Name: In vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde Muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Leer hoe je een genetisch gemanipuleerde muizen hoofd- en nekkanker cellijn opzet met een AAV-Cas9 systeem. Dit protocol vereenvoudigt de ontwikkeling van kankermodellen voor onderzoek naar genmutaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Daniel Gitler bedanken voor het verstrekken van de pAd Delta 5 helper plasmide. Dit werk werd gefinancierd door de Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (voor mij), de Stichting voor Binational Science van de Verenigde Staten (BSF, 2017323) (voor mij en mevrouw), de Israëlisch Kankervereniging (ICA, 20170024) (voor mij), de Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (voor mij) en de Stichting zorg (#7895) (voor mij). Fellowship: de Alon Fellowship voor mij en BGU Kreitman beurzen naar SJ en MP.

Deze studie werd goedgekeurd door de Ben Gurion University van het Negev Animal Care and use Committee. Dierproeven werden goedgekeurd door het IACUC (IL. 80-12-2015 en IL. 29-05-2018 (E)). Alle aspecten van dierproeven, huisvesting en omgevingsomstandigheden die in deze studie worden gebruikt, waren in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren13.
1. adeno-geassocieerde virus productie
<ol><li>Dag 1: celkweek<ol>
<li>Zaad 4 x 106 HEK293T cellen per 14,5 cm plaat in 15 ml DMEM. Bereid 10 platen voor Transfectie met polyethylenimine (PEI) (1 μg/μL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dag 2: transfectie van HEK293T cellen met behulp van PEI<ol>
<li>Verwijder media en voer met warme DMEM 1 h voor de transfectie.</li>
		<li>Prewarme trans fectie reagentia en DMEM.</li>
		<li>Gebruik 10 μg van de belangstelling die AAV ITR bevat (AAV pCM109 EFS CRE SG APC SG KRAS SG P53-KRAS HDR), 10 μg van de AAV 2/9n capside plasmide (met het rep-gen van AAV2 en het GLB-gen van AAV9, en 10 μg van de helper plasmide (pAdDelta F5 helper) per plaat (Zie tabel van de materialen). Opmerking: een nieuwe generatie helper plasmide-pAdDeltaF614,15,16 die ook kan worden gebruikt voor Aav-productie is beschikbaar.</li>
		<li>Meng de plasmiden in 1 mL gewone DMEM per plaat. Voeg vervolgens 90 μL polyethylenimine (totale plasmide: PEI-concentratie = 1:3) toe aan het plasmide mengsel en Vortex kort.</li>
		<li>Inbroed de PEI-plasmide DNA mix gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Voeg de mix druppelsgewijs bovenop de HEK293T cellen toe en breng de platen over naar de celkweek incubator bij 37 °c met 5% Co2 voor 24 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dag 3: gemiddelde verandering na transfectie<ol>
<li>Verwijder het medium volledig en voeg 15 mL verse DMEM toe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dag 5: het virus oogsten<ol>
<li>Maak een droogijs/ethanol bad.</li>
		<li>Verzamel de cellen met een celscraper en breng ze over in 50 mL tubes (2 platen per 50 mL Tube).</li>
		<li>Spin buizen bij 800 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Gooi de supernatant van alle buisjes weg. Voeg slechts 0,5 mL lysisbuffer (150 mM NaCl, 50 mM tris-HCl, pH = 8,5) per plaat (d.w.z. 5 mL voor 10 platen) toe aan de eerste buis. Respendeer de cellen en breng het totale volume over naar de volgende buis en ga door tot de laatste buis.</li>
		<li>Breng de celsuspensie over naar een nieuwe tube van 50 mL. Was de buisjes met hetzelfde volume lysisbuffer (0,5 mL per plaat) met dezelfde overdrachtsmethode als beschreven in stap 1.4.4.</li>
		<li>Onderwerp de celsuspensie tot drie rondes van ~ 10 min bevriezen/ontdooien cycli tussen een droogijs/ethanol bad en een 37 °C waterbad. Vortex kort na elke ontdooiing.</li>
		<li>Als de zuivering op dezelfde dag wordt uitgevoerd, stelt u de equilibratie en elutie buffer (Zie tabel 1 voor het recept) bij RT in.</li>
		<li>Voeg 50 eenheden benzonase per plaat toe en inincuberen bij 37 °C voor 1,5 h. Opmerking: Benzonase wordt gebruikt om residuele nucleïnezuren te verteren van de ontvangende producenten cellen en het plasmide DNA dat aanwezig is in de celsuspensie.</li>
		<li>Draai de buisjes op 3.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c.</li>
		<li>Verzamel de supernatant in een spuit met behulp van een 18 G stalen naald en duw de oplossing door een 0,45 μm filter in een buis van 15 mL om het ruwe lysaat te verkrijgen.</li>
		<li>Bewaar het ruwe lysaat gedurende enkele weken bij 4 °c tot de zuivering of voortzetting van de zuivering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. AAV-zuivering
<ol><li>Dag 5 of nieuwer<ol>
<li>Plaats de equilibratie-en elutie buffer op RT.</li>
		<li>Waschromatografie kolommen met 10 mL van de equilibratie buffer.</li>
		<li>Voeg 0,5 mL heparin-agarose toe aan kolom17 en voeg vervolgens de evenwichts buffer (4x het volume van de heparin-agarose) toe. Meng de oplossingen door de kolom om te inverteren en laat de agarose sediment.</li>
		<li>De equilibratie buffer uit de kolom door de zwaartekracht elzen. Opmerking: laat een evenwichts buffer achter om te voorkomen dat de agarose uitdroogt.</li>
		<li>Laad het ruwe lysaat op de kolom en incuberen gedurende 2 uur bij 4 °C met constante opwinding. Breng de kolom in een rechtopstaande positie en laat de agarose bezinksel.</li>
		<li>Het ruwe lysaat door de zwaartekracht elzen.</li>
		<li>Was de kolom met een equilibratie buffer (4x het volume van de heparin-agarose).</li>
		<li>Plaats een 100 kDa centrifugale proteïne filter onder de kolom en elueer het virus met behulp van een eleierbuffer (3x het volume van de heparine-agarose) in het filter. NB: de elutie buffer mag niet groter zijn dan 15 mL.</li>
