Name: Geautomatiseerd centrifugale systeem voor kleinschalige Celverwerking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: Leer een geautomatiseerd centrifugaal systeem voor kleinschalige celverwerking met hoge opbrengst. Dit protocol verbetert efficiëntie en betrouwbaarheid in celproductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door het operationele infrastructuur ondersteuningsprogramma van de Victoriaanse overheid, en de Victoriaanse overheids technologie voucher die wordt verstrekt door het ministerie van economische ontwikkeling, banen, vervoer en hulpbronnen. RL is de ontvanger van een nationale gezondheids-en medische Onderzoeksraad loopbaanontwikkeling Fellowship. AL is de winnaar van een Australische postdoctorale onderscheiding.

1. bereiding van reagentia en cellen voor buffer uitwisseling
<ol><li>Buffers voorbereiden (Zie tabel met materialen) in een klasse 2 laminaire stroom afzuigkap. Verwijder met behulp van een spuit en naald assemblage 50 mL zoutoplossing uit een 500 mL zoute zak. Vervang dit met 50 mL van 20% humaan serumalbumine (HSA) om 2% HSA in zoutoplossing te maken, die als de wasbuffer dient.</li>
	<li>Verwijder de cellen uit de kweekvaten en voer een celtelling uit om de Beginhoeveelheid van de cel en de levensvatbaarheid te bepalen door trypeen blauwe uitsluiting. Laad de cellen in een transferzak. Opmerking: in dit protocol werden de cellen van Jurkat gecultiveerde in RPMI en MSCs werden gekweekt in DMEM: F12. Beide media werden aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum-Antimycotische oplossing. Cellen werden gekweekt bij 37 ° c met 5% CO2. Voeg voor MSCs of aanhandige cellen een verterings enzym (bijv. trypsine) toe aan de kweekvaten om de cellen los te maken en te doven met cultuur media zodra de cellen zijn losgemaakt. In dit protocol werd een transferzak gebruikt omdat de cellen in kweekvaten werden uitgebreid. Echter, als de cellen worden gekweekt in een cel cultuur zak, het kan direct worden aangesloten op de Kit voor eenmalig gebruik via steriele buislassen. In dit protocol werden 3 x 107 jurkat cellen of 1 x 107 MSCS gebruikt voor elke run, waarbij cellen werden opgeschort in 40 ml cultuur media.<ol>
<li>Laadcellen in een transferzak (Zie tabel met materialen) met behulp van een spuit en naald assemblage als er een steriele buis lasser beschikbaar is om de transferzak aan te sluiten op de single-use processing Kit.</li>
		<li>U ook een paar geautoclaveerd schaar gebruiken om de verbindingsbuis te knippen met ongeveer 10 cm resten die aan de transferzak zijn bevestigd en een vrouwelijke Luer connector aan het uiteinde van de slang toe te voegen. Gebruik een spuit om cellen en media te aspireren, sluit de spuit vervolgens aan op de Luer-connector en laadcellen in de transferzak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sluit de zak met de cellen, was buffer zakje met 500 mL wasbuffer bereid in stap 1,1, Afvalzak, en het verzamelen van de spuit aan de Kit voor eenmalig gebruik (Figuur 1B). Opmerking: de verbindingspositie van elke zak is afhankelijk van de instellingen in het programma. In dit protocol hebben we de Afvalzak op positie A aangesloten, was buffer op positie B, celzak op posities D en F, en verzamel spuit op positie H (Figuur 1C).</li>
</ol>2. programma voor geautomatiseerd buffer Exchange protocol
<ol><li>Open de grafische gebruikers interface (GUI) van het apparaat en druk op de "StarT" knop op een laptop PC of Tablet. Vervolgens "Open" een bestaand protocol of druk op "Nieuw" om een nieuwe te maken.</li>
	<li>Gebruik de knop "vooruit" en "achterwaarts" om door elke stap te navigeren, selecteer de kleppen die geopend/gesloten moeten worden, centrifugale snelheid, pompsnelheid, pomp richting en actie triggers. De instellingen voor elke stap worden samengevat in tabel 1. Sla het protocol vervolgens op.</li>
</ol>3. de machine instellen
<ol><li>Plaats de verwerkings Kit voor eenmalig gebruik op de machine en hang de aangesloten zakken dienovereenkomstig op. Druk op de rode "Stop/reset" knop om alle kleppen in de standaard gesloten positie te resetten. Opmerking: de machine voert een test uit wanneer de deur gesloten is om ervoor te zorgen dat de kit correct is geplaatst en dat alle kleppen naar behoren functioneren.</li>
	<li>Verbind de GUI met het verwerkings apparaat en druk op de "Connect"-knop. Download dan het opgeslagen programma. Wanneer de groene "Play" knop oplicht, geeft dit aan dat het protocol klaar is om te starten.</li>
	<li>Open de handmatige klemmen voor de transferzak slang. Opmerking: als de operator vergeet de klemmen te openen, zal het apparaat stoppen en de druksensor waarschuwing verschijnen. Druk op de "Stop" knop om het toestel te resetten en open de klemmen om opnieuw te beginnen.</li>
</ol>4. geautomatiseerde buffer uitwisseling
