Name: In Vitro Beoordeling van cardiale functie met behulp van gevilde cardiomyocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Leer de extractie en beoordeling van cardiale functie met gevilde cardiomyocyten. Deze methode analyseert myofilamentfunctie en calciumgevoeligheid uit kleine biopten voor cardiovasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Portugese Stichting voor Wetenschap en Technologie (FCT), Europese Unie, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) en Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) voor de financiering van UnIC (UID/IC/00051/2013) onderzoekseenheid. Dit project wordt ondersteund door FEDER via COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), het project DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), ondersteund door het regionale operationele programma van Norte Portugal (NORTE 2020), in het kader van de partnerschapsovereenkomst van Portugal 2020, via het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO), het project NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), ondersteund door Europese structuur- en investeringsfondsen, het regionale operationele programma van Lissabon 2020. Patrícia Rodrigues werd gefinancierd door FCT (SFRH/BD/96026/2013) en João Almeida-Coelho was van Universidade do Porto/FMUP en FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).

<ol><li>Leite-Moreira, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+compliance%3A+a+novel+adaptive+biological+mechanism+following+acute+cardiac+load%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load.</a> Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).</li>
<li>Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+myocardial+stiffness+by+%CE%B2-adrenergic+stimulation+-+its+role+in+normal+and+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation of myocardial stiffness by β-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart.</a> Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).</li>
<li>Cokkinos, D. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCokkinos%2C+DV+%22Introduction+to+Translational+Cardiovascular+Research%22">Introduction to Translational Cardiovascular Research</a>. , Springer International Publishing. 371-387 (2015).</li>
<li>van der Velden, J., Stienen, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Disorders+and+Pathophysiology+of+Sarcomeric+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac Disorders and Pathophysiology of Sarcomeric Proteins.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 381-426 (2019).</li>
<li>Garnier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+procedures+for+mechanical+manipulation+of+isolated+cardiac+myocytes%3A+a+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Attachment procedures for mechanical manipulation of isolated cardiac myocytes: a challenge.</a> Cardiovascular Research. 28 (12), 1758-1764 (1994).</li>
<li>Brady, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+isolated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of isolated cardiac myocytes.</a> Physiological Reviews. 71 (2), 413-428 (1991).</li>
<li>Falcao-Pires, I., Leite-Moreira, A. F. Chapter 20. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFalcao-Pires%2C+I+%22Introduction+to+Translational+Cardiovascular+Research%22">Introduction to Translational Cardiovascular Research</a>. Cokkinos, D. V. 20, Springer, Cham. 371-387 (2015).</li>
<li>Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+calcium-induced+calcium+release+in+cardiomyocytes+using+a+classic+paper+by+Fabiato%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+Physiology+Education%22%5BJournal%5D)">Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using a classic paper by Fabiato.</a> Advances Physiology Education. 32 (1), 1-10 (2008).</li>
<li>Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Maximum+Isometric+Force+Generated+by+Permeabilized+Skeletal+Muscle+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52695(2015).</li>
<li>Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+structure+and+theories+of+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Muscle structure and theories of contraction.</a> Progress Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).</li>
<li>Sequeira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+role+of+ADP+and+Ca%282%2B%29+in+diastolic+myocardial+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synergistic role of ADP and Ca(2+) in diastolic myocardial stiffness.</a> Journal Physiology. 593 (17), 3899-3916 (2015).</li>
