Meten van microbiële mutatie snelheden met de fluctuatie test

Het protocol maakt mutatieschatting in microben mogelijk. Het kan aantonen hoe een organismen milieucontext de waarschijnlijkheid van spontane mutatie beïnvloedt. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het goedkoop en efficiënt is.

Veel schattingen van de mutatiesnelheid kunnen parallel worden gemaakt. Mutaties die dit protocol meet kunnen resistentie tegen antibiotica volgen. Dit protocol kan gebruikt worden om een van 's werelds grootste uitdaging te bestuderen, antimicrobiële resistentie.

Deze methode kan inzicht geven in hoe cellen ecologische context de evolutie van antimicrobiële resistentie kunnen beïnvloeden. Dit protocol schat mutatiesnelheden in de monocultuur van laboratoriumstam, maar we hebben het toegepast op klinische stammen en co-cultuur van twee stammen om bioneutraal molecuul te onderscheiden. De meest gevaarlijke reacties die in dit protocol worden gebruikt zijn antibiotica rifampicine en methanol.

Dus zorg ervoor dat u beschermende handschoenen en brillen te gebruiken wanneer rifampicine is opgelost in methanol. Om te beginnen inenten met deze procedure drie mL vloeibare lysogeny bouillon met een schaafwond van ijs uit de E.coli K12 glycerol voorraad. Schud de LB-cultuur bij 120 tpm en bij 37 graden celsius gedurende ongeveer zeven uur.

Verdun hierna de cultuur 2000-voudig met de zoutoplossing. Voeg 10 mL vloeibare Davis minimale medium aan elke buis met elk met een andere concentratie van glucose zoals hier getoond. Voeg 100 microliters van de verdunde cultuur toe aan drie 50 mL screen cap conische onderste polymeerbuizen.

Bereid 22 mL van vijf verschillende oplossingen van vloeibare Davis minimale medium met glucose, elk in zijn eigen 50 mL buis als overzicht in het tekstprotocol. Om inocula voor te bereiden op de omgevingen, meet eerst de optische dichtheid van de nachtelijke culturen op 600 nanometer. Verdun de culturen met zoutoplossing en voeg tussen 2200 en 110000 cellen toe aan elke omgeving.

Dit zal ervoor zorgen dat het entmateriaal voor één mL van de omgeving tussen 1000 en 5000 cellen bevat. Maak vervolgens een willekeurige lay-out van parallelle culturen voor 196 diepe put plaat. Breng een mL van de ingeënte media in elke put van de plaat volgens de lay-out.

Bevestig vervolgens het deksel van de plaat met tape en weeg de hele plaat met het deksel en tape. Schud de plaat bij 250 tpm en bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Plaats hierna twee L gedestilleerd water in de couveuse om de hoeveelheid verdamping in de experimentele sets te stabiliseren.

Bepaal de inoculumgrootte door 10 microliter van elk van de ingeënte media op een niet-selectieve TA agar-plaat te beplating. Gebruik een steriele L-vormige strooier tot het agaroppervlak droog is. Bereid vervolgens selectieve TA agar met rifampicin in zes putplaten.

Pipette vijf mL van selectieve TA agar in elke put van de zes putplaten. Tel de kolonie vormende eenheden op de niet-selectieve agar platen, en bepalen van de grootte inocula. Na 24 uur van incubatie, wegen de gehele diepe put plaat om de hoeveelheid verdamping te bepalen, die waarschijnlijk rond 10%Breng drie willekeurig gekozen culturen per test in gelabelde microcentrifuge buizen.

Plaat de resterende 81 parallelle culturen van de diepe put plaat op de selectieve TA agar met rifampicin. Verwijder vervolgens de deksels van de selectieve agarplaten en laat ze in steriele omstandigheden aan het licht komen om alle vloeistof op het oppervlak van de agar uit te drogen. Bepaal het aantal kolonievormende eenheden door de culturen uit de microcentrifugebuizen te verdunnen met behulp van vijf 10-voudige verdunningsstappen door 900 microliters zoute oplossing te mengen en te wervelen met 100 microliters van de kweek per verdunningsstap.

Plaat 40 microliter van de uiteindelijke verdunning op de niet-selectieve TA agar en plaats het deksel op de platen. Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. Zodra alle putten op een zes put plaat vrij zijn van de cultuur vloeistof, plaats het deksel terug op.

Dan incubeer de platen met het deksel op op 37 graden Celsius voor 44-48 uur. Op dag vier, tel de kolonie vormen eenheden op de niet-selectieve agar platen. Op dag vijf, tellen het aantal kolonies die resistent zijn tegen het antibioticum op de selectieve TA agar platen.

Noteert de verdeling over parallelle culturen van het waargenomen aantal mutanten voor een bepaalde test. Open de juiste software op de computer. Laat in het tabblad hypothesetests de waarden op hun standaardwaarden staan.

Klik op bladeren en selecteer het tekstbestand met de verdeling van de waargenomen mutanten. Na het uploaden van het bestand, klik op uitgevoerde test. Aan de rechterkant, onder het resultaat van de test, onder de One Sample ML-test, vind het mutatienummer.

Dit is m, het verwachte aantal mutatie-voorvallen. Schat vervolgens de mutatiesnelheid van bepaald genotype in een bepaalde omgeving als overzicht in het tekstprotocol. De MG1655 mutatiepercentages van drie verschillende fenotypische markers, cycloserine, rifampicine en nalidixic zuur worden hier weergegeven.

Mutatiepercentages worden beoordeeld in Davis minimaal medium met glucoseconcentratie van 80 mg/L, 125 mg/L en 250 mg/L. In één geval wordt een glucoseconcentratie van 1000 mg/L gebruikt. Zoals verwacht zijn de mutatiepercentages hoger voor cycloserineweerstand, het laagst voor nalidixïnezuurweerstand en de snelheid van rifampicineresistentie is in het midden.

De fluctuatietest laat duidelijk zien welke stam een constitutieve mutator is en welke normale mutatiesnelheden heeft. Aangezien de mutT deletant stam had een mutatie snelheid om nalidixic zuur resistentie die ongeveer 50x hoger is dan de controle MG1655 stam. Tijdens het voorvormen van dit protocol, zorg ervoor dat uw cellen goed groeien.

Ze moeten groeien tot uniforme dichtheid in parallelle culturen met dezelfde omgeving. Een follow-up van deze procedure is het bepalen van de DNA-sequentie van het rpoB-gen in resistente kolonies. Om te bepalen hoe het spectrum van mutaties tot rifampicineresistentie varieert met milieumicrobiële genotype.

Fluctuatietesten in de 20e eeuw toonden aan hoe mutatie spontaan en willekeurig is met respect voor het milieu. Nu werpen ze nieuw licht op hoe mutatiepercentages variëren met het milieu genetisch, ecologisch, zelfs sociaal.