<ol><li>Druk op "Start" om het programma voor buffer uitwisseling te starten. Opmerking: om het geautomatiseerde proces handmatig te wijzigen, druk op de knop "volgende" om naar de volgende stap te gaan voordat u de "trigger" bereikt of druk op "pause" om het proces in de wacht te zetten. Dit zal de cellen door de kit recirculeren terwijl alleen kleppen J en K open blijven (Figuur 1C).</li>
	<li>Aan het einde van de automatisering stap 6 (tabel 1), het proces zal pauzeren wanneer lucht in de nu geleegd tas activeert de Bubble sensor. Druk op "Next" om het proces naar de volgende stap te verplaatsen als de tas inderdaad leeg is of druk op "pause" om de verwerking te hervatten als de sensor werd geactiveerd door een bubbel in de lijn.</li>
</ol>5. de cellen verzamelen en bemonsteren
<ol><li>Wanneer het geautomatiseerde proces is voltooid, sluit alle slangklemmen. Open de deur en neem de set voor eenmalig gebruik uit het apparaat. Koppel de spuit los om de cellen voor volgende processen te verzamelen. Neem een monster van de verzamelde cellen voor een celtelling en levensvatbaarheid controle (zie stap 6,2).</li>
</ol>6. validatie van het proces
<ol><li>Voer controle experimenten uit met een handmatig protocol voor buffer uitwisseling.<ol>
<li>Centrifuge celsuspensie bij 200 x g gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg en regeer de cellen met 30 ml cel wasbuffer. Centrifugeer de celsuspensie nogmaals bij 200 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en revoer de cellen opnieuw uit met 10 ml cel wasbuffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer het tellen van cellen uit via de trypan Blue-uitsluitings test om de levensvatbaarheid van de cellen te beoordelen met behulp van een geautomatiseerde teller.</li>
	<li>Voer een MTS-assay uit om celproliferatie te kwantificeren op 2, 24 en 48 h. Opmerking: de MTS assay werd uitgevoerd op een 96 goed weefselkweek plaat volgens de instructies van de fabrikant. Een hoeveelheid celkweek media van 100 μL (bevattende 10.000 Jurkat cellen of 1.500) per put werden na het proces van de buffer wisseling geplateerd. Op elk moment werden 20 μL MTS-reagentia in elk goed toegevoegd en gedurende 2 uur geïnineerd bij 37 °C. De extinctie werd beoordeeld op 490 nm met behulp van een plaat lezer.</li>
	<li>Voer functionele testen uit om de impact van het geautomatiseerde proces te vergelijken met het handmatige proces op de Jurkat-cellen en MSC-functie.<ol>
<li>Cultuur jurkat cellen in een 96-goed bord met een dichtheid van 1 x 106 cellen/ml gestimuleerd met 50 ng/ml forbol 12-Myristate 13-acetaat (PMA) en 1 μg/ml ionomycine (Cell stimulatie cocktail) in DMEM: F12-media met 10% foetaal runderserum (FBS) gedurende 24 uur. inincuberen van de cellen bij 37 °c met 5% Co2.</li>
		<li>Meet de productie van Interleukine-2 van Culture supernatant met behulp van een op kraal gebaseerde ELISA-test (Zie tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Cultuur MSCs in een 12-put plaat bij de dichtheid van 10.000 cellen/cm2 in 1 ml van de DMEM: F12-media met 10% FBS aangevuld met interferon-γ 50 eenheden/mL voor 48 h. Verzamel supernatant voor de kynurenine concentratie test om Indoleamine 2, 3-dioxygenase (Ido) enzymactiviteit van MSCS te meten zoals eerder beschreven21.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture%3A+Autologous+Cell+Therapies%2C+Part+1%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1.</a> BioProcess International. 16 (3), (2018).</li>
<li>Hampson, B., Ceccarelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factories+of+the+future%3A+Can+Patient-Specific+Cell+Therapies+Get+There+from+Here%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?</a> BioProcess International. 14 (4), (2016).</li>
<li>Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+success+for+commercial+cell+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Mapping success for commercial cell therapy manufacturing.</a> BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).</li>
<li>Heathman, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translation+of+cell-based+therapies%3A+clinical+landscape+and+manufacturing+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges.</a> Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).</li>
<li>Lipsitz, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+for+cost-of-goods+planning+to+guide+economic+production+of+cell+therapy+products%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).</li>
<li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture%3A+Autologous+Cell+Therapies%2C+Part+2%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2.</a> BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).</li>
<li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+manufacturing+of+therapeutic+mesenchymal+stromal+cells+with+the+use+of+the+Quantum+Cell+Expansion+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).</li>
