Expressie, zuivering en liposoom binding van ontluikende gist SNX-BAR Heterodimers

SNX-BARs zijn membraan remodelleren eiwitten die een belangrijke rol spelen in de menselijke ziekte. Met behulp van onze methoden kunnen we hun precieze biofysische eigenschappen bepalen om lipidebinding en membraanremodellering te vergemakkelijken. Het zuiveren van de SNB-BAR eiwitten uit gistcellen maakt de verwerving van inheemse homo en hetero SNX-BAR dimers mogelijk terwijl de toxiciteit en onoplosbaarheid die vaak worden aangetroffen met niet-inheemse expressiesystemen worden geminimaliseerd.

Onze methoden kunnen worden gebruikt om de lipide specificiteiten van alle gist SNX-BARs te begrijpen of om recombinant SNX-BAR eiwitten te produceren uit een ander organisme. Een correcte extruderassemblage is essentieel om liposoom verlies tijdens het extrusieproces te voorkomen. Voor beginnende studenten of mensen die nieuw zijn in het veld, visueel observeren van de meest kritische stappen zal sterk verbeteren van uw kansen op succes.

Begin met het inenten van een groot uitstrijkje van gistcellen in een kolf ten minste vier keer het volume van de cultuur met 50 milliliter standaard YP medium aangevuld met 2%raffinose en 0,1%glucose als koolstofbron en groeien de cultuur 's nachts in een 30 graden Celsius shaker. De volgende ochtend, inenting van de 50 milliliter pre-cultuur in een liter standaard YP medium met 2%raffinose en 0,1%glucose in een 2,8 liter volume verbijsterd Fernbach fles voor een vier tot vijf uur durende cultuur in de schudden incubator. Wanneer de optische dichtheid op 600 nanometer 0,2 bereikt, voeg galactose toe aan een uiteindelijke concentratie van 2%, aan de cellen voor een nachtelijke cultuur in de schuddende incubator.

De volgende ochtend, oogst cellen door centrifugatie en breng de gist pellet in een 50 milliliter conische buis. Resuspend de pellet in 15 milliliter zuivering buffer om een uiteindelijk volume van ongeveer 30 milliliter te bereiken en de cel suspensie te laden op een homogenisator gekoeld tot vier graden Celsius. Lyse de monsters op 20 tot 25, 000 pond per vierkante inch voor twee tot drie rondes en breng het lysate in een nieuwe 50 milliliter conische buis op ijs.

Onmiddellijk duidelijk de cel lysate door centrifugatie en zorgvuldig overbrengen van de supernatant in een nieuwe buis. Vervolgens, equilibrate 300 microliter van IgG Sepharose kralen met drie re-suspensies in zuivering buffer alvorens de kralen toe te voegen aan de gewiste cel lysate voor een twee uur durende incubatie met draaien op vier graden Celsius. Voeg aan het einde van de incubatie de kralen toe aan een chromatografiekolom van 10 milliliter en laat het ongebonden lysaat doorstromen.

Was de kralen 10 keer met een milliliter wasbuffer per wasbuffer waardoor elke was volledig doorstroomt voordat het volgende volume wordt toegevoegd. Gebruik na de laatste wasbeurt een pipet en een verse buffer om de kralen in een microcentrifugebuis over te brengen. Breng het totale volume van de kralen op 500 microliter met verse wasbuffer en verwijder de kralen uit het lysaat met twee microliters van 10 milligram per milliliter TEV protease voor een nachtelijke incubatie met rotatie bij vier graden Celsius.

De volgende ochtend, gebruik maken van een 27 meter naald om de supernatant volledig te verwijderen en de eiwitzuiverheid te beoordelen door 10% polyacrylamide SDS pagina. Kwantificeer vervolgens de geconcentreerde eiwitten met behulp van de Bradford eiwittest volgens standaardprotocollen en bewaar het eiwit voor maximaal een week bij vier graden Celsius. Om de liposomen voor te bereiden, gebruik glasspuiten om voorraadlipiden over te brengen in een schone glazen kweekbuis om een uiteindelijk lipidemengsel van 1%fosfatidylinositol-3-fosfaat, 20%ergosterol, 30%fosphatidylserine, fosfoidylcholine zoals beschreven in de tabel te bereiken.

Afhankelijk van de oplosmiddelen wordt elke lipide opnieuw opgetrokken, het mengsel kan troebel worden bij de toevoeging van elke lipide. Droog de lipidemengsels voorzichtig af door laagstroomstikstofgas in een cirkelvormige beweging naar de mengsels te leiden om de lipiden gelijkmatig aan de onderkant van de glazen buis te behandelen. Wikkel vervolgens de glazen kweekbuis met folie en laat de opening onbedekt en de lipiden een uur lang in een vacuüm uitdrogen.

