microwell te vangen door centrifugale kracht voordat u de chip drie dagen in de celkweek incubator plaatst, waardoor het medium wordt vernieuwd zoals elke dag wordt aangetoond. Voor de generatie van concentrische sferoïde cocultuur, voeg de eerste populatie van cellen in 100 microliter van medium aan de inlaatpoort van de chip, terwijl de chip draait op 500 tot 1, 000 rotaties per minuut, gevolgd door drie minuten rotatie bij 3,000 rotaties per minuut. Voeg aan het einde van de rotatie 100 microliter van de tweede celpopulatie toe terwijl de chip draait op 500 tot 1.000 rotaties per minuut en draai de chip nog drie minuten op 3.000 rotaties per minuut.Wanneer beide volumes van cellen zijn geïnjecteerd, plaats de chip in de celcultuur incubator op 1,000 tot 2,000 rotaties per minuut gedurende 24 uur. Voor de Janus sferoïde formatie, voeg 100 microliter van de eerste populatie van cellen, terwijl de chip draait op 500 tot 1,000 rotaties per minuut, gevolgd door drie minuten op 3,000 rotaties per minuut. Plaats aan het einde van de rotatie de chip in de celkweek incubator voor rotatie op 1.000 tot 2.000 rotaties per minuut gedurende drie uur.Voeg aan het einde van de incubatie 100 microliters van de tweede populatie cellen toe, terwijl de chip drie minuten lang draait op 500 tot 1.000 rotaties per minuut voordat de chip draait bij 3.000 rotaties per minuut gedurende drie minuten. Plaats vervolgens de cellen in de celkweek incubator op 1.000 tot 2.000 rotaties per minuut gedurende 24 uur. Voor sandwich sferoïde vorming, voeg eerst 100 microliter van de eerste cel populatie, terwijl de chip draait op 500 tot 1,000 rotaties per minuut, gevolgd door drie minuten rotatie bij 3, 000 rotaties per minuut.Plaats aan het einde van de rotatie de chip twee uur lang op een rotator in de celkweek incubator bij 1.000 tot 2.000 rotaties per minuut voordat u 100 microliter van de tweede populatie cellen toevoegt, terwijl de chip draait op 500 tot 1.000 rotaties per minuut. Draai de chip drie minuten lang op 3,000 RPM en plaats de chip terug in de couveuse voor een incubatie van drie uur met rotatie. Voeg vervolgens nog eens 100 microliter van de eerste celpopulatie toe, terwijl de chip draait op 500 tot 1.000 rotaties per minuut, en draai en kweek de cellen zoals net aangetoond gedurende 12 uur.Volgens het protocol zoals aangetoond, kan een CMS-kweekchip met een diameter van zes centimeter met succes worden vervaardigd. Het kanaal van de CMS-cultuurchip bestaat uit een inlaatpoort en centrale, dia- en microwell-regio's. Time-lapse beelden van twee soorten celkweek genomen bij 2.000 rotaties per minuut voor de eerste 24 uur van de cultuur binnen individuele CMS-chips, zoals aangetoond, tonen de succesvolle vorming van sferoïden.Beeldvorming van de microwells na drie dagen van cultuur blijkt dat de sferoïden tonen een uitstekende uniformiteit en sfericiteit. Gecocultuur sferoïden met conentric, Janus, en sandwich structuren kunnen ook worden gegenereerd. Bovendien, celculturen blootgesteld aan hoge zwaartekracht voor zeven dagen, gevolgd door levende / dode vlekken, tonen aan dat de meeste cellen overleven op lange termijn cultuur binnen de chips.De bovenste en onderste lagen van de CMS-kweekchip moeten zorgvuldig worden uitgelijnd wanneer ze zijn gebonden, anders is het aantal cellen in elke microwell mogelijk niet gelijk. Deze studie kan de toegangsdrempel voor cocultuur sferoïde onderzoek verlagen en kan op grote schaal worden gebruikt in cocultuurstudies, bijvoorbeeld voor het screenen van nieuwe geneesmiddelen van belang.

lab-on-cd-platform-for-generating-multicellular-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een eenvoudige, snelle methode van het genereren van 3D weefsel-achtige sferoïden en hun potentiële toepassing op verschillen in de cel-cel interacties te kwantificeren.