<li>Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation%3A+what+will+the+cell+therapy+laboratory+of+the+future+look+like%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).</li>
<li>Galipeau, J., Sensebe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stromal+Cells%3A+Clinical+Challenges+and+Therapeutic+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li>
<li>Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cells+%28CAR+T-Cells%29+for+Cancer+Immunotherapy+-+Moving+Target+for+Industry%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry?</a> Pharmaceutical Research. 35 (8), 152(2018).</li>
<li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li>
<li>Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+role+of+automation+in+process+development%2C+manufacture+of+cell%2C+gene-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies.</a> Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).</li>
<li>Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Automated+Approaches+for+Cell+and+Gene+Therapy+Manufacture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).</li>
<li>Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Granulocyte+Isolation+by+Continuous+Flow+Centrifugation+Leukapheresis+and+Counterflow+Centrifugation+Elutriation+%28CFCL%2FCCE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE).</a> Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).</li>
<li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+%28Elutra%E2%84%A2%29+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Cobe+AutoPBSC+and+Gambro+Elutra+as+a+platform+for+monocyte+enrichment+in+dendritic+cell+%28DC%29+therapy%3A+Clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study.</a> Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).</li>
<li>Whitford, W. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhitford%2C+WG+%22Continuous+Processing+in+Pharmaceutical+Manufacturing%22">Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing</a>. Subramanian, G. , (2014).</li>
<li>Scinogy. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH & CONCENTRATION. , https://www.scinogy.com/projects (2019).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Jurkat+T+Lymphocyte+Leukemia+Cells+by+an+Engineered+Interferon-Alpha+Hybrid+Molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).</li>
<li>Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells+Display+Activation+of+Different+Survival+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways.</a> Journal of Cancer. 8 (19), 4124(2017).</li>
<li>Ling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+use+IDO+to+regulate+immunity+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment.</a> Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).</li>
<li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).</li>
<li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li>
<li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyethyl+starch+as+a+substitute+for+dextran+40+for+thawing+peripheral+blood+progenitor+cell+products%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products.</a> Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).</li>
<li>Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+collection+and+processing+with+hydroxyethyl+starch+or+non-hydroxyethyl+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch.</a> Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).</li>
<li>Stroncek, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counter-flow+elutriation+of+clinical+peripheral+blood+mononuclear+cell+concentrates+for+the+production+of+dendritic+and+T+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 241(2014).</li>
<li>Mfarrej, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+assessment+of+the+Lovo+device+for+dimethyl+sulfoxide+removal+and+cell+concentration+in+thawed+hematopoietic+progenitor+cell+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).</li>
<li>Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+washing+of+thawed+haematopoietic+progenitor+cell+grafts%3A+a+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sanguinis%22%5BJournal%5D)">Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation.</a> Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).</li>
<li>Panes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+allogeneic+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+%28Cx601%29+for+complex+perianal+fistulas+in+Crohn%27s+disease%3A+a+phase+3+randomised%2C+double-blind+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial.</a> Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).</li>
<li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-In-Human+Administration+of+Allogeneic+Amnion+Cells+in+Premature+Infants+With+Bronchopulmonary+Dysplasia%3A+A+Safety+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).</li>
</ol>

