Stereologische schatting van cholinerge vezel lengte in de kern Basalis van Meynert van de muis hersenen
5 februari 2020
Neuronale vezel lengte binnen een driedimensionale structuur van een hersengebied is een betrouwbare parameter om specifieke neuronale structurele integriteit of degeneratie te kwantificeren. Dit artikel beschrijft een stereologische kwantificeringsmethode om cholinerge vezellengte binnen de kernbasisvan Meynert bij muizen als voorbeeld te meten.
Neurodenegratie bij veel neurologische aandoeningen is een chronisch proces waarvan neuronale vezelverlies vaak optreedt voorafgaand aan het verlies van het cellichaam. De stereologische kwantificering van neuronale vezels in drie dimensies biedt een gevoelige en nauwkeurige methode voor het detecteren van vroege neurodegeneratieve verandering. Deze technologie maakt gebruik van de betrouwbare en efficiënte computer-gebaseerde onpartijdige fractionatie van de ruimte ballen om de lengtes van lijn-achtige structuren zoals neuronale vezels in 3D te meten.
Het aantonen van de procedure zal worden gedaan door Prabhakar Singh, een post-doc en onze expert in stereologie, en David Peng, de onderzoeksassistent in mijn lab. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex in de verdoofde muis, transcardially doornemen met ongeveer 50 milliliter ijskoud 0,1 molaire DPBS, gevolgd door ongeveer 25 milliliter van 4%PFA in 0,1 molaire PBS. Aan het einde van de perfusie, post-fix de hersenen in een container van verse 4%PFA gedurende 24 uur op vier graden Celsius.
De volgende dag, was de hersenen met drie een tot twee minuten wast in verse DPBS per wasbeurt en breng de hersenen in een 15% sacharose in 0,1 DPBS oplossing 's nachts. De volgende ochtend, plaats de hersenen in een 30% sacharose oplossing en 0,1 molaire DPBS voor 48 uur op vier graden Celsius. Breng aan het einde van de incubatie de hersenen over naar een cryotomekamer die vooraf is ingesteld op min 20 graden Celsius.
Hersenen kunnen worden bewaard in verzegelde buizen en opgeslagen bij min 80 graden Celsius. Voor de doorsnede, insluiten van het weefsel monster in een optimale snijtemperatuur inbedding medium en monteer het monster op een monster schijf. Dan verwerven seriële 30 micrometer dikke secties in een coronale vlak in de cryotoom, de overdracht van elke sectie in individuele putten van een 24-well cultuur plaat met cryoprotectant oplossing ter voorbereiding van min 20 graden Celsius opslag.
Om de eerste en laatste delen van elk brein te identificeren, vergelijkt u de morfologische kenmerken met een standaard muishersenenatlas. NBM begint bij bregma minus 0,0 millimeter en eindigt bij min 1,6 millimeter. De selectie van elke achtste sectie levert in totaal zes tot zeven secties op en maakt een passende foutcoëfficiënt mogelijk voor zowel een schatting van de volume- als de vezellengte.
Voor immunohistochemische etikettering van de weefselsecties, na het blokkeren van een niet-specifieke binding met 10%normaal runderserum in 0,1%Triton X-100 in tris-gebufferde zoutoplossing, etiketteren de secties met het primaire antilichaam van belang gedurende 48 uur bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie was je de secties drie maal drie minuten in verse Tris-gebufferde zoutoplossing per wasbeurt, gevolgd door incubatie met een passend biotinylated secundair antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de secties drie keer in verse Tris-gebufferde zoutoplossing zoals aangetoond, gevolgd door vlekken met Avidin biotine peroxidase complex en DAB peroxidase substraat oplossing volgens de protocollen van de fabrikant.
Na het wassen, monteer alle secties van een hersenweefsel monster op een gelatineiseerde dia en laat de monsters aan de lucht drogen. Om de secties te dehydrateren, dompel de monsters twee keer gedurende vijf minuten per verdunning onder in sequentiële opgaande ethanoloplossingen zoals aangegeven, gevolgd door clearing met twee xyleenwasbeurten van 10 minuten. Gebruik vervolgens een geschikt montagemedium om coverslips op de dia's te plaatsen.
Open voor stereologie een nieuwe studie in de software. Er wordt een studieinitialiseringsdialoogbox geopend. Vul de studie-informatie in en bevestig dat er op meerdere niveaus fractiegebaseerde gegevens zijn geselecteerd.
Dubbelklik op volume om het volumedialoogvak te openen. Geef de functie van belang een naam en selecteer de gebiedspunttellingssonde en klik vervolgens. Dubbelklik op de lengte en geef een naam van de functie op.