A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Spheroids are a type of 3D cell culture model used to more accurately represent a cell’s environment compared to 2D cell culture monolayer models. In the example protocol, we will see scientists generate spheroids from a colorectal cancer cell line and apply live-cell imaging to track the spheroids’ growth.

Spheroid Generation from Cell Lines: A Three-Dimensional (3D) Cell Culture Method

Hier beschrijven we een snel en flexibel protocol voor de vorming van 3D-celsferoïden door celaggregatie. Dit is gemakkelijk aanpasbaar voor meerdere celtypen en is geschikt voor gebruik in een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder celmigratie, invasie of anoikis-assays, en voor het visualiseren en kwantificeren van cel-matrix interacties.

Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

Hier beschrijven we de grootschalige productie van van vetweefsel afgeleide stromale / stamcel (ASC) sferoïden met behulp van een geautomatiseerd pipetteersysteem om de celsuspensie te zaaien, waardoor homogeniteit van sferoïde grootte en vorm wordt gegarandeerd. Deze ASC-sferoïden kunnen worden gebruikt als bouwstenen voor 3D-bioprintingbenaderingen.

Grootschalige, geautomatiseerde productie van van vetweefsel afgeleide stamcelsferoïden voor 3D-bioprinting

Dit protocol beschrijft een methode voor de productie van drie verschillende soorten sferoïden op een manier die ze geschikt maakt voor grootschalige screening en analyse met een hoog gehalte. Daarnaast worden voorbeelden gepresenteerd die laten zien hoe ze kunnen worden geanalyseerd op sferoïde en individuele celniveaus.

Een robuuste methode voor de grootschalige productie van sferoïden voor screening- en analysetoepassingen met een hoog gehalte

Het huidige protocol beschrijft een techniek om op grote schaal en kosteneffectief weefselsferoïden te produceren met behulp van een 3D-geprint stempelachtig apparaat.

Genereren van weefselsferoïden via een 3D-geprint stempelachtig apparaat

We presenteren een protocol voor het kweken van hoogreproduceerbare sferoïden en hun fenotypische karakterisering met behulp van beeldopname en proteomics.

Semi-geautomatiseerde fenotypische analyse van functionele 3D-sferoïde celculturen

Hier beschrijven we verschillende methoden voor de vorming van meercellige sferoïden om follow-up multi-parameter live celmicroscopie uit te voeren. Met behulp van fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM), cellulaire autofluorescentie, kleuringskleurstoffen en nanodeeltjes wordt de benadering voor analyse van celmetabolisme, hypoxie en celdood in levende driedimensionale (3D) kanker en van stamcellen afgeleide sferoïden gedemonstreerd.

Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden

Deze studie presenteert een kosteneffectieve en efficiënte methodologie voor het genereren van 3D-celstructuren met behulp van een op stempels gebaseerd systeem om microwells in agaroseschimmels te maken. Het systeem bevordert de vorming van uniforme sferoïden/organoïden, waardoor de celinteracties worden verbeterd. Deze aanpak vermindert de experimentele variabiliteit en ondersteunt toepassingen in het testen van geneesmiddelen en weefselmanipulatie.

Generatie van driedimensionale sferoïden/organoïden uit tweedimensionale celculturen met behulp van een nieuw stempelapparaat

Er is een kritieke behoefte aan 3D-kankermodellen die heterocellulaire overspraak vastleggen om kankermetastasen te bestuderen. Onze studie presenteert de generatie van heteromulticellulair stromaal-epitheel in een steiger- en steigervrije omgeving die kan worden gebruikt om invasie en cellulaire ruimtelijke verdelingen te bestuderen.

Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren

Leer het genereren van multicellulaire 3D-spheroiden met een lab-op-een-CD-platform. Deze methode gebruikt centrifugale kracht voor efficiënte celdepositie in microwells en ondersteunt diverse cocultuurtoepassingen.

Lab-op-een-CD-platform voor het genereren van multicellulaire driedimensionale Spheroids

Meer video's verkennen