		<li>Centrifugeer het filter op 3.000 x g gedurende ~ 30 min totdat er minder dan 1 ml in het filter is achtergelaten.</li>
		<li>Vul het filter met PBS en centrifugeer bij 3.000 x g gedurende ~ 30 min tot minder dan 1 ml in het filter. Herhaal deze stap 2x om alle zouten te verwijderen.</li>
		<li>Concentreer de virusoplossing in het filter door centrifugeren op 3.000 x g om een zo klein mogelijk volume te bereiken (minder dan 200 μL).</li>
		<li>Aspirate het virusoplossing met een naald en spuit en duw de oplossing door een 0,22 μm filter in een buis.</li>
		<li>Maak aliquots van geconcentreerde virale deeltjes voor opslag. Opmerking: de aliquots moeten ~ 20 μL zijn voor kortdurende opslag bij 4 °C en ~ 5 μL voor langdurige opslag bij-80 °C.</li>
		<li>Bepaal de efficiëntie van de virale titer en de virale transductie, zoals eerder beschreven14,18,19,20.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. isolatie en cultuur van primaire cellen
<ol><li>Dag 1<ol>
<li>Euthanaseren een 6-weekse-oude man of vrouw B6; 129-gt (Rosa) 26sorTM1 (CAG-cas9 *,-EGFP) fezh/j door co2 verstikking of enig ander iacuc goedgekeurd protocol. Opmerking: deze muizen CRISPR/Cas9 Knockin hebben CRE of-afhankelijke expressie van Cas9 endonuclease en EGFP, geregisseerd door een CAG-promotor. De upstream Lox-stop-Lox-sequentie (LSL) die aanwezig is in het genoom van deze muizen, verhindert de expressie van Cas9 en EGFP bij afwezigheid van CRE of. Bij gebruik in combinatie met enkelvoudige geleiderrna's (sgRNAs) en een CRE-bron, kunnen ze enkelvoudige of meervoudige muis genen in vivo of ex vivo14bewerken.</li>
		<li>Ontleden de tong van de geëeuthaniseerde muizen met behulp van een chirurgische schaar.</li>
		<li>Het weefsel handmatig ontkoppelen door het weefsel van de tong te hakken in zeer kleine fragmenten met behulp van een scalpel. Verzamel de weefsel fragmenten in een buis van 15 mL met 4,5 ml RPMI Plain medium (met uit serum).</li>
		<li>Voeg de drievoudige enzym mix (200 μl) (Zie tabel 1 voor het recept) toe aan de weefsel fragmenten.</li>
		<li>Inbroed de weefselenzym mix bij 37 °C gedurende 30 minuten en tik elke 10 minuten op de buis om enzymatische dissociatie van het weefsel te verbeteren.</li>
		<li>Voeg 5% foetaal runderserum (FBS) met HBSS/PBS toe aan de weefselenzym mix om de enzym actie te stoppen.</li>
		<li>Filtreer de bovenstaande celsuspensie door een steriel 70 μm nylon gaas om de verspreide cellen en grotere weefsel fragmenten te scheiden.</li>
		<li>Was de gefilterde celsuspensie door centrifugeren voor 300 x g gedurende 5 min in HBSS/PBS bij RT.</li>
		<li>Respendeer de pellet in kweekmedium (10% FBS in RPMI/DMEM) en kweek in 60 mm cultuur gerechten totdat er verschillende celkolonies worden gevormd.<ol>
<li>Cultuurcelaggregaten worden bovenop het filter bewaard in een kweek schaal van 60 mm met 3 mL complete media (10% FBS in RPMI/DMEM) totdat celkolonies worden gevormd.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Microscopisch onderzoeken van de primaire cellen voor de aanwezigheid van fibroblast besmetting na 1 week van de cultuur. Behandel de primaire cellen die zijn ontwikkeld uit aggregaten en celsuspensies met 0,25 trypsine 0,02% EDTA-oplossing bij 37 °C gedurende 1 minuut om fibroblasten te verwijderen. Opmerking: meestal produceert de primaire cultuur van celaggregaten meer kolonies in vergelijking met eencellige suspensies. De cellen uit deze kolonies bieden een betere transductie-efficiëntie met AAV-transductie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. AAV-transductie van primaire cellen
<ol><li>Dag 10<ol>
<li>Zaad 2 x 105 primaire cellen per put in 6 put platen in 2 ml van de volledige media (10% FBS in rpmi/DMEM).</li>
		<li>De volgende dag, de cellen met 1012 virale genoom/ml (1010 transducing eenheden/ml) en inbroed de cellen in virale deeltjesbevattende media voor 48 h bij 37 ° c.</li>
		<li>Verwijder de virale deeltjesbevattende media en voer de AAV-transduced-cellen met volledige media. Opmerking: alleen cellen die de transductie onderging, zullen GFP uitdrukken en beginnen te vermenigvuldigen. Cellen die geen transductie ondergaan zullen uiteindelijk sterven binnen 2 weken.</li>
		<li>Na 2 weken van cultuur expansie, zaad de cellen voor validering en de in vivo tumorigene experimenten. Opmerking: genomische DNA fromAAV-transduced cellen en normale primaire cellen van Cas9 muizen werden geëxtraheerd voor het valideren van specifieke genoom bewerking met behulp van standaardprotocollen. De volgorde van het geëxtraheerde DNA en de analyse van de gesequentieerde gegevens (tabel 2) werden uitgevoerd met behulp van een hybridisatie op afvang gebaseerde sequentie test van de volgende generatie (BIJV. msk-impact platform) zoals eerder beschreven21.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. valideren van de transformatie van normale cellen naar tumorigene cellen met behulp van immunofluorescentie en Western blotting
<ol><li>Immunofluorescentie<ol>
<li>Zaad 2 x 105 cellen op 12 mm glas dekstroken en plaats ze in een incubator 's nachts.</li>
		<li>Repareer cellen in 4% Paraformaldehyde in PBS (pH = 7,4) en proces voor immunofluorescentie labeling.</li>
		<li>Inincuberen de vaste cellen met het eerste primaire antilichaam in 1% BSA of 1% serum in PBST in een bevoficeerde kamer gedurende 1 uur bij RT of 's nachts bij 4 °C. De primaire antilichamen die worden gebruikt zijn het konijn monoklonaal anti-KRT 14, konijn monoklonaal anti-E-cadherin antilichaam, en Cas9 muis mAb.</li>
		<li>Verwijder de primaire antilichaam oplossing uit de dekstroken door de cellen 3x gedurende 5 minuten te wassen met 1x PBS.</li>