Selecteer de bollensonde en klik vervolgens. In het vak caseinitialisatie, om de groepen te coderen voordat u met de studie begint, stelt u het totale aantal secties in dat begint vanaf het eerste gedeelte met het interessegebied tot het laatste gedeelte met het interessegebied en het sectiebemonsteringsinterval op acht. Klik naast om het dialoogvenster initialisatiedialoog van de sonde te openen, waarin automatisch de laagste vergroting voor de gebiedsselectie en volumeschatting wordt ingesteld en de instellingen wordt bevestigd.
Klik op voorbeeld om te controleren of het interessegebied kan worden geïdentificeerd bij de geselecteerde lagere vergroting. Voer 50,000 micrometerkubus per punt in voor de regiovolumefractie en klik op voorbeeld en gedaan. Stel onder object hoge vergroting de lengte in op 63x en dubbelkliklengte om het vak met de lengteboldialoog te openen.
Stel de diameter van deze bol in op 10 micrometer en klik op gedaan. Stel de juiste waarden in voor het framegebied, de framehoogte, de beveiligingszone en de frameafstand. Klik vervolgens op de volgende en volg de instructies van de software.
Als u het eerste gedeelte wilt invoegen, plaatst u de dia op het stadium van de microscoop onder een doelstelling van 5X en klikt u op de groene pijl om een willekeurige grens rond de NBM te tekenen om het interessegebied te definiëren. Klik op de groene pijl en gedaan om de 63X doelstelling te wijzigen om de vezelmetingen van de huidige fractie te verkrijgen. De sectie dikte dialoog doos zal verschijnen.
Stel het boven- en onderkant van de sectie in om de werkelijke dikte van de sectie te meten met behulp van de handmatige z-as focusknop en klik op gereed. Verplaats de z-as langzaam van boven naar beneden in de framehoogte van de sectie om alle kruisende vezels op het oppervlak van de virtuele bolsonde te markeren. Wanneer alle vezels zijn gemarkeerd, klikt u naast om door te gaan naar de volgende locatie.
Wanneer alle breuken zijn voltooid, klikt u op de groene pijl. De software zal vragen om de volgende sectie ingevoegd. Breng het volgende monster op de dia in beeld met behulp van de 5X doelstelling en herhaal de vezel meting zoals net aangetoond.
Wanneer alle secties zijn gemeten, genereert de software een resultaat voor de case met de foutcoëfficiënt. Als de foutcoëfficiënt aanvaardbaar is, gaat u naar het volgende geval. Als de foutcoëfficiënt niet aanvaardbaar is, zal de software aanbevelingen doen om een aantal parameters te wijzigen.
Wanneer alle aanvragen zijn voltooid, genereert u resultaten voor elk geval en elke groep. In dit representatieve experiment, de Zweedse mutant beta amyloïde precursor eiwit groep toonde een aanzienlijk lagere vezel lengte en vezel lengte dichtheid in vergelijking met hun wild-type nest stuurlieden. De resultaten toonden ook aan dat er geen significant verschil in het volume van de NBM tussen de twee geanalyseerde groepen.
Deze techniek vereist de juiste verwerving in de juiste oriëntatie en een goede kleuringsmethode met de incubatietijd. Het stereologieprotocol kan worden gebruikt voor de schatting van lineaire profielen zoals andere neuronale vezels, astrocytenprocessen of zelfs vasculaire profielen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een stereologische methode voor het kwantificeren van de lengte van cholinerge vezels in de nucleus basalis van Meynert bij muizen, een cruciale parameter voor het beoordelen van de neuronale integriteit bij neurodegeneratieve processen. Door gebruik te maken van driedimensionale analyse biedt de techniek een verhoogde gevoeligheid voor de vroege detectie van neuronaal vezelverlies voorafgaand aan de degeneratie van het cellichaam.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Neurodegeneratie
- Stereologie
Achtergrond
- Neurodegeneratie gaat vooraf aan het verlies van neuronale cellichamen en wordt vaak gekenmerkt door vezelverlies.
- Stereologische methoden maken een nauwkeurige driedimensionale meting van neuronale structuren mogelijk.
- Cholinerge vezels spelen een belangrijke rol bij cognitieve functies en neurodegeneratieve ziekten.
Doel van de studie
- Het vaststellen van een betrouwbare methode voor de stereologische kwantificering van de lengte van cholinerge vezels.
- Het demonstreren van de toepassing van deze methode in een specifieke hersenregio.
- Het faciliteren van de vroege detectie van neurodegeneratieve veranderingen.
Gebruikte methoden
- De studie maakt gebruik van stereologische technieken voor het kwantificeren van neurale vezels in drie dimensies.
- Muizen dienen als biologisch model voor het beoordelen van cholinerge vezels in de nucleus basalis van Meynert.
- De methodologie omvat gedetailleerde weefselpreparatie, coupesnijden en immunohistochemische labeling.
- Computergestuurde analyse wordt ingezet voor onbevooroordeelde kwantificering en parameter-schatting.
