Name: Rat Mammary Epitheliale Celtransplantatie in de Interscapular White Fat Pad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Leer een betrouwbare transplantatiemethode voor rattenmammacellen in de interscapulaire witte vetkussen. Deze techniek onderzoekt celautonome versus gastheereffecten bij borstkankergevoeligheid zonder voorafgaande clearing.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Hollings Cancer Center's Cancer Center Support Grant P30 CA138313 pilot onderzoeksfinanciering van de National Institutes of Health<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">(https://www.nih.gov/),</a>en fondsen van de afdeling Pathologie & Laboratoriumgeneeskunde aan de Medische Universiteit van South Carolina. We willen Marijne Smiths bedanken voor het opnemen van de interviewverklaringen.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een borstepitheel celtransplantatie techniek geoptimaliseerd voor het werken met ratten. Geïsoleerde borstepitheele-organoïden van donorratten (3-5 weken oud) worden geënt in het interscapulaire witte vetkussen van de ontvangende ratten (ook 3-5 weken oud). Resultaten kunnen worden geïnterpreteerd zo weinig als 4-6 weken later, met behulp van lichte microscopie om het geënte weefsel te onderzoeken; De optimale tijd tussen transplantatie en opoffering moet echter worden bepaald voordat een volledig...

Postnatale borstklier ontwikkeling en ductalmorfogenese zijn processen grotendeels beïnvloed door hormonale signalering aan het begin van de puberteit. Bij muizen en ratten, veelgebruikte modelorganismen van de borstklierbiologie, begint dit proces rond 3 weken oud, waar snelle proliferatie en differentiatie resulteren in de vorming van de volwassen parenchyma. De rijpe borstklier kan ondergaan talrijke rondes van expansie en involutie, een eigenschap die is onderzocht sinds het begin van de20e eeuw. In het kader van hyperproliferatie en kankerontwikkeling werden in de jaren vijftig1transplantatietechnieken voor de borstklier ontwikkeld en versterkt door de kwantitatieve methodologie die Gould et al. in 19772,3,4heeft bijgedragen . Verfijning van de transplantatie techniek bij knaagdieren heeft bijgedragen aan grote vooruitgang in het begrijpen van de normale borstklier biologie die nog steeds op grote schaal worden gebruikt om het effect van verschillende behandelingen en genetische manipulatie op de normale borstklier ontwikkeling en ziekte staten te bestuderen.
Veel hypothesen zijn gegenereerd en vervolgens getest met behulp van borstkliertransplantatie, voor het eerst beschreven door DeOme et al. in 19591. Experimenten in verschillende decennia toonden de neiging van ductalweefsel uit donorborstklieren om het hele vetpad5,6,7 opnieuw te bevolken en gaven aan dat een kritieke component van de ontwikkeling van de borstklier in deze epitheelstructuren woont. Latere studies bij muizen toonden aan dat een enkele borststamcel een gewist vetpad kan herbevolken en heeft bijgedragen aan de ontdekking van een enkele, gemeenschappelijke voorloper van basale en luminaire borstepitheelcellen8,9,10. In overeenstemming met deze conclusies is gesuggereerd dat transplantatie de pool van cellen met multilineage-repopulating potentieel als gevolg van plasticiteit verhoogt, waardoor de geënte cellen een functionele borstklierkunnenlaten groeien 7,10,11,12,13. Belangrijk is dat het gebruik van transplantatietechnieken bij knaagdieren de beperkingen van celkweek-geïnduceerde afwijkingen overwint14 en vaak resultaten oplevert in slechts een kwestie van weken.