		<li>Inbroed de cellen met Cy3 ezel anti-konijn IgG en/of Cy3 geit anti-muis IgG secundaire antilichamen in 5% BSA in PBST gedurende 1 uur bij RT in het donker.</li>
		<li>Verwijder de secundaire antilichaam oplossing uit de dekstroken en was de cellen 3x zoals beschreven in stap 5.1.4.</li>
		<li>Monteer de afdek stroken met een druppel afdekmedium dat DAPI bevat (DAPI-Fluoromount).</li>
		<li>Bewaren in het donker bij 4 °C totdat de glaasjes met fluorescentiemicroscopie worden afgebeeld.</li>
	</ol></li>
	<li>Western blotting<ol>
<li>Zaad 1 x 106 getransformeerde cellen in een kweek schaal van 100 mm en plaats ze 's nachts in een incubator.</li>
		<li>Was en schrak de getransformeerde cellen in 200 μl ijskoude PBS.</li>
		<li>Centrifugeer de buis met de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 2.000 x g bij 4 °c om de cellen te pellet.</li>
		<li>Aspireren de supernatant en Lyse de cellen met behulp van lysisbuffer (Zie tabel 1) met cocktails van de fosfatase remmer en een proteaseremmer gedurende 10 minuten bij 4 °c. Centrifugeer de lysaten gedurende 10 minuten bij 10.000 x g en 4 °c en verzamel de geklaste lysaten.</li>
		<li>Gebruik een in de handel verkrijgbare Bradford assay kit om de eiwitconcentratie te bepalen volgens het Protocol van de fabrikant. Gebruik 4x sample buffer (500 mm tris pH = 6,8, 40% glycerol, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% broomfenolblauw) om de eiwit monsters aan te passen aan 0,5 of 1 μg/μL. kook bij 96 °c gedurende 5 minuten. Opmerking: de monsters kunnen worden bewaard bij-80 °C of totdat een Western Blot-analyse wordt uitgevoerd.</li>
		<li>Scheid gelijke hoeveelheden van het totale lysaat (30 μg) met 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE). Zorg ervoor dat de kleurstof de bodem van de gel bereikt. Breng het eiwit over naar het nylon membraan door half droog te blotting bij 25 V gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Giet 5% BSA in tris-gebufferde zoutoplossing (TBS)-0,1% tween (TBST) over het membraan om het volledig te bedekken. Blokkeer het membraan voor 1 uur bij RT. Inbroed de mebrane met primaire antilichamen (anti-CRE, anti-Cas9, anti-GFP, anti-β-bovendeel, anti p53, anti-fosho-ERK, en anti-β actine verdund in 5% BSA TBST) bij 4 °C 's nachts.</li>
		<li>Na incubatie, was de membranen 10 min met 1x TBST om ervoor te zorgen dat de oplossing het membraan volledig bedekt. Voer deze Wash 3x uit en voeg vervolgens mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam (verdund 1:10000 in 5% BSA TBST) toe aan het membraan. Incuberen gedurende 1 uur bij RT.</li>
		<li>Na incubatie, was de membranen 10 min met 1x TBST om ervoor te zorgen dat de oplossing het membraan volledig bedekt. Voer de chemiluminescentie-Imaging uit (Zie tabel met materialen) om de banden zichtbaar te maken, en leg afbeeldingen dienovereenkomstig vast.</li>
	</ol></li>
	<li>Valideren van het tumorigene potentieel van getransformeerde cellen in immunocompetente muizen Opmerking: muizen werden onderhouden en behandeld volgens de institutionele richtlijnen van de Ben-Gurion Universiteit van de Negev. Knik. CB17-Prkdc-scid/NCr HSD (NOD. SCID) en C57BL/6 muizen werden gebruikt voor de in vivo studies. Muizen werden gehuisvest in lucht-gefilterde laminaire flow kasten met een 12 uur licht/donkere cyclus en werden gevoed voedsel en water ad libitum.<ol>
<li>Gebruik 6-8 week-oude vrouwelijke NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr HSD (NOD. SCID) en C57BL/6 muizen voor de studie.</li>
		<li>Trypsinize de AAV-Cas9 getransformeerde cellen. Stop de trypsinisatie met behulp van DMEM voorverwarmde bij 37 °c en verzamel in een tube van 50 ml.</li>
		<li>Centrifugeer de buis bij 800 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en regeer de celpellet in DMEM medium zonder FBS. Voer de centrifugeren opnieuw uit en regeer de celpellet in 1x PBS. Opmerking: Houd de cellen niet te lang in 1x PBS. Houd de celsuspensie altijd op ijs om celklontering te voorkomen.</li>
		<li>Gebruik een automatische celteller om de cellen te tellen en de cellen te verdunnen tot de gewenste concentratie (2,5 x 107 cellen/ml) met 1x PBS. Tumoren genereren door middel van een subcutane injectie van de AAV-Cas9 getransformeerde celsuspensie in de rechterflank van elk KNIPOOG. CB17-Prkdc-scid/NCr HSD (NOD. SCID) muis (2 x 106 cellen/muis). Om een orthotropisch model in syngene muizen te genereren, injecteert u 0,5 × 106 primaire cellen of de Aav-Cas9 getransformeerde cellen in de tong van C57BL/6 immunocompetente muizen.</li>
		<li>Euthanaseren de dieren 2 weken postinjection door co2 asphyxiation, en ontleden de tumoren van de inslapen muizen voor immunohistochemie analyse.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Reyes-Gibby, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+genes+associated+with+neuropathy+in+patients+with+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8789(2018).</li>
<li>Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+molecular+genetics+of+head+and+neck+cancer+through+genome-wide+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches.</a> Genes & Diseases. 1 (1), 75(2014).</li>
<li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).</li>
<li>Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetic+alterations+and+their+impact+on+target+therapy+response+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Management+and+Research%22%5BJournal%5D)">Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).</li>