<li>Edes, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+tension+redevelopment+is+not+modulated+by+sarcomere+length+in+permeabilized+human%2C+murine%2C+and+porcine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology+Regulatory+Integrative+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rate of tension redevelopment is not modulated by sarcomere length in permeabilized human, murine, and porcine cardiomyocytes.</a> American Journal Physiology Regulatory Integrative Comparative Physiology. 293 (1), R20-R29 (2007).</li>
<li>King, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intact+cardiac+myocyte+mechanics%3A+cross-bridge+and+titin-based+stress+in+unactivated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mouse intact cardiac myocyte mechanics: cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells.</a> Journal General Physiology. 137 (1), 81-91 (2011).</li>
<li>Hamdani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+titin+hypophosphorylation+importantly+contributes+to+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction+in+a+rat+metabolic+risk+model%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model.</a> Circulation Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).</li>
<li>Miranda-Silva, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+biventricular+alterations+in+myocardial+%28reverse%29+remodelling+in+aortic+banding-induced+chronic+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2956(2019).</li>
<li>Rodrigues, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+myocardial+changes+induced+by+doxorubicin+in+the+nonfailing+dilated+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology+Heart+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Early myocardial changes induced by doxorubicin in the nonfailing dilated ventricle.</a> American Journal Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (3), H459-H475 (2019).</li>
<li>van der Velden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+myofilament+function+contribute+to+left+ventricular+dysfunction+in+pigs+early+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).</li>
<li>Wakili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+potential+molecular+contributors+to+atrial+hypocontractility+caused+by+atrial+tachycardia+remodeling+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Arrhythmia+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs.</a> Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).</li>
<li>Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+cardiac+sarcomeric+proteins+in+the+myofibrillar+force+response+to+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch.</a> Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).</li>
<li>Falcao-Pires, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+worsens+diastolic+left+ventricular+dysfunction+in+aortic+stenosis+through+altered+myocardial+structure+and+cardiomyocyte+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness.</a> Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).</li>
<li>Lim, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthracyclines+induce+calpain-dependent+titin+proteolysis+and+necrosis+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biology+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes.</a> Journal Biology Chemistry. 279 (9), 8290-8299 (2004).</li>
<li>Woulfe, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+of+Isolating+Myofibrils+From+Primary+Cardiomyocyte+Culture+Suitable+for+Myofibril+Mechanical+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study.</a> Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12(2019).</li>
<li>Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+cardiac+biophysical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Cardiology+Science+Practice%22%5BJournal%5D)">Exploring cardiac biophysical properties.</a> Global Cardiology Science Practice. 2015, 10(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflict.

In vitro beoordeling van de hartfunctie met behulp van gevilde cardiomyocyten is een belangrijke techniek om de wijzigingen die zich op cardiomyocytenniveau in fysiologische (bijvoorbeeld stretch) en pathologische context (bijvoorbeeld ischemie) voordoen, te verduidelijken. Deze methode heeft verschillende voordelen, zoals het vereisen van een minimale hoeveelheid myocardium om de functie in cardiomyocyten verkregen uit ontdooide monsters te beoordelen; met behulp van cardiomyocyten van een breed scala aan soorten (muizen13, rat1,14,15, konijn16, varken17, hond18, cavia19 en menselijke20) en verschillende hartlocaties, waaronder de atria, linker en rechter ventrikels of een specifieke regio van het infarct hart. Bovendien maakt deze techniek het mogelijk om specifieke concentraties van Ca2+ en energie (ATP) te leveren terwijl de functie van regelgevende en contractiele structuren in hun eigen configuratie wordt gemeten.