SW, IF en DJ zijn COO, CTO en CEO van Scinogy Pty. Ltd. De toegang tot het CFC-apparaat werd ook geleverd door Scinogy.

Het protocol voor automatische buffer uitwisseling dat wordt beschreven, is eenvoudig en gebruiksvriendelijk. Niettemin zijn er een paar belangrijke stappen in dit protocol die kritisch zijn en bijzondere aandacht vereisen. In onze ervaring, bij de verwerking van grotere cellen zoals MSCs (gemiddelde diameter 10 – 15 μm) elke run moet bevatten ten minste 1 x 107 cellen om optimale celherstel te bereiken (Figuur 4B). Het verwerken van kleinere cellen, zoals Jurkat ...

Het landschap van de moderne geneeskunde is snel getransformeerd door recente ontwikkelingen in genand Cell-based therapieën (GCT). Als een van de snelst groeiende velden in translationeel onderzoek, wordt de GCT-sector ook geconfronteerd met unieke en ongekende uitdagingen. Naast robuuste klinische uitkomsten zijn efficiënte en kosteneffectieve productieprocessen essentieel voor het commerciële succes van GCT, dat bijzonder moeilijk te bereiken is in kleinschalige productie1. De kosten van tijd, arbeid en kwaliteitsgaranties worden vergroot wanneer elke batch cellen slechts een paar doses voor één patiënt produceert in plaats van honderden of duizenden. In tegenstelling tot allogene celtherapieën waarbij de productieprocessen meer verwant zijn aan de productie van antilichamen en recombinant eiwitten, worden autologe celtherapieën meestal geproduceerd als kleinschalige operaties1. Als een relatief nieuw fenomeen in biofarmaceutische productie2zijn opties voor kleinschalige celverwerking momenteel vrij beperkt.
Buffer uitwisseling is essentieel voor de productie van cellen. Het is een van de downstream processen waar cellen worden verwijderd uit de cultuur media en geconcentreerd voor cryopreservatie of infusie. Op dit moment past kleinschalige celfabricage vaak processen toe die vergelijkbaar zijn met die in de academische onderzoeksinstelling en vertrouwt op gespecialiseerde schone kamers om steriliteit3te handhaven. Handmatige downstream processen gebruiken vaak tafel-centrifuges voor pellet-en respendeer cellen voor volume reductie en buffer uitwisseling. Deze open processen zijn kostbaar (d.w.z. het onderhoud van werk en schone kamers) en hebben een beperkte productiecapaciteit, die niet ideaal zijn voor commerciële productie2,3.
De implementatie van automatisering is voorgesteld als een oplossing voor het verbeteren van de productie-efficiëntie en het behalen van commerciële schaal producties2. Steriliteit kan niet worden bereikt in op cellen gebaseerde producten via traditionele methoden die worden gebruikt voor Biologics, zoals gammastraling of terminale filtratie. In plaats daarvan wordt een geautomatiseerd gesloten systeem ingezet om de Risico's van verontreiniging te verminderen en exploitanten die vertrouwen op schone ruimten om steriliteit4te handhaven. Procesautomatisering lost ook de kwestie van schaalbaarheid op door ofwel meerdere systemen parallel (scale-out) te hebben of de verwerkingscapaciteit van een afzonderlijk apparaat (scale-up) te vergroten, wat op zijn beurt de variabiliteit tussen operators minimaliseert. Bovendien suggereert kostenmodellering analyse van autologe therapieën dat automatisering de kosten van de productie van5,6kan verminderen. Er werd echter geen kostenvoordeel gevonden in een autologe stamcel klinische proef waarbij een geautomatiseerd fabricage platform werd gebruikt7, wat suggereert dat het kostenvoordeel van automatisering kan afhangen van het individuele fabricageproces.