<li>Im, W., Moon, J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+CRISPR%2FCas9+for+Gene+Editing+in+Hereditary+Movement+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders.</a> Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cell+lines+and+human+tumors%3A+a+rational+approach+to+preclinical+model+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%3A+MCR%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection.</a> Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).</li>
<li>AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AACR+Project+GENIE%3A+Powering+Precision+Medicine+through+an+International+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium.</a> Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).</li>
<li>Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+update+on+cancer%3A+molecular+oncology+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer.</a> Cell Death & Disease. 5 (1), e1018(2014).</li>
<li>Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+RAS+oncogene+mutation+in+head+and+neck+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas.</a> The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).</li>
<li>Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+transduction+efficiencies+of+unmodified+and+tyrosine+capsid+mutant+AAV+vectors+in+vitro+using+two+ocular+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines.</a> Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).</li>
<li>Smith-Arica, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+Efficiency+of+Human+and+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+Using+Adenoviral+and+Adeno-Associated+Viral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors.</a> Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).</li>
<li>Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">AAV Vectors.</a> Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).</li>
<li>Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals%22">Guide for the care and use of laboratory animals</a>. , National Academy Press. (1996).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+ligand-dependent+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes+by+adeno-associated+virus+vectors+in+vivo%3A+role+of+immature+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells.</a> Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).</li>
<li>Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Highly+Infectious+and+Pure+Adeno-Associated+Virus+Type+2+Vectors+with+a+Single-Step+Gravity-Flow+Column%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column.</a> Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+Type+2+Reference+Standard+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1273(2010).</li>
<li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).</li>
<li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-packaging+of+a+single+adeno-associated+virus+%28AAV%29+type+2+vector+genome+into+multiple+AAV+serotypes+enables+transduction+with+broad+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity.</a> Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).</li>
<li>Cheng, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memorial+Sloan+Kettering-Integrated+Mutation+Profiling+of+Actionable+Cancer+Targets+%28MSK-IMPACT%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT).</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).</li>
<li>Sun, H., Taneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Transformation+and+Tumorigenicity+Using+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).</li>
<li>Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Embryo+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3854(2012).</li>
<li>Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Human+and+Murine+Fibroblasts+without+Viral+Oncoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464(2005).</li>
<li>Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+transformation+of+mouse+embryo+fibroblasts+in+the+absence+of+activator+E2Fs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs.</a> Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).</li>
<li>Leong, H., Blewitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus+Mediated+Malignant+Transformation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).</li>
<li>Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+an+immortalized+oral+keratinocyte+cell+line+of+mouse+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin.</a> Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).</li>
<li>Badarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+AXL+expression+by+AP-1%2FJNK+blockage+overcomes+resistance+to+PI3Ka+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy.</a> JCI Insight. 5, 125341(2019).</li>
<li>Chen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+of+mouse+oral+carcinoma+cell+lines+derived+from+transgenic+mice+and+their+use+as+syngeneic+tumorigenesis+models%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models.</a> BMC Cancer. 19 (1), 281(2019).</li>
<li>Hoover, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Human+Papillomavirus+16+E6+in+Anchorage-Independent+and+Invasive+Growth+of+Mouse+Tonsil+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Otolaryngology-Head+%26+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium.</a> Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495(2007).</li>
<li>Smahel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+MHC+class+I-negative+mouse+cells+derived+by+transformation+with+human+papillomavirus+type+16%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16.</a> British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Growth+of+a+Newly+Established+Mouse+Epithelial+Cell+Line+Transformed+with+HPV-16+E7+in+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice.</a> PloS One. 11 (10), e0164490(2016).</li>
</ol>