Ondanks de eenvoud van deze techniek, zijn er enkele kritische stappen. Het is essentieel om de kwaliteit van elke stap vanaf het begin te garanderen, inclusief het verzamelen van monsters. Myofilament eiwitten zijn gevoelig voor proteases21. Zo is het verplicht om monsters onmiddellijk na de inzameling in vloeibare stikstof op te slaan. Verse monsters, die niet eerder bevroren waren, zullen aanzienlijk hogere krachten ontwikkelen, dus het is niet raadzaam om metingen in verse en bevroren monsters in hetzelfde protocol te mengen. De tweede meest kritieke stap is de extractie van de cardiomyocyten. Tijdens deze procedure is het meestal van cruciaal belang om het monster op ijs te houden. Een proteaseremmercocktail kan worden gebruikt om het risico op eiwitdegradatie tijdens de extractie/permeabilisatie te verminderen22. Ten derde, monsters moeten worden gesneden in kleinere stukken met behulp van nauwkeurige scalpel bewegingen, omdat we opgemerkt verminderde kwaliteit cardiomyocyten wanneer deze stap werd genegeerd. Een andere kritieke stap is het wassen van de cardiomyocyten omdat het moeilijk is om de juiste balans tussen het uitwassen van Triton (permeabiliseert de cel, maar bevordert de ungluing) en het houden van zo veel cellen in de supernatant mogelijk. Het is belangrijk om eerst de extractie en het aantal washouts voor elk monster, soort of protocol te proberen. Bijvoorbeeld, in onze handen, merkten we op dat ZSF1 zwaarlijvige rattenweefsel extracties hebben een "vet" aspect, waardoor deze cellen meer glad tijdens het lijmen, maar niet moeilijker te meten. De manier waarop we dit probleem omzeilen was door meer experimenten uit te voeren om een redelijk aantal cellen per dier te hebben. Bovendien is het cruciaal om een goede cel te selecteren om te lijmen, namelijk met een goede striatie en redelijke lengte. Als de cardiomyocyte deze functies niet heeft, zal het meestal loskomen van de naaldtips of geen/lage kracht ontwikkelen. Het is ook belangrijk om de juiste lijm te gebruiken voor cardiomyocyte gehechtheid, gezien de tijd van lijmen en de werkzaamheid ervan om de cel aan de naald te lijmen. In onze handen geneest de siliconenlijm(Table of Materials)snel (10-15 min) en sterk genoeg. Ten slotte is de laatste kritieke stap gerelateerd aan het zorgvuldig opheffen van de cardiomyocyte 5 min na het lijmen van de cel (om te voorkomen dat de cel aan de coverslip wordt gelijmd) en voordat u deze naar de putten verplaatst (om te voorkomen dat de cel door de microscoopfase wordt gesleept). Tabel 7 geeft een overzicht van de probleemoplossing in verband met deze techniek, de onderliggende oorzaken en mogelijke oplossingen om veelvoorkomende problemen op te lossen.
De belangrijkste beperking van deze methode is dat het niet alle vragen met betrekking tot de myofilament contractility kan beantwoorden, zoals hoe snel de myofilaments activeren/deactiveren. In de in vivo-instelling moeten membraandepolarisatie, intracellulaire Ca2+ toename en de verspreiding ervan naar myofilamenten optreden voor de myocyten om samen te trekken, terwijl in gevilde cardiomyocyten Ca2+ diffusie naar myofilaments onmiddellijk optreedt wanneer de cel wordt ondergedompeld in de Ca2+ oplossing. Deze snellere snelheid van Ca2 + diffusie zal bias myofilaments activering / deactivering analyse23.
Deze experimenten worden beïnvloed door verschillende factoren, waaronder de temperatuur, oplossing pH, mechanische verstoring (slack-re-stretch vs slack) en cel bevestiging procedures (pin tie vs lijm), al deze variabelen goed voor literatuur discrepanties in termen van ktr en de sarcomere lengte-afhankelijke toename van kracht4,12.
Toekomstige vooruitgang van de techniek omvat het uitvoeren van functionele studies in intacte in plaats van permeabilized cardiomyocyten. Deze techniek heeft als nadeel van een beroep op cardiomyocyten vers geïsoleerd (niet eerder bevroren). Een andere belangrijke kwestie die niet rechtstreeks verband houdt met deze methode, maar die een aanzienlijke invloed kan hebben, heeft betrekking op de maximale periode van monstergevroren opslag. In het bijzonder is het verplicht om de mate van myofilament afbraak vast te stellen gedurende de opslagtijd (dat wil zeggen, voor hoe lang bevroren monsters kunnen worden opgeslagen om te zorgen voor een goede kwaliteit functionele gegevens afgeleid van de geëxtraheerde cardiomyocyten).