Er zijn verschillende strategieën waarin automatisering kan worden geïntroduceerd in een bestaand productieproces. Dit kan worden bereikt door het implementeren van een volledig geïntegreerd platform of een modulaire verwerkingsketen. Er zijn verschillende volledig geïntegreerde platforms die commercieel beschikbaar zijn voor autologe celproductie, zoals CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) en Quantum (Terumo BCT). Deze geïntegreerde platforms, die vaak worden omschreven als "GMP-in-a-Box", hebben lage eisen aan infrastructuur en zijn eenvoudig te bedienen. De productiecapaciteit van een volledig geïntegreerde installatie kan echter worden beperkt door de incubator die aan het systeem is bevestigd. Zo is het kweek vermogen van Prodigy beperkt tot zijn 400 ml kamer8 en heeft de Quantum cartridge een begrenzings oppervlak ingesteld op 2,1 m2 (overeenkomend met 120 T175 kolven)7, wat mogelijk niet voldoende is voor patiënten die hogere celdoses9,10nodig hebben. Daarnaast hebben Prodigy en Quantum een gemeenschappelijk attribuut dat het gebruik ervan beperkt: de operationele eenheid wordt bezet door een enkele partij cellen gedurende de celuitbreidingsperiode, waardoor het aantal batches dat door elke eenheid kan worden geproduceerd11wordt beperkt. De modulaire aanpak van automatisering is het creëren van een productieketen met meerdere modulaire units die het commerciële productieproces van12,13simuleert. Deze aanpak, die het cultuur apparaat van de celwasinrichting scheidt, kan daardoor de efficiëntie van de productie maximaliseren. Een ideaal verwerkings apparaat zou er een zijn die aanpasbaar en schaalbaar is voor productiebehoeften12.
Tegenstroom centrifugeren (CFC) technologie, die dateert uit de jaren 1970, heeft een lange geschiedenis in cel verwerking14. Het bereikt celconcentratie en scheiding door centrifugale kracht te balanceren met een tegenstroom kracht. Normaalgesproken komt een celsuspensie van het smalle uiteinde van een celkamer onder een constant debiet terwijl het wordt onderworpen aan een centrifugale kracht (Figuur 1a). De stroom van de vloeistof wordt uitgeoefend in de tegenovergestelde richting van de centrifugale kracht. Dit wordt de tegenstroom kracht genoemd, die een gradiënt vormt binnen de cel kamer. De tegenstroom kracht neemt dan af naarmate de celkamer uit de punt van de kegelvormige celkamer verwijdt. Cellen met een hogere dichtheid en een grotere diameter hebben een hogere sedimentatie snelheid, waardoor ze een kracht evenwicht bereiken naar de punt van de kegelvormige celkamer. Kleinere deeltjes kunnen een evenwicht bereiken naar de basis van de kamer of te klein zijn om in de kamer te worden bewaard en zullen worden weggespoeld. De CFC-technologie is vooral bekend om zijn toepassing bij de verwerking van bloed aferese producten, zoals het isoleren van monocyten voor dendritische celtherapieën15,16. In termen van buffer uitwisseling is de CFC-technologie alleen toegepast in grootschalige productie17 en moet deze nog worden gebruikt voor de kleinschalige productie van autologe celtherapieën.
Om de noodzaak van een geschikt apparaat voor kleinschalige celfabricage aan te pakken, werd onlangs een geautomatiseerd CFC-apparaat (Zie tabel van de materialen) ontwikkeld18. Het geautomatiseerde celverwerkings apparaat maakt gebruik van de technologie voor het verwijderen van het celafval en vergemakkelijkt de buffer uitwisseling. Het apparaat voert buffer uitwisseling uit met een Kit voor eenmalig gebruik die steriel kan worden aangesloten op een zak voor het overbrengen van een cel, waardoor de cellen in een steriel, ingesloten systeem kunnen worden verwerkt. Hier onderzoeken we het gebruik van een tegenstroom centrifugale apparaat om buffer uitwisseling in zoogdier celculturen in geautomatiseerde protocollen uit te voeren. In deze studie testten we het protocol voor buffer uitwisseling met behulp van Jurkat-cellen en mesenchymale stromale cellen (MSCs) om respectievelijk niet-aanhandige en aanhandige celtypen te modelleren. Jurkat cellen zijn vereeuwigd t cellen vaak gebruikt voor de studie van acute T-cel leukemie19,20. MSCs zijn volwassen stamcellen die zijn bestudeerd in menselijke klinische studies voor een breed scala aan ziekten9.