Voeg aan het einde van de incubatie 400 microliter bindingsbuffer toe aan elke flacon om de lipiden volledig te hydrateren bij een laatste liposoomconcentratie van 2,5 millimolar voordat de lipiden gedurende 30 minuten bij gemiddelde snelheid op een vortex worden gerehydrateren. De buffer moet troebel worden als de lipiden opnieuw worden opgetrokken. Breng de opgesuspende liposomen over in een microcentrifugebuis en vries de buizen in vloeibare stikstof, gevolgd door zeven tot acht keer ontdooien in een waterbad van 37 graden Celsius.

Reinig in een chemische rookkap twee glazen spuiten van één milliliter met een volledig volume chloroform drie maal per spuit om eventuele resterende lipiden te verwijderen en elke spuit te equilibreren met twee volumes ultrazuiver water en twee hoeveelheden bindende buffer. Monteer een mini-extruder volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Vervolgens dompelen twee stukken van filter ondersteuning in een 200 nanometer membraan in bindende buffer.

Het is belangrijk om de mini-extruder zo te monteren dat deze volledig luchtdicht is. En een goede manier om te controleren op lekken is om buffer door het apparaat. Sandwich het membraan tussen de filtersteunen en plaats het membraan in de mini-extruder.

Met behulp van een van de geëquilibreerde een milliliter spuiten, passeren een volume van de bindende buffer vergelijkbaar met het volume van de liposoom mengsel door de mini-extruder en gebruik de andere spuit om de lipososome mengsel omkeren van de microcentrifuge buis om de laatste van de liposomen te verzamelen in de dop voor hun verzameling. Extrudeer vervolgens de liposomen 19 tot 21 keer door het membraan van 200 nanometer en verzamel de geëxtrudeerde liposomen in een nieuwe microcentrifugebuis. Voordat u de SNX-BAR liposoom binding en tubulatietesten uitvoert, moet u het gezuiverde eiwit vooraf verwijderen door ultracentrifugeren en de supernatant overbrengen naar een nieuwe microcentrifugebuis zonder de pellet te verstoren.

Vervolgens, incubeer vier micromolar van gezuiverde SNX4-ATG20 en 2,5 millimolar liposomen in een totaal reactievolume van 20 microliter voor een 30-minuten incubatie bij 30 graden Celsius. Om de liposoombuien te visualiseren en te kwantificeren, spot je aan het einde van de incubatie onmiddellijk de monsters op een met koolstof bedekt koperen gaas en negatieve vlek met 1%uranylacetaat. Analyseer vervolgens de monsters op een transmissieelektronmicroscoop op 200 kilovolts.

Voor liposoom binding en sedimentatie, breng 20 microliter van de reactie over op een polycarbonaatcentrifugebuis en draai het monster met een compatibele router in een ultracentrifuge. Breng aan het einde van de centrifugatie de supernatant voorzichtig over naar een nieuwe microcentrifugebuis en zet de pellet opnieuw op in 40 microliters van SDS-paginamonsterbuffer. Breng de pelletsuspensie over naar een nieuwe microcentrifugebuis en voeg 20 microliter monsterbuffer toe aan de supernatant.

Laad vervolgens gelijkwaardige monstervolumes van pellet en supernatant op een 10%polyacrylamide SDS-paginagel en voer Coomassie-vlekken uit om de SNX-BARs die aan de liposomen zijn gebonden te visualiseren. Om te controleren op een goede inductie van SNX-BAR expressie, een westelijke vlek tegen de tandem affiniteit zuivering tag kan worden gebruikt als de eiwitniveaus van de SNX-BARs kan niet worden gedetecteerd via Coomassie vlek. Na zuivering van de SNX-BAR heterodimer moeten de banden van de twee SNX-BARs in een één-op-één stoichiometrische verhouding verschijnen en zouden er weinig tot geen contaminatingsbanden moeten zijn.

In deze representatieve analyse werden SNX-BAR heterodimers uitgedrukt, gezuiverd en gebonden aan synthetische liposomen zoals aangetoond. Merk op dat MVP1 homodimeren gevormd en werd uitgedrukt in bacteriën zoals verwacht. SNX-BAR binding aan verschillende liposoom samenstellingen kunnen worden gekwantificeerd door densitometrie om de effecten van fosphatidylserine bijvoorbeeld op liposoom binding te beoordelen.

Electron microscopie imaging maakt het mogelijk de meting van SNX4-ATG20 liposoom tubuli met de meeste tubuli meestal het bezit van diameters tussen 14 tot 26 nanometer. Houd er rekening mee dat gezuiverde SNX-BARs kunnen worden gereconstrueerd met ladingvangcomplexen op liposomen om te begrijpen hoe volledige samenstellingen de herinrichting van het membraan kunnen beïnvloeden. Bij het vergelijken van de binding van verschillende combinaties van gezuiverde SNX-BAR dimers met synthetische liposomen bestaande uit verschillende lipiden, bleken SNX-BAR eiwitten verschillende lipide bindingsvoorkeuren te bezitten.

Werk altijd in een kap bij het hanteren van chloroform en zorg ervoor dat u de juiste PBM draagt bij het hanteren van scherpe of glasmateriaal.