Tractie microscopie geïntegreerd met microfluïdica voor Chemotactische collectieve migratie

Collectieve celmigratie wordt vaak geleid door de gradiënt van signaalmoleculen. In deze video laten we zien hoe cellulaire krachten kunnen worden gekwantificeerd tijdens collectieve migratie geleid door biochemische gradiënt. We integreren de microfluïde chip met tractiemicroscopie, dan gebruiken we de microfluïde chip om biochemische gradiënt te genereren, en we gebruiken de tractiemicroscopie om cellulaire kracht te meten.

Dr. Hwanseok Jang, een postgrade in mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Bereid de PDMS-oplossing voor door het basiselastomen en het uithardingsmiddel te mengen met een verhouding van tien tegen één. Doe 15 milliliter van het basiselastomer in een conische buis van 50 milliliter en voeg 1,5 milliliter uithardingsmiddel toe.

Bereid twee van deze buizen voor. Vortex het PDMS mengsel gedurende vijf minuten voor het centrifugeren op 196 tijd g gedurende een minuut om bellen te verwijderen. Om het PDMS-stencil te fabriceren, giet u ongeveer een milliliter van het PDMS-mengsel op de wafer terwijl u SU-8-patroongebieden vermijdt, zodat de PDMS de zijkant van de SU-8-pilaren raakt, maar niet de bovenkant van het SU-8-patroon.

Plaats de wafer meer dan 30 minuten op een vlakke ondergrond en genees de PDMS vervolgens in een droge oven op 80 graden Celsius gedurende meer dan twee uur. Pel voorzichtig de PDMS van SU-8-mal af, trim het dunne PDMS-membraan met behulp van een 14 millimeter holle punch. Verwijder het stof op het oppervlak van de PDMS-stukken met plakband voordat de PDMS-stencils automatisch worden geclameerd.

Om PDMS microchannel te fabriceren, giet ongeveer 30 milliliter PDMS mengsel over de SU-8 mal. Ontgas gedurende 30 minuten in een vacuümkamer, en dan genezen van de PDMS in een droge oven op 80 graden Celsius voor meer dan twee uur. Pel de PDMS voorzichtig af van SU-8-mal en snijd de PDMS tot een grootte van 24 millimeter bij 24 millimeter.

Maak in elk PDMS-blok één uitgang en drie inlaten met behulp van een biopsiepunch van één millimeter. Vervaardiging en silanize glazen platen zoals beschreven in het tekstprotocol. Bedek het randoppervlak van het onderste glas met 100 microliter van de bind-silane oplossing.

Na het verlaten van het glas op kamertemperatuur gedurende een uur, spoel het glas drie keer met gedeïsized water. Laat het glas vervolgens drogen bij omgevingsluchttemperatuur of door perslucht te blazen. Bereid de polyacrylamide geloplossing zoals beschreven in het tekstprotocol.

Breng vervolgens voor 10 microliter gemengde geloplossing over op de rechthoekige microwell en plaats er een cirkelvormige afdeksel bovenop. Bevestig de montage van aangepaste glas, gel oplossing, en cover slip op de cover van een zes-put plaat met plakband en flip it. Dan centrifugeren gedurende 10 minuten op 96 keer g om fluorescerende deeltjes te brengen naar de bovenste laag van de polyacrylamide gel.

Haal de montage uit de centrifuge en plaats deze op een vlakke ondergrond met de afdeksel naar beneden. Na 30 minuten, draai de montage en plaats het in een 35 millimeter Petri schotel. Vul de schotel met twee milliliter gedeïsized water.

Verwijder met behulp van tangen de afslag slip voorzichtig door het naar één kant te schuiven. Om collageen te coderen op de polyacrylamide gel, los een milligram per milliliter sulfo-SANPAH op in een warme HEPES-buffer van 50 millimolar. Laat 200 microliter van de oplossing op het geloppervlak vallen en activeer 10 minuten door UV-licht.

Na UV-activering spoelt u de gel twee keer af met de HEPES-buffer van 0,1 molaire, en vervolgens één keer met PBS. Code de polyacrylamide gel met collageen oplossing op vier graden Celsius 's nachts. Op de volgende dag, was de gel drie keer met PBS.

Dompel het autoclaved PDMS-stencil onder in F-127-oplossing. Bewaar het in een 37-graden Celsius incubator voor een uur. Was het PDMS-stencil drie keer met PBS en verwijder vloeistof uit zowel het PDMS-stencil als de polyacrylamidegel.

Plaats vervolgens het PDMS-stencil op de polyacrylamidegel en voeg PBS toe aan het stencil. Verwijder bellen in de gaten van het PDMS-stencil door voorzichtig te pipetten. Na het verwijderen van bellen, duidelijk de PBS van het oppervlak van de PDMS stencil.