Terwijl de procedure oorspronkelijk werd beschreven in de context van preneoplastische laesies bij muizen, werd het al snel uitgebreid tot ratten en gebruikt in combinatie met de carcinogene behandeling om multipliciteit vast te stellen als een maatregel van de gevoeligheid van kanker15, maar de populariteit van transplantatie technieken heeft gevolgd de ontwikkeling van genetische instrumenten voor elke soort. Hoewel muisstudies waarin transplantatie is opgenomen, veel translationele bevindingen hebben bijgedragen, lijkt de haakse van de rattenborstklier op de mens dichterop 16,17 en biedt verschillende voordelen voor het bestuderen van oestrogeenreceptor-positieve (ER+) borstkanker. Borsttumoren zijn in ducible in beide soorten, maar ze verschillen in termen van hormoongevoeligheid en genexpressie profielen. Een primair verschil is dat rat borsttumoren uitdrukken en afhankelijk zijn van de functie van eierstokkanker en hypofyse hormoonreceptoren, namelijk oestrogeen en progesteron (PR), vergelijkbaar met de luminal-A subtype van de menselijke borstkanker. Inderdaad, borstepitheel epitheel celtransplantatie, zoals beschreven in dit protocol, is gebruikt om genetische varianten die betrokken zijn bij borstkanker te bestuderen en de cellulaire autonomie van effecten op borstepitheelcellen te bepalen18.
Naast de tumorbiologie vertoont het ductale epitheel van de normale rattenborstklier een hoger niveau van vertakking en wordt geflankeerd door een dikkere laag stroma dan de muis. Het belang van de stroma is goed gedocumenteerd in borstepitheel epitheliale transplantatie studies. Borstepitheel moet interageren met vette stroma, en idealiter zijn eigen mesenchyme, om zijn karakteristieke morfogenese19,20ondergaan . Entweefsel in een ontvanger borstklier zorgt voor een optimale omgeving; de aanwezigheid van endogene epitheel kan echter de resultaten verstoren. Preclearing de borstklier van endogene epitheel wordt vaak uitgevoerd in muistransplantatie tests en vereist chirurgische excisie van endogene borstweefsel en / of verwijdering van de tepel1,21,22. Hoewel mogelijk, preclearing de borstepitheel in post-spenen ratten is niet zo breed uitgevoerd, vooral te wijten aan de ineffectiviteit van het opruimen van de groeiende borstboom in post-spenende ratten. Aangezien is aangetoond dat gebieden van vetweefsel elders in het lichaam de groei van getransplanteerde borstepitheel21,23,24kunnen ondersteunen, kan het proces van voorclearing gemakkelijk worden vermeden bij ratten door weefsel te enten in het interscapulaire witte vetpad.
De in dit document beschreven transplantatiemethode omvat de injectie van enzymatisch gescheiden borstklierorganoïden (fragmenten van borstkanaalepitheel en andere cellendie morfogenese kunnen) of mono-verspreide cellen in het interscapulaire vetpad in inteelt, isogenische of congene stammen van laboratoriumratten2. Omdat de interscapulaire vetpad normaal gesproken verstoken is van borstweefsel, biedt het een geschikte omgeving voor meerdere transplantatielocaties zonder dat het endogeen epitheel vooraf hoeft te zuiveren. Als gevolg hiervan zijn de endogene, abdominale borstklieren van het gastheerdier niet onderhevig aan chirurgische manipulatie, ontwikkelen zich normaal en kunnen ze de interpretatie van de resultaten niet verstoren. Bovendien kunnen de intacte borstklieren worden gebruikt voor vergelijking om gastheer versus donoreffecten op de borstepitheelontwikkeling en tumorigenese18,25te evalueren. Hoewel herpopulatie van de borstklier uit een enkele stamcel beschikbaar is voor muizen, is deze nog niet ontwikkeld voor ratten, voornamelijk vanwege het gebrek aan beschikbaarheid van antilichamen om te selecteren voor ratborststamcellen25,26,27. Desondanks kan transplantatie van monodispersed borstepitheelcellen om repopulating potentieel te kwantificeren met succes worden uitgevoerd, en die cellen zullen zich normaal ontwikkelen wanneer ze in het juiste kader2,3,4worden geënt. Hoewel organoïden voor vele doeleinden goed zijn, zijn monodispersed cellen nodig voor kwantitatieve toepassingen, bijvoorbeeld om het aantal borstepitheelcellen te bepalen dat nodig is voor de kankerinitiatie na ioniserende bestraling28 of voor het vergelijken van kenmerken van flow cytometrisch geselecteerde borstepitheelcelpopulaties29.
