Klonale genetische tracing met de confetti muis om gemineraliseerde weefsels te bestuderen

Door individuele cellen genetisch te labelen met fluorescerende eiwitten en deze cellen na verloop van tijd te volgen, heeft de Confetti Mouse onderzoekers in staat gesteld om nieuwe inzichten in veel biologische processen te onthullen. Ons protocol minimaliseert de vertragingstijd tussen weefselverzameling en beeldvorming, kan worden toegepast op gemineraliseerd of niet-gemeeraliseerd weefsel en behoudt fluorescentie gedurende meerdere jaren. Deze methode is zeer nuttig voor alle gebieden van regeneratieve geneeskunde en ontwikkelingsbiologie omdat het op verschillende cellulaire bevolking kan worden toegepast om hun lot en hun kinetiek te bestuderen zolang een geschikte lijn Cre beschikbaar is.

Onze stapsgewijze instructies tonen de meest uitdagende stap om het verschil van fluorescerende signalen uitgezonden door verschillende fluorescerende eiwitten te onderscheiden. Begin met het voorbereiden van het muisweefsel voor beeldvorming. Voor zachte weefsels en gemineraliseerde scheenbeen en femora van muizen tot 45 dagen oud, bevestig het weefsel in voorgekoelde 3,7% formaldehyde PBS en uitbroed het op 4 graden Celsius gedurende zes uur tijdens het rollen zachtjes op een rotator.

Voor gemineraliseerde weefsels zoals scheenbeen en femora van muizen ouder dan 45 dagen, bereid een liter van 10%EDTA oplossing met de pH aangepast aan 8,05 met natriumhydroxide en verdun de formaldehyde tot 3,7%met behulp van deze oplossing. Fix het weefsel door het te houden in 3,7% formaldehyde PBS 's nachts op 4 graden Celsius. Plaats het de volgende dag in de voorgekoelde formaldehyde EDTA-oplossing en broed deze uit op 4 graden Celsius terwijl u 48 uur draait, zodat u de oplossing tijdens de incubatie drie keer vervangt.

Plaats vervolgens het weefsel in voorgekoelde 30%sucrose, zorg ervoor dat de container te vullen tot de rand, en zachtjes draaien 's nachts op vier graden Celsius. In de ochtend, gebruik tangen om het weefsel te verwijderen uit de sacharose oplossing en spoel het in vijf milliliter van optimale snijtemperatuur verbinding, of OCT, voor een paar seconden. Vul een vooraf gelabelde cryomold met OCT en plaats het weefsel aan de onderkant, snel werken om te voorkomen dat het monster zit bij kamertemperatuur te lang.

Sluit het monster in door de mal op droogijs te plaatsen en te wachten tot de LGO stolt. Als de monsters niet onmiddellijk worden gebruikt, kunnen ze worden opgeslagen bij min 20 graden Celsius. Verwijder het blok uit de mal.

Breng OCT tussen de bovenkant van het blok en de chuck en koel het in de cryostat gedurende ten minste vijf minuten of totdat de OKT volledig stolt. Koel de monsterhouder en de bladhouder voor tot min 20 graden Celsius, plaats het monster vervolgens in de klemhouder en het blad in de bladhouder en laat ze enkele minuten equilibrate. Voor postnatale groeiplaatanalyse bereidt u secties voor die 30 tot 160 micrometer zijn.

Gebruik de cryostat om het blok te trimmen en weefselsecties tot een geschikte dikte te snijden en ze op dia's te verzamelen. Dan drogen de glijbanen op kamertemperatuur tot ze volledig droog zijn en bewaar ze tot min 20 graden Celsius gedurende maximaal 36 maanden. Wanneer u klaar bent om de glijbaan te gebruiken, verwijdert u deze uit de vriezer en brengt u deze op kamertemperatuur in een schuifhouder.

Als u de OCT wilt verwijderen, brengt u pbs voorzichtig aan op de glijbaan met de Pasteurpipet. Voor 160 micrometer dikke secties, incubeer de dia gedurende 15 minuten, verwijder de vloeistof en breng verse PBS voor vijf minuten. Monteer de glijbanen in een oplossing van 75% thiodiethanol bij kamertemperatuur met 60 millimeter lange afdekslips.

Selecteer eerst het RFP-kanaal door erop te klikken op het tabblad Kanalen, waardoor de details van het kanaal worden weergegeven op het tabblad lichtpad. Klik vervolgens op het vinkje naast T-PMT. Plaats de dia in de schuifhouder en plaats het weefsel van belang direct tussen het lichtpad en de objectieve lens.

Als u het weefsel wilt lokaliseren, schakelt u de YFP- en GVB-vakken uit onder de hoofdaandondering van het tabblad Kanalen. Selecteer het T-PMT-kanaal in de kop tracks, klik vervolgens live op het tabblad acquisitie en verhoog de winst voor het T-PMT-kanaal om de weefselselectie op het scherm te visualiseren. Pas de positie van de dia aan om het interessegebied te lokaliseren en scherp te stellen met de juiste microscoopknop.

Klik vervolgens op stop in het tabblad acquisitie om de blootstelling aan de laser uit te schakelen. Definieer beeldvormingsparameters volgens de manuscriptinstructies en pas indien nodig de pinholegrootte aan. Controleer de installatie om ervoor te zorgen dat de opgenomen signalen elkaar niet overlappen, selecteer vervolgens alle drie de kanalen op het tabblad Kanalen en druk op de knop Klik.

Schuif tussen de weergavekanalen in de resulterende afbeelding door op de blauw gemarkeerde vakjes boven elk kanaal in het tabblad Afmetingen te klikken en controleer handmatig op overlap tussen de kanalen op het scherm. Als de signalen elkaar overlappen, pas dan de parameters aan totdat ze van elkaar kunnen worden onderscheiden. Dit protocol werd gebruikt om chondrocyten in het epifyseale kraakbeen te etiketteren en hun kloonuitbreiding met de leeftijd te visualiseren.

De centrale sectie werd bepaald door het visualiseren van de kruisband en klonen in de proximale scheengroeiplaat werden afgebeeld. Individuele cellen die Col2 positief waren en werden gelabeld met Confetti fluorescerende eiwitten bij tamoxifen toediening, onderging kloonuitbreiding en bleven vervolgens in de groeiplaat. Het fluorescerende signaal kan worden gevisualiseerd na langdurige opslag.

Sommige secties werden meer dan drie jaar bewaard voorafgaand aan de voorbereiding en beeldvorming. Driedimensionale reconstructie werd automatisch uitgevoerd met beeldanalysesoftware en geëxporteerd als een video. Een sectie gebroken tijdens de cryosectioning stap bevat een gebied met zo'n hoog niveau van recombinatie dat het zou kloonanalyse te voorkomen, waaruit blijkt een van de gemeenschappelijke problemen ondervonden met dit protocol.

Afhankelijk van uw onderzoeksvraag, met behulp van een Cre lijn die specifiek labels uw cellen van belang kan zeer belangrijk zijn. Daarom raden we aan om fluorescentie in die cellen kort na de recombinatie te controleren. Het gebruik van inducible Cre lijnen is essentieel omdat de lopende DNA-recombinatie in niet-induceerbare Cre lijnen kan veranderen het fluorescerende profiel van de soluted cellen waardoor klonale analyse af te wijken.

Dit protocol kan worden gecombineerd met functionele verstoringen zoals genetisch gemanipuleerde stammen, farmacologische behandelingen, chirurgische ingrepen, evenals immuno fluorescentie kleuring van voorbereide secties.