Belangrijkste resultaten
- De stereologische methode meet effectief de lengtes van cholinerge vezels en toont het vermogen om vroege tekenen van degeneratie te detecteren.
- Kwantitatieve bevindingen tonen het potentieel aan voor het beoordelen van de structurele integriteit bij neurodegeneratieve aandoeningen.
- De resultaten wijzen op een protocol dat nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid waarborgt bij de meting van de vezellengte.
Conclusies
- Deze studie benadrukt het belang van stereologische methoden bij het bestuderen van neurodegeneratie.
- De methodologie maakt vroege interventiestrategieën mogelijk door degeneratie te identificeren voordat er celverlies optreedt.
- De verkregen inzichten dragen bij aan een beter begrip van de integriteit van het cholinerge systeem en potentiële therapeutische doelwitten bij neurodegeneratieve ziekten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Het kwantificeren van de lengte van cholinerge vezels in de nucleus basalis van Meynert biedt een gevoelige biomarker voor vroege neurodegeneratieve veranderingen, wat targetvalidatie in preklinische modellen van cognitieve achteruitgang mogelijk maakt. Deze stereologische benadering ondersteunt mechanische risicovermindering door axonverlies te detecteren voordat celdegeneratie optreedt, waardoor het voorspellend vertrouwen bij therapeutische screening wordt verbeterd. De methode versterkt de translationele continuïteit door structurele integriteit te koppelen aan functionele uitkomsten in ziekterelevante systemen.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de integriteit van het cholinerge systeem mogelijk als therapeutische hypothese in modellen voor neurodegeneratieve ziekten.
- Operationele waarde: Biedt kwantitatieve, onbevooroordeelde metingen van de vezellengte om de doelgerichte interactie per specifiek pad te verduidelijken.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door vroege axonale uitval te detecteren, waardoor het vertrouwen in het doelwit bij de identificatie van lead-verbindingen wordt vergroot.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare kwantitatieve resultaten voor de lengte van cholinerge vezels om een betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Faciliteert de gereedheid van de assay door gedefinieerde parameters voor sectiebehandeling, kleuring en stereologiesoftware voor schaalbare screening.
- Wetenschappelijke waarde: Levert metrieken voor lengtedichtheid en de foutcoëfficiënt ter ondersteuning van de datakwaliteit en de vergelijkbaarheid tussen studies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Toont de relevantie voor de ziekte aan door een verminderde lengte van cholinerge vezels in transgene modellen te koppelen aan neurodegeneratieve fenotypes.
- Operationele waarde: Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via een consistente kwantificering van de vezellengte over verschillende genotypes.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door significant vezelverlies te identificeren zonder storende volumewijzigingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows om target engagement in cholinerge pathways te beoordelen, wat de identificatie van lead-verbindingen ondersteunt via kwantitatieve read-outs van de axonale integriteit.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van cholinerge degeneratie via onbevooroordeelde 3D-schatting van de vezellengte in ziekterelevante hersenregio's.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door gestandaardiseerde weefselverwerking, immunokleuring en stereologische probe-instellingen voor reproduceerbare vezelmetingen.
- Analytics: Levert outputs voor vezellengte, lengtedichtheid en foutcoëfficiënt om kwantitatieve vergelijkingen tussen experimentele condities mogelijk te maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op preklinische continuïteit door vezelverlies te valideren als een biomarker die in lijn is met neurodegeneratieve progressie.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het kwantificeren van elk lineair neuraal of vasculair profiel, waardoor de bruikbaarheid buiten cholinerge systemen wordt uitgebreid.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door vroege axonale degeneratie te detecteren, waardoor mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie wordt verminderd.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door gedefinieerde stereologieprotocollen en softwaregebaseerde, onbevooroordeelde fractionering.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege biomarkergegevens te leveren, wat de kapitaalefficiëntie verhoogt en biologische risico's in een laat stadium vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van veranderingen in vezellengte, wat beslissingen over verdere ontwikkeling in neurodegeneratieve pipelines ondersteunt.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in stereologie, immunohistochemie en confocale of brightfield-microscopie voor nauwkeurige vezelmarkering.
- Afhankelijk van stereologiesoftware die in staat is tot space ball-probe-analyse en een microtoom voor consistente secties van 30 micrometer.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor fixatie, sectie-interval (elke achtste sectie) en probe-instellingen (10µm sfeer-diameter) voor reproduceerbaarheid.
- Vereist validatie van de aanpassing bij toepassing op andere lineaire profielen, zoals dopaminerge vezels of vasculaire profielen, vanwege verschillen in labelingsdichtheid.
- Beperkt door weefselkwaliteit en kleurconsistentie, welke een directe invloed hebben op de vezeldetectie en de acceptabiliteit van de foutcoëfficiënt.