Tot op heden, de procedure hier beschreven is de meest robuuste methode van het uitvoeren van borstklier transplantatie in de rat met een algemeen doel van het bestuderen van borstklier ontwikkeling en mechanismen die ten grondslag liggen borstkanker ontwikkeling. Vaak worden de donor- en/of ontvangende dieren vóór, tijdens of na de epitheeltransplantatie blootgesteld aan verschillende variabelen. Voorbeelden hiervan zijn enkelgenstudies met chemische carcinogenese30, straling28,31,32, genetische manipulatie van gastheer/donorgenoom18en hormonale manipulatie12. Een groot voordeel van de enzymatische dissociatie beschreven in dit protocol is de mogelijkheid om epitheliale organoïden of monodispersed cellen te isoleren voor complementaire experimenten met flow cytometrie, 3-D cultuur, genbewerking, en nog veel meer. Toekomstige toepassingen van deze techniek zullen aanvullende manipulatie van donor- en/of gastheerweefsel met genetische manipulatie omvatten. Donorcellen kunnen bijvoorbeeld genetisch worden gewijzigd ex vivo op elke gekozen genomische locus met behulp van het CRISPR-Cas9 genbewerkingssysteem. Op dezelfde manier kunnen ontvangers ratten ook genetisch worden gewijzigd om de interactie tussen donor en ontvanger gemanipuleerde genetische factoren te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>0.2 &micro;M spuitfilters</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-715G</td><td>steriele-filtrerende collagenase-verteringsmedia</td></tr><tr><td>1,5 - 2,0 mL microcentrifugebuizen (sterieel)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>met resuspendeerde cellen en/of hersenhomogenaatmengsel</td></tr><tr><td>100 &micro;M celstrainers</td><td>Corning</td><td>431752</td><td>filteren van hersenhomogenaat</td></tr><tr><td>100 uL gasdichte spuiten met 25 gauge naalden</td><td>Hamilton</td><td>81001 &amp; 90525</td><td>Voor het injecteren van graftmengsel in ontvangende dieren (1 per donor genotype/conditie)</td></tr><tr><td>1000 uL pipettentips + pipet</td><td>-</td><td>-</td><td>overbrengen van cellen/mengsels/weefsel</td></tr><tr><td>15 mL polypropyleenbuis</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352196</td><td>opslag van hersenhomogenaatmengsel, of cel : homogenaatmengsel voor transplantatie</td></tr><tr><td>40 &micro;M celstrainers</td><td>Corning</td><td>431750</td><td>filteren van organoïden na het wassen van het cellenpellet</td></tr><tr><td>50 mL polypropyleenbuizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-6</td><td>voor collagenase-vertering van donormelkklierweefsel</td></tr><tr><td>60 mm schalen</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>voor het snijden van weefsel</td></tr><tr><td>Alum Kaliumsulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>243361/237086</td><td>kleuring van gehele melkklierpreparaten</td></tr><tr><td>Anesthesieverstuiver voor veterinair gebruik</td><td>-</td><td>-</td><td>volg het institutionele protocol</td></tr><tr><td>Beta-dine of jodium</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaat glas kweekbuis voor homogenisatie</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td>voor homogenisatie van hersenen (gebruik de juiste buis voor de homogenisator)</td></tr><tr><td>Karmijn</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6152/1022</td><td>kleuring van gehele melkklierpreparaten</td></tr><tr><td>Celtellingsapparaat</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Schonemateriaal voor herstel</td><td>-</td><td>-</td><td>volg het institutionele protocol</td></tr><tr><td>Collagenase Type 3</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS004183</td><td>enzymatische