<table><tbody><tr><td>20 ml Luer lock syringes</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>20% Human serum albumin (HSA)</td><td>CSL Behring</td><td>AUST R 46283</td><td></td></tr><tr><td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156477-25g</td><td></td></tr><tr><td>500ml IV saline bag</td><td>Fresenius Kabi</td><td>K690521</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240112</td><td></td></tr><tr><td>Automated cell counter (Countess)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cell counting chamber slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Cell stimulation cocktail (500x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4970-93</td><td></td></tr><tr><td>Cell transfer bags</td><td>Terumo</td><td>T1BBT060CBB</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>DMEM: F12 media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>EnVision plate Reader</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Human Interleukin 2 (IL2) Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>Al221C</td><td></td></tr><tr><td>Luer (female) fittings</td><td>CPC</td><td>LF41</td><td></td></tr><tr><td>PC laptop or PC tablet device</td><td>ASUS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader (SpectraMax i3)</td><td>Molecular Device</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IFN-&gamma;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Rotea counterflow centrifuge cell processing device</td><td>Scinogy</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rotea single-use processing kit</td><td>Scinogy</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>ProSciTech</td><td>420SS</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399-250g</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr></tbody></table>

geautomatiseerd centrifugale systeem voor kleinschalige celverwerking

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Succesvolle commercialisering van gen-en cel-gebaseerde therapieën vereist productieprocessen die kosteneffectief en schaalbaar zijn. Buffer uitwisseling en productconcentratie zijn essentiële onderdelen voor de meeste productieprocessen. In de vroege stadia van productontwikkeling worden deze stappen echter vaak handmatig uitgevoerd. Handmatige Dead-End-centrifugeren voor buffer uitwisseling is arbeidsintensieve, dure en niet schaalbaar. Een gesloten geautomatiseerd systeem kan deze moeizame stap effectief elimineren, maar de implementatie kan een uitdaging zijn. Hier beschrijven we een nieuw ontwikkeld apparaat voor celverwerking dat geschikt is voor kleine tot middelgrote celverwerking en is bedoeld om de kloof tussen handmatige verwerking en grootschalige automatisering te overbruggen. Dit protocol kan eenvoudig worden toegepast op verschillende celtypen en processen door het debiet en de centrifugeersnelheid te wijzigen. Ons protocol toonde een hoog celherstel met Kortere verwerkingstijden in vergelijking met het handmatige proces. Cellen hersteld van het geautomatiseerde proces ook gehandhaafd hun proliferatie tarieven. Het apparaat kan worden toegepast als een modulair onderdeel in een gesloten fabricageproces om stappen zoals buffer uitwisseling, celformulering en cryopreservation te accommoderen.

In dit protocol gebruikten we Jurkat-cellen en MSCs als representatieve voorbeelden om het geautomatiseerde buffer uitwisselingsproces aan te tonen. Tijdens het proces deelden Jurkat-cellen en MSCs dezelfde verwerkingsstappen met verschillen in centrifugale kracht en pompsnelheid die de stroomsnelheid regelen (tabel 1). Figuur 2 toont representatieve beelden die zijn vastgelegd door de camera van hoe het wervelbed van de cel kan verschijnen tijdens het proces van de buffer w...

Automatisering is de sleutel tot opschaling en kostenbeheer in celproductie. Dit manuscript beschrijft het gebruik van een tegenstroom centrifugale celverwerkings inrichting voor het automatiseren van de buffer uitwisseling en celconcentratie stappen voor kleinschalige bioprocessing.