M.S. is in de adviesraad van het Instituut voor biowetenschappen, en Menarini ricerche heeft onderzoeksgelden ontvangen van Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics en Menarini ricerche. M.S. is ook medeoprichter van Medendi Medical Travel, en heeft in de afgelopen 2 jaar honorarium gekregen van Menarini ricerche en ADC Pharma. Alle andere auteurs hebben niets te onthullen.

Verschillende methoden zijn eerder gebruikt om primaire cellen in cultuur te transformeren met variabele mate van succes25,26,27,28. De meeste van deze methoden gebruiken muis fibroblast cellen voor transformatie14,17,18,19 of gebruik carcinogenen zoals 4-nitroquinoli...

HNC is een gemeenschappelijke maligniteit wereldwijd1. Het modelleren van de Genesis van HNC neoplasie is momenteel op een wetenschappelijk draaipunt2. Hoewel veel genetische mutaties zijn geïdentificeerd in HNC2,3,4 (bijvoorbeeld TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 en RAS), zijn de specifieke combinaties van genomische aanpassingen die nodig zijn in het concert om HNC te induceren onduidelijk.
Het huidige gebruik van menselijke HNC cellijnen heeft aanzienlijk geholpen om de mechanismen in verband met pathogenese en behandeling3te verhelmaken. Echter, de studie van menselijke cellijnen in immuungecompromitteerde Murine systemen heeft zijn beperkingen, omdat deze systemen niet het in vivo neoplastische proces, de rol van specifieke genmutaties en behandeling reacties in een immuunmicroomgeving aanpakken. Vandaar dat de ontwikkeling en oprichting van muriene cellijnen met specifieke genetische veranderingen van primair belang zijn om te bestuderen hoe verschillende genen bijdragen aan het transformatieproces en om nieuwe op moleculen gebaseerde therapieën te testen in immunocompetente muizen.
Genfunctie studies in biomedisch onderzoek zijn significant beïnvloed door vooruitgang in DNA-bewerkings technologieën, door het introduceren van Double-strand Breaks (DSBs), bijvoorbeeld5. Deze technologieën, waaronder het gebruik van zink vinger nucleasen, transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen, en geclusterde regulatoire intergespreide korte palindroom herhalingen (CRISPR/Cas9), maken het mogelijk om een gen van belang op zijn Locus te manipuleren. De laatste CRISPR/Cas9 systemen bestaan uit een RNA Guide (gRNA) die de Cas9 Nuclease leidt om een DSB op een specifieke plaats in het genoom te genereren. Dit systeem heeft uitgebreide erkenning gekregen in het wijzigen van endogene genen in een cel of doelweefsel, zelfs in de meest traditioneel moeilijk te behandelen organismen5. Het heeft meerdere voordelen ten opzichte van andere systemen vanwege de eenvoud, snelheid en efficiëntie.
In oncologie heeft CRISPR/CAS9 technologie de noodzaak vervuld om kankercellen effectief te imiteren. Om dit systeem in HNC te vestigen, hebben we het potente kras-oncogen en twee belangrijke tumor suppressor genen, APC en p536gemanipuleerd. Volgens de GENIE database7, deze combinatie is zeldzaam in HNC. RAS-mutaties (HRI'S, NRI'S en KRAS) zijn aanwezig in slechts ~ 7% van alle HNC-populaties. Deze tumoren zijn meestal resistent tegen therapie8,9.
De levering van Cas9 en zijn gRNA wordt bereikt door middel van virale transductie met behulp van AAVs of lentivirussen. Recombinant AAV is vaak de voorkeursmethode voor het leveren van genen om cellen te targeten vanwege de hoge titer, milde immuunrespons, het vermogen om een breed scala aan cellen te leiden en de algehele veiligheid. Met behulp van een AAV-systeem zijn verschillende Weefselspecifieke cellijnen gegenereerd en worden er nog steeds nieuwe cellijnen ontwikkeld10,11,12. Echter, een efficiënte genomische editing systeem dat kan genereren Murine HNC cellijn modellen cellen nog moet worden ontwikkeld. In deze studie hebben we getracht een in vitro Aav-Cas9 gebaseerd systeem te ontwikkelen voor het transformeren van primaire muriene tong cellen in een tumorigene toestand. Dit unieke CRISPR/Cas9 transformatie protocol en de vastgestelde tumor cellijn kan worden gebruikt om de biologie van HNC geïnduceerd door een diversiteit van genomische veranderingen beter te begrijpen.