vertering van gesneden melkklierweefsel van donorratten</td></tr><tr><td>De-ioniserd water</td><td>-</td><td>-</td><td>voor chemische oplossingen</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320033</td><td>voor het snijden van weefsel, collagenase-verteringsmedia en het resuspenderen van epitheliale cellenmengsels</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>-</td><td>-</td><td>monodispersiemengsel</td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2705/2701</td><td>fixatief voor gehele melkklierpreparaten, wassen voor gehele melkklierpreparaten, schoonmaken chirurgische incisieplaatsen (verdund)</td></tr><tr><td>Fataal runder serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>-</td><td>inactivatieoplossing</td></tr><tr><td>Gaze</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>IJzerzuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>gebruik voor fixatief voor gehele melkklierpreparaten (1:4 ijzerzuur in 100% ethanol)</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>-</td><td>monodispersiemengsel</td></tr><tr><td>Verwarmingspads</td><td>-</td><td>-</td><td>volg het institutionele protocol</td></tr><tr><td>IJsemmers (x2)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Incubator met orbitale rotatie</td><td>-</td><td>-</td><td>moet in staat zijn om 37&deg;C te handhaven, schudden bij 220-225 RPM (voor collagenase-vertering van borstweefsel)</td></tr><tr><td>Isofluraane anesthesie</td><td>-</td><td>-</td><td>volg het institutionele protocol</td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop of digitale camera</td><td>-</td><td>-</td><td>visueel bekijken van gehele gemonteerde borstpituitaire klier en/of het maken van afbeeldingen</td></tr><tr><td>Mechanische homogenisator</td><td>Fisher Scientific</td><td>-</td><td>TissueMiser of alternatieve modellen</td></tr><tr><td>Mineraalolie, puur</td><td>Sigma-Aldrich/ ACROS Organics</td><td>8042-47-5</td><td>langetermijnopslag van verduidelijkte gehele melkklierpreparaten</td></tr><tr><td>Zuurstoftanks voor anesthesieverstuiver</td><td>-</td><td>-</td><td>volg het institutionele protocol</td></tr><tr><td>Papierdoekjes of delicate schoonmaakdoekjes</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Positief geladen microscoopglaasjes</td><td>Thermo Scientific</td><td>P4981-001</td><td>gehele melkklierweefselpreparaten</td></tr><tr><td>Postoperatieve pijnstiller</td><td>-</td><td>-</td><td>Institutioneel protocol</td></tr><tr><td>Schaal</td><td></td><td></td><td>lichaamsgewichtmetingen van dieren, juiste dosering van pijnmedicatie</td></tr><tr><td>Shaver</td><td>-</td><td>-</td><td>elektrische scheerapparaten, of andere</td></tr><tr><td>Kleurvaten</td><td>-</td><td>-</td><td>minimaal 1 per chemische was, formaat geschikt voor het aantal plaatjes, glas geprefereerd</td></tr><tr><td>Steriele velddoeken</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td>gebruikt tijdens transplantatie</td></tr><tr><td>Steriele schaar en pincetten x3 (geautoclaveerd)</td><td>-</td><td>-</td><td>autoclave chirurgische instrumenten gebruikt voor donoren en ontvangers</td></tr><tr><td>Spuiten: 5 mL (of groter)</td><td>-</td><td>-</td><td>voor steriele filtratie van collagenase-verteringsmedia</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Worthington</td><td></td><td>monodispersiemengsel</td></tr><tr><td>Afvalinzamelbak voor vloeistoffen (uitgegoten of aangezogen)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Wondclipapparaat, clips, en verwijderingstool</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td>Het sluiten van de huidincisieverwonding boven het interscapulaire witte vetkussen</td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>verduidelijken van gehele melkklierpreparaten na kleuring</td></tr></tbody></table>