Geautomatiseerd centrifugale systeem voor kleinschalige Celverwerking

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Dit protocol biedt een oplossing voor gesloten geautomatiseerde bufferuitwisseling en -concentratie voor kleinschalige celproductie. Belangrijk is dat de bufferuitwisseling kan worden uitgevoerd met een hoog herstel en een levering van een zeer klein volume geconcentreerd product. Nieuwe gebruikers kunnen moeite hebben om alle automatiseringsstappen te volgen.Het oefenen van het programmeren van deze stappen en het uitvoeren van testruns met medium zijn goede manieren om vertrouwd te raken met het apparaat. Gebruik voor het begin van de bufferuitwisseling, in een klasse twee laminaire stroomkop, een spuit en naaldassemblage om 50 milliliter zoutoplossing uit een zoutzak van 500 milliliter te verwijderen. Vervang dit volume door 50 milliliter van 20% menselijk serum albumine, en oogst de cellen van belang uit hun kweekvaten.Gebruik na het tellen de spuit om de cellen in een overdrachtszak te laden en gebruik het Luer-slot om de overdrachtszak aan te sluiten op een verwerkingsset voor eenmalig gebruik. Sluit vervolgens de eerder bereide zak wasbuffer aan op de verwerkingskit voor eenmalig gebruik. Als u een geautomatiseerde bufferuitwisseling wilt instellen, opent u de grafische gebruikersinterface van het apparaat en klikt u op de startknop.Klik nieuw om een nieuw protocol te maken en klik op besturingselement om de kleppen te selecteren die moeten worden geopend en gesloten, de middelpuntvliedende en pompsnelheden, de pomprichting en de actietriggers. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, klikt u op Opslaan. Hang de aangesloten geschikte zakken op het apparaat en plaats de verwerkingsset voor eenmalig gebruik op de machine.Klik vervolgens op de connect-knop en download het opgeslagen programma. Wanneer de afspeelknop oplicht, is het protocol klaar om te worden gestart. Als u de automatische bufferuitwisseling wilt uitvoeren, opent u de handmatige klemmen voor de slang voor de overdrachtszak en klikt u op start om het bufferuitwisselingsprogramma te starten.Aan het einde van de automatisering stap zes, zal het proces pauzeren als gevolg van triggering van de bubble sensor door de lucht in de nu lege zak. Als de zak inderdaad leeg is, drukt u naast het proces naar de volgende stap. Wanneer het geautomatiseerde proces is voltooid, sluit u alle buizenklemmen en opent u de deur van het apparaat.Verwijder vervolgens de kit voor eenmalig gebruik van het apparaat en koppel de spuit los zodat de cellen kunnen worden verzameld voor verdere analyse. Typisch, de gefluïde cel bed zal verschijnen zoals weergegeven in dit beeld met de cellen accumuleren in het midden en naar de voorkant van de kegel, een kleine ruimte aan het uiteinde van de kamer waarin de cellen zich niet accumuleren, en een zichtbare opening in de cel laden inlaat. Het gefluïde celbed kan worden gecomprimeerd bij de invoering van een nieuwe buffer die zich op een andere viscositeit of dichtheid bevindt.Een hoge stroomsnelheid kan worden toegepast om te selecteren voor levende cellen als dode cellen zijn kleiner en lichter en kan worden gedwongen uit de kamer door het verhogen van de stroomsnelheid. Het geautomatiseerde proces van bufferuitwisselingsverwerkingstijd is korter dan dat van het handmatige bufferuitwisselingsproces. In deze analyse waren de herstelsnelheden tussen de handleiding en de geautomatiseerde processen vergelijkbaar voor beide geteste cellen en werd de levensvatbaarheid van de cel niet beïnvloed door beide processen.De herstelde cellen toonden vergelijkbare proliferatiepercentages, vermogens om cytokinen te produceren en ideo-activiteiten, ongeacht het type verwerking. Het is belangrijk om te onthouden dat dit protocol alleen dient als richtlijn, en daarom moeten gebruikers de stroomsnelheid en centrifugatiesnelheid programmeren op basis van hun celtype en buffer. Buffer uitwisseling is een tussenstap in de cel productie die celcultuur uitbreiding of cryopreservatie en formulering kan volgen.Het doel is om manieren te ontwikkelen om het hele proces in te sluiten. Counterflow centrifugation is een zeer veelzijdig platform. Toekomstige studies zullen toepassingen in celselectie onderzoeken, zoals dode celverwijdering en mononucleuscelisolatie van een chorisisproduct.

automated-counterflow-centrifugal-system-for-small-scale-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We hebben een geautomatiseerde celkweek en verhoor platform ontwikkeld voor micro-schaal cel stimulatie experimenten. Het platform biedt eenvoudige, veelzijdige en precieze controle in het cultiveren en stimuleren van kleine populaties van cellen en het terugwinnen van lysaten voor moleculaire analyses. Het platform is geschikt voor studies die kostbare cellen en / of reagentia.

Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten

Dit protocol beschrijft een systeemarchitectuur voor het uitvoeren van geautomatiseerde scheidingen van kleine volumes (0,15–1,5 ml) deeltjes met behulp van een microfluïdisch apparaat, en bespreekt methoden om de prestaties en werking van acoustofluïdische apparaten te optimaliseren.

Een microfluïdische platform voor Precision Small-volume monster verwerking en het gebruik ervan te Grootte Aparte Biologische Deeltjes met een akoestische microdevice

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Dit protocol beschrijft het gebruik van een inertiale-microfluidics gebaseerde buffer wisselkoersstrategie micro / nanodeeltjes gemanipuleerde cellen te zuiveren efficiënte uitputting van ongebonden deeltjes.

Microfluïdische Buffer Exchange voor Interference-free Micro / nanodeeltjes Cel engineering

Dit protocol beschrijft het gebruik van centrifugaal elutriation te scheiden van primaire acute lymfatische leukemie cellen in verschillende celcyclus fasen.

Voorbereiding van primaire Acute lymfatische leukemie cellen in verschillende celcyclus fasen door centrifugaal Elutriation

Dit artikel presenteert een methode om een goedkoop, meerkanaals perfusiecelkweeksysteem te construeren en te gebruiken voor het meten van de dynamiek van secretie en absorptiesnelheden van opgeloste stoffen in cellulaire processen. Het systeem kan cellen ook blootstellen aan dynamische stimulusprofielen.

Multi-Stream Perfusion Bioreactor geïntegreerd met Outlet Fractionation voor dynamische celcultuur

Dit protocol biedt een snelle en groottespecifieke isolatiemethode voor kleine extracellulaire blaasjes door de grootte van de luchtsproeikop te optimaliseren, de druk van de mantelvloeistof, de druk van de monsterstroom, de spanning, versterking en triggerdrempelparameters.

Optimalisatie van flowcytometrische sorteerparameters voor isolatie met hoge doorvoer en zuivering van kleine extracellulaire blaasjes

Hier presenteren we een protocol om aanhangende cellen uit meerlaagse kolven op een gesloten semi-geautomatiseerde manier te oogsten met behulp van een tegenstroomcentrifugatiesysteem. Dit protocol kan worden toegepast voor het oogsten van zowel adherente als suspensiecellen van andere celexpansieplatforms met weinig aanpassingen aan de bestaande stappen.

Menselijke mesenchymale stamcelverwerking voor klinische toepassingen met behulp van een gesloten semi-geautomatiseerde workflow

Extracellulaire blaasjes zijn veelbelovend voor biomedische toepassingen, maar de huidige isolatiemethoden zijn tijdrovend en onpraktisch voor klinisch gebruik. In deze studie presenteren we een microfluïdisch apparaat dat de directe isolatie van extracellulaire blaasjes uit grote hoeveelheden biovloeistoffen op een continue manier met minimale stappen mogelijk maakt.

Isolatie in één stap van extracellulaire blaasjes uit monsters met een groot volume met een gespleten A4F-microfluïdisch apparaat

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve methode om de extractie van plasmide-DNA te versnellen. Door gebruik te maken van op maat gemaakte 3D-geprinte rekken die compatibel zijn met standaard schandelbakplaatrotoren, kunnen onderzoekers tot 48 spinkolommen met doppen of tot 116 spinkolommen zonder doppen tegelijk verwerken, wat de verwerkingstijd aanzienlijk vermindert vergeleken met handmatige microcentrifugemethoden.

Medium-throughput kolom DNA-extractie met behulp van 24-well racks

Leer een geautomatiseerd centrifugaal systeem voor kleinschalige celverwerking met hoge opbrengst. Dit protocol verbetert efficiëntie en betrouwbaarheid in celproductie.

Geautomatiseerd centrifugale systeem voor kleinschalige Celverwerking

Meer video's verkennen