<table><tbody><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti muis HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-146</td><td></td></tr><tr><td>Anti konijn HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-152</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 Muis mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>14697</td><td></td></tr><tr><td>Cre</td><td>BioLegend</td><td>900901</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Geit Anti-Muis IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-062</td><td></td></tr><tr><td>Cy-AffiniPure Geit Anti-Konijn IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-165-144</td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9996</td><td></td></tr><tr><td>Phosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>Konijn monoklonaal anti E cadherin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3195S</td><td></td></tr><tr><td>Konijn monoklonaal anti-KRT 14</td><td>Abcam</td><td>AB-ab181595</td><td></td></tr><tr><td>&beta; actine</td><td>MP Biomedicals</td><td>691001</td><td></td></tr><tr><td>&beta; cateniene</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9582S</td><td></td></tr><tr><td>Cellijnen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK93T</td><td>ATCC</td><td><a href="https://www.atcc.org/en/Products/All/CRL-3216.aspx" target="_blank">CRL-3216</a></td><td></td></tr><tr><td>Kweekmedia, chemicaliën en reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagens</td><td>Bio-Rad</td><td>30015484</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Amresco</td><td>0332-TAM-50G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>ECL (Westar Supernova en Westar Nova 2.0)</td><td>Cyanagen</td><td>XLS3.0100 en XLS071.0250</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Heparine - Agarose</td><td>Sigma</td><td>H6508</td><td></td></tr><tr><td>Isolate II Genomisch DNA Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-52066</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Panreac AppliChem</td><td>300283</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Lab Ltd</td><td>1903059100</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Solution</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase remmercocktail</td><td>Biotool</td><td>B15001A/B</td><td></td></tr><tr><td>Protease remmercocktail</td><td>MilliporeSigma</td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>MERCK Millipore</td><td>648311-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Enzymen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>03-050-1B</td><td></td></tr><tr><td>Glaswerk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Bar Naor</td><td>BNCB00130RA1</td><td></td></tr><tr><td>Glazen plaatjes</td><td>Bar Naor</td><td>BN9308C</td><td></td></tr><tr><td>Muizenstammen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J</td><td>Jackson labs</td><td>24857</td><td></td></tr><tr><td>NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmiden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR</td><td>Broad Institute of MIT</td><td></td><td>Vriendelijk geschonken door Dr Randall J Platt en Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA</td></tr><tr><td>AAV 2/9 capsid vector</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td></td></tr><tr><td>pAD Delta F5 helper</td><td>Ben Gurion University of the Negev</td><td></td><td>Verstrekt door Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, en Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israël.</td></tr><tr><td>Kunststofwerk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon-ULTRA filter 100 KDa</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro;m steriele filters, 4 mm</td><td>Millex</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro;m steriele filters, 13 mm</td><td>Millex</td><td>SLHV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Kweekplaten</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-cas9 systeem