rat mammary epitheliale celtransplantatie in de interscapular white fat pad

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Al in de jaren 1970 hebben onderzoekers met succes getransplanteerde borstepitheelcellen in de interscapulaire witte vet pad van ratten. Enten van borstepitheel met behulp van transplantatietechnieken maakt gebruik van de hormonale omgeving die wordt geboden door de adolescente knaagdiergastheer. Deze studies zijn bij uitstek geschikt om de impact van verschillende biologische manipulaties op de ontwikkeling van de borstklier te onderzoeken en vele aspecten van de borstklierbiologie te ontleden. Een gemeenschappelijk, maar beperkend kenmerk is dat getransplanteerde epitheelcellen sterk worden beïnvloed door de omringende stroma en worden overconcurreerd door endogene epitheel; om inheemse borstweefsel te gebruiken, moet het buik-inguinale witte vetpad worden gewist om gastheer borstepitheel voorafgaand aan de transplantatie te verwijderen. Een belangrijk obstakel bij het gebruik van het rattenmodel organisme is dat het opruimen van de zich ontwikkelende borstboom in post-gesaneerde ratten niet efficiënt is. Wanneer getransplanteerd in kliervrije vetpads, donor epitheliale cellen kunnen herbevolken de gewiste gastheer vet pad en vormen een functionele borstklier. De interscapulaire vet pad is een alternatieve locatie voor deze grafts. Een groot voordeel is dat het geen ductalstructuren heeft, maar de normale stroma biedt die nodig is om epitheeluitgroei te bevorderen en gemakkelijk toegankelijk is in de rat. Een ander groot voordeel van deze techniek is dat het minimaal invasief is, omdat het de noodzaak elimineert om de groeiende endogene borstboom te cauteriseren en te verwijderen. Bovendien bevat de interscapulaire vetpad een mediale bloedvat dat kan worden gebruikt om plaatsen voor enting te scheiden. Omdat de endogene klieren intact blijven, kan deze techniek ook worden gebruikt voor studies die de endogene borstklier vergelijken met de getransplanteerde klier. Dit document beschrijft de methode van borstepitheelceltransplantatie in het interscapulaire witte vetstootkussen van ratten.

Donor en ontvanger borstklieren De stappen om rattenborstepitheelcellen te isoleren en voor te bereiden op transplantatie zijn weergegeven in figuur 1A. Op de leeftijd van 4 weken is de endogene borstklier van de donorrat begonnen met rijping en kan epitheel op geheel gemonteerde glijbanen worden gevisualiseerd die zijn gekleurd met aluincarmine(figuur 1B)....

Dit artikel beschrijft een transplantatiemethode om donorrattenborstepitheelcellen te transplanteren in het interscapulaire witte vetkussen van de ontvangende dieren. Deze methode kan worden gebruikt om gastheer- en/of donoreffecten op de ontwikkeling van borstepitheel te onderzoeken en elimineert de noodzaak van pre-clearing, waardoor het nut van deze techniek wordt uitgebreid.

