Meten van de effecten van bacteriën en chemicaliën op de intestinale permeabiliteit van Caenorhabditis elegans

Deze methode zal nuttig zijn voor fundamentele biologische studies met betrekking tot de interactie tussen darmmicrobiota en darmgezondheid. Bovendien, Dit protocol kan worden gebruikt voor screening potentiële probiotica en nutraceuticals om darmgezondheidsproblemen te genezen, zoals lekkende darm syndroom en inflammatoire darmziekten. Dit protocol maakt gebruik van een beeldvormingssysteem met hoge doorvoer om een snelle en nauwkeurige kwantitatieve analyse van de darmdoorlaatbaarheid in C.elegans die met verschillende bacteriën en chemicaliën worden behandeld, mogelijk te maken.

We raden een wetenschapper die niet bekend is met deze techniek aan om het aantal monsters te beperken om verkeerd labelen en andere fouten te voorkomen. Deze procedure bestaat uit vele stappen die visuele demonstratie vereisen, zoals het overbrengen van wormen naar 96-putplaten en het gebruik van de Operetta-machine, evenals de Harmony-software. Begin met de voorbereiding van 500 milliliter steriel LB medium.

Inenting een enkele kolonie van P.aeruginosa in het medium, en incubeer de cultuur voor 14 tot 15 uur bij 37 graden Celsius tijdens het schudden op 150 rpm. De volgende dag, gelijkmatig verdelen van de bacteriële cultuur in twee 500-milliliter buizen, en centrifugeren ze op 3, 220 keer g en vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Verwijder de supernatant, waardoor 25 milliliter in elke buis, voor een totaal resterende volume van 50 milliliter, dan resuspend de bacteriële pellet.

Bewaar de bacteriële cultuur op vier graden Celsius tot klaar voor gebruik. Om de effecten van bacteriën op de darmombaarheid van C.elegans te testen, verwijder de culturen uit de koelkast en grondig vortex hen. Voeg in totaal 800 microliters toe aan elke verse NGM-plaat en laat de platen 's nachts drogen in een 20-graden Celsius-incubator.

Ter voorbereiding van DIM platen, voeg 50 milliliter NGM agar medium in een fles DIM met NGM bouillon, en meng grondig. Giet vervolgens 20 milliliter van het medium in elke petrischaal van 90 bij 15 millimeter. Bereid DMSO-platen door 20 milliliter DMSO-medium toe te voegen aan elk petrischaaltje en laat de platen minstens drie uur op kamertemperatuur om te stollen.

Verspreid 800 microliters van vortexed E.coli of P.aeruginosa cultuur op elke verse NGM plaat, en laat de platen te drogen in een 20-graden Celsius incubator 's nachts. Was de leeftijdsgesynchroniseerde L4-larven met S-buffer en breng ongeveer 500 wormen over naar de NGM-platen met verschillende bacteriën en chemicaliën. Dan, incubeer de platen op 20 graden Celsius voor 48 uur.

Bereid de FITC-dextran-aangevulde platen door het mengen van twee milliliter van warmte-geïnactiveerde E.coli met vier milligram FITC-dextran. Voeg 100 microliter van het mengsel toe aan elk van de 20 verse NGM agar-borden en laat de platen een uur drogen op een schone labbank. Na 48 uur behandeling was je de wormen met S-buffer, breng je ze over naar FITC-dextran-supplemented plates en naar NGM-platen zonder FITC-dextran, en broed ze 's nachts uit.

De volgende dag, was de wormen met S-buffer, en laat ze kruipen in de verse NGM agar plaat voor een uur. Voeg 50 microliter van 4% formaldehyde toe aan elke put van een zwarte, 96-well, platte bodem plaat, en breng ongeveer 50 wormen in elke put. Na een tot twee minuten, verwijder alle formaldehyde, en voeg 100 microliter van montage medium in elke put.

Formaldehyde is een giftige chemische stof en moet met zorg worden behandeld. Als u fluorescerende beelden wilt vastleggen, drukt u op het pictogram Deksel openen in de beeldsoftware en plaatst u de plaat in de machine. Klik op Instellen, selecteer het plaattype en voeg de kanalen brightfield en EGFP toe.

Als u de indeling wilt aanpassen, gaat u naar de indelingsselectie en selecteert u Bijhouden. Stel de eerste foto in op één micrometer, het aantal vlakken op 10 en de afstand tot één micrometer. Selecteer een van de behandelingsputten en één opnameveld en druk op Test in de sectie Experiment uitvoeren.

Als de afbeeldingen bevredigend zijn, gaat u terug naar de sectie Setup en drukt u op het pictogram Opnieuw instellen. Selecteer vervolgens alle doelputten en een geschikt aantal van de opnamevelden. Ga naar Experiment uitvoeren, voer de naam van de plaat in en druk op Start.

Als u de fluorescentieintensiteit wilt meten, gaat u naar de sectie Beeldanalyse, voert u de afbeelding in en zoekt u de cel door het EGFP-kanaal en de methode B.Pas de parameters aan op basis van de routebeschrijving van het manuscript en kies het gemiddelde als uitvoer. Druk op het pictogram Toepassen om de instelling op te slaan. Verkrijg een warmtekaart en een gegevenstabel door naar de sectie Evaluatie te gaan en de uitleesparameter aan te passen en start vervolgens de evaluatie.

C.elegans vertoonden een aanzienlijke toename van FITC-dextran fluorescentie na incubatie met P.aeruginosa in vergelijking met de andere twee bacteriestammen, wat aangeeft dat P.aeruginosa meer vitale schade aan de epitheliale darmbarrière en verhoogde darmdoorlatendheid veroorzaakte. Levende en warmte-geïnactiveerde P.aeruginosa veroorzaakten zeer verschillende effecten op de darmpermeabiliteit in C.elegans. Bij warmte-inactivatie geven zowel de fluorescentiebeelden als de statistische gegevens aan dat P.aeruginosa geen toxiciteit voor aaltjes heeft veroorzaakt.

Een 48-uurs co-behandeling met DIM verminderde de FITC-dextrante fluorescentie intensiteit in de darmen van wormen blootgesteld aan P.aeruginosa, waaruit blijkt dat DIM kan worden beschouwd als een goed natuurlijk product om darmpermeabiliteit disfunctie veroorzaakt door bacteriële infecties te genezen. Het is belangrijk om te onthouden dat tijdens de voorbereiding van de FITC-dextran-gecoate platen, moet u de blootstelling aan licht te minimaliseren als gevolg van de lichtgevoeligheid van FITC-dextran. Deze techniek kan worden gebruikt om de pathogene en probiotische effecten van darmbacteriën en hun actieve componenten te bepalen door het testen van de bacteriën, evenals hun chemische samenstelling.