Voeg nu 200 microliter van de celoplossing toe aan PDMS-stencil en plaats de gel een uur in een couveuse, zodat de cellen zich hechten aan de polyacrylamidegel. Na incubatie, voorzichtig wassen uit de cel oplossing met cel cultuur media en voeg meer cel cultuur media. Verwijder het PDMS-stencil, controleer de vorming van celeilanden onder een microscoop.

Behandel vervolgens het oppervlak van het PDMS-microkanaal gedurende 30 seconden met zuurstofplasma. Na het verwijderen van vloeistof op de polyacrylamide gel gevulde bodem glas, plaats de PDMS microchannel op de top van het onderste glas, en zet de montage op de aangepaste glashouder. Vul het microkanaal met celkweekmedium.

Om de inlaatbuizen van het geïntegreerde microfluidic systeem voor te bereiden, sluit u een bijgesneden naald en een minivolumelijn van 30 centimeter aan met een driewegstopcock. Bereid drie van deze regelingen voor. Voor uitlaatbuizen sluit u een bijgesneden naald en een minivolumelijn van 75 centimeter aan met een stopcock in drie richtingen.

Vul de buizenlijnen met het medium dat een uur is voorverwarmd. Bereid reservoirs door het verwijderen van zuigers uit spuiten en het aansluiten van inlaat buizen lijnen. Sluit de naaldconnectoren van elke slanglijn aan op de drie inlaten en één uitlaat van het microfluïde apparaat.

Vul elk reservoir met drie milliliter vers medium of geconditioneerd medium. Voor de gradiënttest vult u het linkerinlaatreservoir met 20 nanogram per milliliter hepatocyte groeifactor, of HGF, in het celkweekmedium. Voor visualisatie van de concentratie gradiënt, voeg 200 microgram per milliliter fluorescerende kleurstof aan de linker inlaat reservoir.

Sluit de uitlaatbuizenlijn aan op een spuitpomp. Plaats het geïntegreerde microfluïde systeem op het podium van een conventionele epifluorescente microscoop. Maak beelden om de 10 minuten gedurende maximaal 24 uur met behulp van een geautomatiseerde microscoop gehuisvest in een incubator.

Maak op elk moment een reeks afbeeldingen met behulp van een 4X objectieve lens in drie verschillende kanalen, waaronder een fasebeeld om celmigratie te visualiseren, een groen fluorescerend beeld om fluorescerende kralen in de gel te visualiseren en een rood fluorescerend beeld om de concentratiegradiënt van een chemische stof te visualiseren. Na het nemen van time-lapse beelden, infuus 0,25%Trypsin-EDTA oplossing in microkanalen om cellen los te maken van de polyacrylamide gel. Bij het volledig verwijderen van cellen uit de gel, neem een groene fluorescerende afbeelding te worden gebruikt als referentiebeeld voor tractie microscopie.

Ga naar gegevensanalyse zoals beschreven in het tekstprotocol. Om contractielkracht en intercellulaire stress te meten, werden tractiemicroscopie en monolayer stressmicroscopie gecombineerd met het microfluïde kanaal. De kaarten werden uitgezet in radiocoördinatie met uitgaande tractie met behulp van warme kleur en innerlijke tractie met behulp van koude kleur.

Op tijd nul, alle eilanden vertoonden vergelijkbare tractie distributies met sterke innerlijke tractie op de rand en schommelingen binnen het eiland. Na 10 uur van toepassing van de HGF gradiënt, terwijl de mate van eiland expansie was anders in elke kolom, de tractie distributies waren grotendeels vergelijkbaar met tijd nul. De gemiddelde tractie veranderde niet gedurende 10 uur.

Bij het berekenen van de monolayer stress vertoonde elke kolom echter verschillende trends. Waar de HGF-concentratie laag was, bleef de gemiddelde spanning op eilanden gedurende een periode van 10 uur ongeveer 200 pascals behouden. Waar de HGF-concentratie hoog was, daalde de gemiddelde spanning op eilanden geleidelijk van 230 pascalen naar 100 pascals over 10 uur, zoals eerder werd aangetoond.

Waar de HGF-concentratie hoog was op de linkerhelft en laag op de rechterhelft van het eiland, bleef de gemiddelde spanning rond de 150 pascals. Het vullen van het microfluïde kanaal moet zacht zijn. Het is belangrijk om bubbels gevangen in het kanaal te verwijderen, terwijl tegelijkertijd niet verstoren micro-ouder celeilanden.

Door gebruik te maken van dit geïntegreerde systeem kan men onderzoeken hoe celcollectief mechanisch reageert op verschillende chemische gradiënten, zoals chemo attractants of groeifactoren. Dit platform zal ons helpen de mechanica van collectieve celmigratie verder te verkennen onder chemische gradiënten, wat de sleutel is om regeneratie, kankermetastase en ontwikkeling te begrijpen.