Rat Mammary Epitheliale Celtransplantatie in de Interscapular White Fat Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Dit protocol wordt al meer dan 40 jaar gebruikt en blijft de enige betrouwbare methode voor borstceltransplantatietesten bij de rat. Deze methode wordt veel gebruikt om borstcel autonome versus gastheer effecten in borstkanker gevoeligheid onderzoek te ondervragen. Door in het interscapulaire vetpad te enten, omzeilt deze methode het moeten wissen van het endogene membraaneptheel dat niet effectief is bij ratten.De methode is daarom minder invasief en de endogene borstklieren kunnen worden gebruikt als een interne controle. Om deze procedure te beginnen, plaats een geëuthanaseerde vrouwelijke rat op zijn rug en beveilig het met pinnen. Besproei het gehele ventrale oppervlak met 70% ethanol.Maak een sagittale Y-vormige incisie waardoor toegang tot thoracale, buik- en inguinale borstklieren. Gebruik een schaar om al het borstklierweefsel van de donorrat te ontleden en alle zichtbare lymfeklieren te verwijderen. Gebruik vervolgens tangen om het borstweefsel te extraheren.Plaats het in een gelabelde 60 millimeter schotel met 500 microliters van serum-vrije DMEM F12 media en houd het op ijs. Gebruik dan een schaar om het borstweefsel fijn te gehakt. Draai eerst voorzichtig het lichaam van het donordier om om het in een gevoelige positie te plaatsen en vast te zetten met pinnen.Spray de kop en bovenrug met 70% ethanol. Zoek de basis van de schedel en maak een incisie onder de occipitale condyles, steek een scherpe schaar onder de huid en snijd de huid uit de buurt van de schedel met inbegrip van de zijkanten van het hoofd. Gebruik vervolgens botsnijders of sterke scharen om de schedel langs de middellijn te snijden van de occipital tot frontale botten, terwijl u ervoor zorgt dat het blad zo oppervlakkig mogelijk en schuin omhoog te houden om de vernietiging van het onderliggende hersenweefsel te voorkomen.Gebruik Rongeurs of sterke tangen om het bot weg te pellen. Plaats het gereedschap lateraal in het cerebellum om het bot aan weerszijden te breken. Verbreken de verbindingen met de hersenvliezen door het gehoorkanaal volledig bloot te stellen.Gebruik gebogen fijngebogen tangen om de hersenen uit de schedel te tillen en het gewicht vast te leggen. Gebruik een nieuwe start van de leveringen voor extra donor hersenen. Breng het onmiddellijk over naar een buis van 15 milliliter met een gelijke hoeveelheid media die op ijs is opgeslagen.Homogenize de hersenen voor 10 tot 15 seconden op een lage snelheid. Vervolgens filter het homogenaat om grote stukken te verwijderen. Bewaar de vloeistof op ijs tot dat nodig is.Snijd eerst een centimeter van het einde van een 1.000 microliter pipetpunt en plaats deze handmatig op de pipet. Gebruik een gesneden pipettip om het gehakte donorweefsel van elke 60 millimeter schotel over te brengen naar de collagenase spijsverteringsbuis. Meng het gehakt weefsel voorzichtig door het een tot twee keer op en neer te pipetten.Zet de monsters vervolgens in een horizontale positie in de schuddende couveuse. Laat de monsters 1,5 tot twee uur verteren bij 37 graden Celsius terwijl u schudt bij een snelheid tussen 200 en 220 rpm. Wanneer het donorklierweefsel volledig wordt verteerd, centrifugeren de suspensie op 1,200 keer g en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Nadat u ervoor hebt gezorgd dat een pellet is gevormd, gebruikt u een pipet om de vetlaag te verwijderen of giet u voorzichtig de supernatant af. Voorzichtig resuspend de pellet in 10 milliliter verse DMEM F12 media. Herhaal dit proces om de cellen grondig te wassen.Bereid een 50 milliliter buis met een 40 micrometer zeef voor elk donordier. Pre-nat de zeef met ten minste een milliliter van DMEM F12 media. Gebruik vervolgens een pipet om de celsuspensie door het filter te laten gaan om ductale fragmenten of organoïden te verzamelen.Voor organoïden, bewaar alleen de cellen die in het filter blijven. Keer de celzeef over een nieuwe buis van 50 milliliter en spoel af met elk volume steriele media dat nodig is om alle cellen te verzamelen. Na deze, pellet de cellen nogmaals en resuspend in een klein volume van de media voor het tellen.Bereid enkele partijen donormateriaal voor alle transplantatieontvangers door gelijke volumes van de celsuspensie te combineren met 50% hersenhomogenaat voor elke plaats van transplantatie. Identificeer eerst de basis van de schedel en begin van de wervelkolom op een ontvangend dier. Ongeveer een derde van de weg langs de wervelkolom, scheer een drie centimeter bij twee centimeter gebied op de bovenste thoracale gedeelte van de rug.Bereid vervolgens het steriele