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

Het gebruik van primaire, normale epitheelcellen maakt het mogelijk om voor cellulaire transformatie genomische veranderingen te induceren door specifieke mutaties in oncogenen en tumor suppressor-genen te introduceren, met behulp van geclusterde regelgevende intergespreide korte palindroom herhaalde (CRISPR)-gebaseerde genoom bewerkingstechnologie in muizen. Deze technologie stelt ons in staat om de genetische veranderingen die zich voordoen bij menselijke kankers met muizen, nauwkeurig na te bootsen. Door het genetisch transformeren van muriene primaire cellen kunnen we de ontwikkeling van kanker, progressie, behandeling en diagnose beter bestuderen. In deze studie gebruikten we CRE-inducible Cas9 muizen tong epitheelcellen om genoom bewerking mogelijk te maken met behulp van adeno-geassocieerde virus (AAV) in vitro. Specifiek, door het veranderen van kras, p53, en APC in normale tong Epitheelcellen, we gegenereerd een Murine hoofd en nekkanker (HNC) cellijn in vitro, die tumorigene in syngene muizen. De hier gepresenteerde methode beschrijft in detail hoe HNC cellijnen te genereren met specifieke genomische veranderingen en verklaart hun geschiktheid voor het voorspellen van tumorprogressie in syngene muizen. We stellen voor dat deze veelbelovende methode informatief en nuttig zal zijn om de tumor biologie en de therapie van HNC te bestuderen.

Het AAV-systeem gebruiken om normale Cas9 cellen te transformeren Figuur 1 geeft een gedetailleerde vectorkaart van de Aav transgen plasmide die in deze studie wordt gebruikt. Figuur 2 schetst het ontwerp en de werking van het Aav-Cas9-systeem. Om virale deeltjes te produceren, werden de HEK293T cellen met de Aav transgen vector en andere virale verpakkings vectoren met behulp van de Pei transfectie-methode ge...

Ontwikkeling van Murine modellen met specifieke genen gemuleerd in hoofd-en nekkanker patiënten is nodig voor het begrijpen van neoplasie. Hier presenteren we een protocol voor in vitro transformatie van primaire muriene tong cellen met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem om Murine HNC cellijnen met specifieke genomische veranderingen te genereren.

In vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde Muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Dit protocol maakte de ontwikkeling mogelijk van hoofd- en halskankermodellen met een specifieke genomische werking, wat een aanzienlijke invloed had op ons begrip van de rol van specifieke genmutaties in het proces van neoplasie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gemak waarmee de cellijn kan worden ontwikkeld vanuit vrijwel elk orgaan. Het aantonen van de procedure zal Manu Prasad een grad student uit mijn laboratorium.Begin met het gebruik van chirurgische schaar om de tong te oogsten van een zes weken oude mannelijke of vrouwelijke B6 transgene muis. Gebruik een scalpel om het weefsel gehakt in zeer kleine fragmenten en verzamel de stukken in een 15 milliliter buis met 4,5 milliliter RPMI gewoon medium zonder serum. Voeg 200 microliters van triple enzym mix aan de buis en incubeer het monster op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten te tikken op de buis om de 10 minuten om de enzymatische dissociatie van het weefsel te verbeteren.Aan het einde van de incubatie, stop de reactie met 5%FBS in PBS en filter de celsuspensie door een 70 micro meter mesh zeef om de cellen te scheiden van de grotere weefselfragmenten. Verzamel de cellen door centrifugatie en schort de pellet opnieuw op in drie milliliter van compleet medium. Dan plaat de cellen in drie milliliter van volledige medium per 16 millimeter schotel.Breng cel aggregaten bewaard op de top van het filter naar een aparte 16 millimeter kweekschotel en voeg drie milliliter van compleet medium. Bewaar beide gerechten in de couveuse totdat verschillende celkolonies worden gevormd. Na een week van cultuur, microscopisch onderzoeken van de primaire celculturen voor de aanwezigheid van fibroblast besmetting, de behandeling van de cellen met 25% trypsine in 02%EDTA bij 37 graden Celsius gedurende een minuut, en verwijder eventuele fibroblasten.Op dag 10 van de cultuur gebruik 25% trypsine in 02%EDTA gedurende drie tot vijf minuten bij 37 graden Celsius om de cellen te oogsten uit de cel suspensie of cel aggregaat culturen en zie twee keer 10 tot de vijfde primaire cellen in twee milliliter medium per goed in elk goed van de 6-put plaat. De volgende dag transduceren de cellen met een keer 10 naar de 12 virale genoom per milliliter en incubeer de cellen in het virale deeltje-bevattende medium gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius. Vervang aan het einde van de incubatie de kweeksupernatants door twee milliliter vers compleet medium per put en breng de cellen terug naar de couveuse van de celkweek.Na twee weken van cultuur expansie, zaad van de cellen voor validatie en in vivo tumorigenic experimenten. Met behulp van de AAV CAS9 vector, een keer 10 tot de 12 virale genomen per milliliter virus zijn vastgesteld om efficiënt te transformeren primaire meth cellen naar tumorigenic kaarten met behulp van het protocol zoals aangetoond. De doorgenoemde cellen Express Cre, CAS9 en Green Fluorescerend Eiwit.Injectie van vijf keer 10 tot de vijfde primaire AAV-getransduceerde kaarten in de tong, lip en huid van NOD SCID-muizen, resulteert in tumorvorming bij deze dieren in tegenstelling tot de injectie van primaire kaarten, die geen tumoren veroorzaken. De tumorigenische transformatie van primaire tongeptropeelcellen kan worden bevestigd met behulp van immunofluorescentie en westerse blotting. Genomische analyse door diepe sequencing van DNA, geïsoleerd uit de getransformeerde cellen, bevestigt de effectieve genbewerking en frameshift van het tumoreiwit 53 en APC genen door het AAV CAS9-systeem.Bovendien vormen de getransformeerde tongcellen efficiënt tumoren in wilde type C57 zwarte zes muizen. Immunohistochemische analyse van de neoplastische tumorcellen onthult cytoplasmatische expressie van E-Cadherin en Keratine 14, beide epitheliale weefselmarkers. Bij het proberen van deze procedure, altijd onthouden dat te veel hakken of te veel enzymatische reactie leiden tot verminderde levensvatbaarheid van de cellen, wat leidt tot verminderde virus transactie-efficiëntie.Met behulp van deze procedure kunnen de cellijnen genetisch worden gemodificeerd om inzicht te krijgen in tumorigenic en gemetastaseert potentieel van kankercellen uit elk weefsel van belang.