veld voor dat zal worden gebruikt voor een operatie en schik alle benodigde benodigdheden. Spoel de Hamilton spuiten met steriele DMEM F12 media om het verlies van cellen te voorkomen. Laad het volledige volume donormateriaal in een aparte spuit voor elke aandoening.Nadat de spuit volledig is geladen, omkeren en druk op de zuiger iets om luchtbellen te verwijderen aan het uiteinde van de naald. Houd de spuit op ijs gedurende de procedure. Zorg ervoor dat het dier niet reageert op diepe prikkels met een stevige teensnuifje.Gebruik vervolgens een scherp chirurgisch mes om een kleine interscapulaire incisie te maken. Zoek het mediale bloedvat voor oriëntatie en gebruik tangen om de huid op te heffen aan de ene kant van de incisie. Houd de huid uit de buurt van het vetpad en vermijd het onderliggende bruine vet terwijl de transplantatie wordt uitgevoerd.Steek vervolgens de naald in de graftplaats. Injecteer voorzichtig 40 microliter van het celmengsel in het interscapulaire witte vetstootkussenweefsel. Verwijder de naald langzaam.Houd het weefsel op zijn plaats en laat de getransplanteerde cellen drie tot vijf seconden regelen. Herhaal de volledige injectieprocedure zoals eerder beschreven op de tweede plaats van transplantatie. Sluit hierna de chirurgische wond met wondklemmen of hechtingen en stop vervolgens met de anesthesie.Na het offeren van het dier, bereid het voor op dissectie. Identificeer het mediale bloedvat dat de graft sites in de interscapulaire vetpad scheidt. Accijns het hele pad als een enkel stuk weefsel.Plaats het weefsel op een positief geladen microscoop dia voor hele mount. Plaats de dia's in 70%ethanol gedurende zeven tot 10 dagen om het weefsel te de-vet. Bereid vervolgens de aluinkarmijnvlek voor en verwerk de glijbanen wanneer het weefsel voldoende ondoorzichtig is.Wanneer de verwerking is voltooid en het weefsel op de dia is gewist, gebruik maken van low powered light microscopie of hoge resolutie digitale fotografie om beelden van de dia's te verwerven voor analyse. In deze studie worden borstepstelcellen getransplanteerd met behulp van een techniek die is geoptimaliseerd voor het werken met ratten waarbij de geïsoleerde borsteppitheelorganoïden van donorratten worden geënt in het interscapulaire witte vetpad van ontvangende ratten. De aanwezigheid, afwezigheid of overvloed aan epitheel kan worden geëvalueerd om het succes van het experiment te bepalen, evenals de autonomie van effecten in verband met experimentele variabelen.Een wederkerig transplantatie experiment waarbij elke factor heeft twee niveaus, zoals wilde type versus knock-out zal leiden tot vier transplantatie groepen voor hypothese testen. De representatieve hele gemonteerde interscapulaire vet pad hier getoond bevat positieve epitheliale uitgroei op beide plaatsen van transplantatie. Bij het analyseren van de dia's kan het ontbreken van epitheel in het interscapulaire vetpad in veel monsters wijzen op een technisch probleem met de procedure en moet het worden behandeld als een negatief resultaat.Donor epitheeluitgroei kan ook worden vergeleken met de endogene borstklier en kan vergemakkelijken aanvullende conclusies. In het hier getoonde voorbeeld suggereerden de resultaten van wederzijdse transplantatie met behulp van wildtype- en CDKN1B-knock-outratten autonome effecten van niet-borstcel op de ontwikkeling van borstklieren. Vergeet niet donor epitheelcellen en organoïden moet zorgvuldig worden voorbereid en in leven gehouden totdat geïnjecteerd in de ontvanger dier.Het is absoluut noodzakelijk om vooruit te plannen en de procedure zorgvuldig en zonder onderbrekingen uit te voeren. Primaire carcinogenese testen kunnen worden uitgevoerd na transplantatie om de autonomie van de borstcel in de etiologie of behandeling van borstkanker te ondervragen. Genbewerking kan ook worden opgenomen om de donorcellen of de ontvangende rat genetisch te technicusen.Als enige methode voor het uitvoeren van borstepitheelceltransplantatie bij ratten, vergemakkelijkt deze procedure de ontwikkeling van borstklieren en carcinogenese studies. Deze techniek is vooral belangrijk voor het onderzoeken van interacties tussen borstkankercellen en/of borstepstelcellen met de gastheermicro-omgeving. Het maakt studies in borstklier ontwikkeling en borstkanker onderzoek.Degenen die deze techniek voor de eerste keer proberen, moeten de preparaten van donorcellen optimaliseren om een maximale celopbrengst en levensvatbaarheid te garanderen, vervolgens kleine proefexperimenten uitvoeren om chirurgische ingrepen te oefenen en celnummers te bepalen om te injecteren en ook postchirurgische incubatietijden bepalen die nodig zijn voor experimenten.