in-vitro-establishment-genetically-engineered-murine-head-neck-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een uitgebreid overzicht van de technieken die betrokken zijn bij het genereren van een muismodel van orale kanker en kwantitatieve controle van de tumor invasie in de tong door middel van multi-foton microscopie van gelabelde cellen wordt gepresenteerd. Dit systeem kan dienen als een nuttig platform voor de moleculaire beoordeling en werkzaamheid van het geneesmiddel van anti-invasieve verbindingen.

Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom

Source: Prasad, M. et al. In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in vitro transformation of murine epithelial cells through viral delivery of Cre recombinase and mutation-inducing components. It outlines the steps for Cas9 activation, cancer-gene modification, and the establishment of a tumorigenic murine cell line.

Establishing a Murine Tumor Cell Line In Vitro Using a Virus-Cas9 System

In this video, we describe the isolation of epithelial cells from a murine tongue. These cells can be further cultured to give rise to cell colonies.

Isolation and Culture of Murine Tongue Epithelial Cells: A Procedure to Isolate and Culture Tongue Epithelial Cells from Mouse Model

Dit protocol beschrijft een nieuw opgerichte methode voor virus levering aan de lymfkliertest prostaat. Met behulp van technologie van de CRISPR/Cas9, gene overexpressie of Cre recombinase levering, de techniek kunt orthotopic wijziging van genexpressie en implementeert een roman muismodel voor prostaatkanker.

Virus levering van CRISPR gidsen voor de lymfkliertest prostaat voor Gene wijziging

Hier presenteren we een protocol voor levende cellen beeldvorming van de signalering activiteit TGF-β/Smad3 met behulp van een adenovirus verslaggever systeem. Dit systeem transcriptionele activiteit in real time worden bijgehouden en kunnen worden toegepast op beide afzonderlijke cellen in vitro en in levende diermodellen.

Live cel beeldvorming van de TGF-β/Smad3 signalering traject In Vitro en In Vivo met behulp van een Adenovirus verslaggever systeem

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Hier beschrijven we een snelle en directe in vivo CRISPR/Cas9 screeningsmethodologie met behulp van echogeleide in utero embryonale lentivirale injecties om tegelijkertijd functies van verschillende genen in de huid en mondholte van immunocompetente muizen te beoordelen.

In Vivo CRISPR/Cas9-screening om tegelijkertijd de genfunctie in de huid en mondholte van de muis te evalueren

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van gen knock-outs die embryonaal dodelijk zijn in vivo in genetisch gemanipuleerde muismodel-afgeleide tumoren en vervolgens het effect beoordelen dat de knock-out heeft op tumorgroei, proliferatie, overleving, migratie, invasie en het transcriptoom in vitro en in vivo.

Het definiëren van genfuncties in tumorigenese door ex vivo ablatie van gevlochten allelen in kwaadaardige perifere zenuwschedetumorcellen

Dit protocol beschrijft het proces van het genereren en karakteriseren van muis urotheliale organoïden die deleties in genen van belang herbergen. De methoden omvatten het oogsten van muizenurotheelcellen, ex vivo transductie met adenovirus dat Cre-expressie drijft met een CMV-promotor, en zowel in vitro als in vivo karakterisering.

Ex Vivo Organoïde model van Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen

Nieuwe strategieën om somatische mutaties in hematopoietische stam- en voorlopercellen (HSPC's) getrouw te modelleren, zijn nodig om de hematopoëtische stamcelbiologie en hematologische maligniteiten beter te bestuderen. Hier wordt een protocol beschreven om heterozygote gain-of-function mutaties in HSPC's te modelleren door het gebruik van CRISPR/Cas9 en dual rAAV donortransductie te combineren.

Engineering oncogene heterozygote gain-of-function mutaties in menselijke hematopoietische stam- en voorlopercellen

Leer hoe je een genetisch gemanipuleerde muizen hoofd- en nekkanker cellijn opzet met een AAV-Cas9 systeem. Dit protocol vereenvoudigt de ontwikkeling van kankermodellen voor onderzoek naar genmutaties.

In vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde Muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem (Video) | JoVE Journal

In vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde Muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem

Meer video's verkennen