rat-mammary-epithelial-cell-transplantation-into-interscapular-white

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Dit artikel toont de procedure ontwikkeld door DeOme...

Borstklieren Epitheliale Transplant Procedure

In dit rapport tonen we een systeem te isoleren en cultuur donor cellen van de muis borstklier, en orthotopically deze cellen transplantatie in ontvangende muizen om de stromale analyseren: epitheel interacties tijdens mammatumor ontwikkeling.

Borstklieren transplantatie van stromale cellen en carcinoom cellen in C57BL/6J Muizen

In dit artikel bespreken we hoe we een borstkankermodel bij vrouwelijke muizen kunnen vaststellen door borstkankercellen in het borstvetkussen te injecteren. Het voorbeeldprotocol demonstreert de orthotopische injectie.

Orthotopische injectie in het borstvetkussen: borstkanker bij muizen vaststellen

De video toont de orthotopische inentingstechniek voor borstkanker in een muismodel. Deze techniek produceert een hoge tumorigenesesnelheid met minder variabiliteit in tumorgrootte en vorm in vergelijking met subcutane of niet-chirurgische injectie.

Orthotopische injectie: weefselspecifieke kankercellen implanteren in een volwassen muis

Kanker is een complexe ziekte die wordt beïnvloed door het weefsel rondom de tumor en lokale pro- en anti-inflammatoire mediatoren. Daarom kan orthotroop injectie modellen plaats subcutane modellen nuttig om de progressie van kanker te bestuderen op een wijze die beter nabootst humane pathologie.

Orthotopische Injectie van borstkankercellen in de uiervet Pad van Muizen tumorgroei te bestuderen.

Dit protocol beschrijft methoden voor het zuiveren, kwantificeren en karakteriseren van extracellulaire vesicles (EVs) / exosomen van niet-aanhechtende / mesenchymale mammary epitheelcellen en voor het gebruik ervan om het vermogen van de borstkanker te overdragen naar luminale mammary epitheelcellen. EV's / exosomen afgeleid van stamachtige mammale epitheelcellen kunnen deze celeigenschap overbrengen aan cellen die de EV's / exosomen innemen.

Overdracht van Mammary Gland-vormende Vermogen Tussen Mammary Basal Epithelial Cellen en Mammary Luminale Cellen via Extracellulaire Vesicles / Exosomen

Dit werk demonstreert een nieuwe aanpak om het proliferatie-, differentiatie- en vaartuigvormende potentieel van vasculaire endotheliale stamcellen (VESC's) te beoordelen door middel van transpiratie van de dikke dikvliesvoeding, gevolgd door een full-mount weefselbereiding voor microscopische observatie. Ook wordt een lineage-tracingsstrategie om het gedrag van VESC's in vivo te onderzoeken, ook voorgesteld.

Een nieuwe Mammary Fat Pad Transplantation Technique om de Vessel Generation van Vasculaire Endotheliale Stamcellen te visualiseren

Hier presenteren we een protocol om het implantaat van borstkankercellen in de borstklier vet pad in een eenvoudige, minder invasief, en gemakkelijk te bedienen manier, en deze orthotopic borst kanker muismodel met een juiste borstklier vet pad omgeving kan worden gebruikt voor het onderzoeken van verschillende aspecten van kanker.

Orthotopic injectie van borstkankercellen in de borstklier vet Pad muizen

Patient-derived xenograft (PDX) modellen en transplanteerbare genetisch gemanipuleerde muismodellen getrouw de menselijke ziekte samenvatten en zijn voorkeursmodellen voor fundamenteel en translationeel borstkankeronderzoek. Hier wordt een methode beschreven om borsttumorfragmenten orthotopisch in het borstvetkussen te transplanteren om tumorbiologie te bestuderen en de respons van geneesmiddelen te evalueren.

Orthotopische transplantatie van borsttumoren als preklinische modellen voor borstkanker

Preklinische modellen die adjuvante therapie beoordelen die gericht zijn op metastase van borstkanker, ontbreken. Om dit aan te pakken, ontwikkelden we een muizenmodel van de novo pulmonale mammary adenocarcinoma metastase, waarbij therapieën toegediend in de adjuvante omgeving (post-chirurgische resectie van primaire tumoren) kunnen worden geëvalueerd voor werkzaamheid bij het beïnvloeden van eerder gecoede pulmonale metastasen.

Chirurgische Procedures en Methodologie voor een Preklinisch Murine Model van De Novo Maagkanker Metastase

Leer een betrouwbare transplantatiemethode voor rattenmammacellen in de interscapulaire witte vetkussen. Deze techniek onderzoekt celautonome versus gastheereffecten bij borstkankergevoeligheid zonder voorafgaande clearing.

Rat Mammary Epitheliale Celtransplantatie in de Interscapular White Fat Pad

Meer video's verkennen