Traditioneel is de beoordeling van myocardiale mechanische eigenschappen meestal geprobeerd in meercellige preparaten, zoals papillaire spieren en trabeculae1,2. Meercellige cardiale spieren strips omvatten een heterogene populatie van cellen, met inbegrip van contractiel cardiomyocyten met een onbekend patroon van oriëntatie en kracht generatie, elektrische activiteit en stress / stam distributies, evenals een omringende bindweefsel matrix3,4. Een preparaat zonder collageen en met een enkele cardiomyocyte zou het mogelijk maken de sarcomere lengte en cross-bridge contractiel eigenschappen op een zeer nauwkeurige en gecontroleerde manier5,6. Daarom zijn in de afgelopen vier decennia verschillende methoden ontwikkeld die het mogelijk maken de mechanische, contractiele en ontspanningseigenschappen van één cardiomyocyte6,7teonderzoeken . De contractiele functie van deze cellen is sterk afhankelijk van sarcomere lengte en cross-bridge fietsen kinetiek3. Zo is het wenselijk om de spierfunctie direct te onderzoeken in enkele geïsoleerde hartcellen, gezien het feit dat het mogelijk maakt sarcomere lengte en prestaties te beoordelen, evenals cross-bridge functie en contractiele eigenschappen. Het isoleren en bevestigen van functionele cardiomyocyten met een redelijke optische sarcomereresolutie tijdens het opnemen van krachtmeting op μN-niveau is echter nog steeds uitdagend en evoluerend3,6. Andere uitdagingen zijn de logistiek die moet worden geïnstalleerd om cardiomyocyten te isoleren van vers ingezamelde biopten. De onvoorspelbaarheid van de verzameling van menselijke biopten kan bijvoorbeeld de haalbaarheid van de experimenten in gevaar brengen.
Bovendien hebben ethische bezwaren met betrekking tot de vervanging, vermindering en verfijning van dierproeven voor wetenschappelijke procedures (beginselen van de 3R's) studies op cellulair en weefselniveau bevorderd, bij voorkeur in menselijke biopten, of in kleinere diermonsters. Een geleidelijke verfijning van methodologieën om de hartfunctie in vitro op een kleiner niveau van complexiteit te beoordelen, maakt een goede integratie van de resultaten met het hele lichaam mogelijk en vertaalt deze naar het klinische scenario7. Al met al kan het gebruik van monsters die bij -80 °C zijn opgeslagen om cardiomyocyten te extraheren een aantrekkelijk alternatief zijn.
Het myocardiaal weefsel wordt in kleine stukjes gesneden en gehomogeniseerd met een mortier en een stamper. Het resultaat van deze homogenisatie is een suspensie van gevilde gebundelde en geïsoleerde cellen met verschillende mate van sarcolemmale schade, waarbij het myoplasma wordt blootgesteld aan het badmedium en alle cellulaire componenten worden uitgewassen. Structuren zoals de myofibrils die verder van de sarcolemma verwijderd zijn, worden bewaard. Zo worden sarcomere verkorting en functionele eigenschappen in verband met het myofibrillar apparaat intact gehouden en kunnen8,9worden geregistreerd .
Het cardiomyocyte krachtmeetsysteem bestaat uit een elektromagnetische motor, gebruikt om de cardiomyocyte lengte aan te passen, en een krachttransducer, die isometrische cardiomyocyte contractie meet. Een permeabiliseerde of gevilde cardiomyocyte wordt geplaatst in een experimentele kamer met een ontspannende oplossing ([Ca2+] < 10 nM) en silicium gelijmd aan 2 dunne naalden: een bevestigd aan de motor en de andere aan de krachttransducer. Een optisch systeem wordt gebruikt om cardiomyocyte morfologie en sarcomere lengte te bepalen. Het experimentele protocol bestaat vaak uit een reeks krachtopnames op bufferoplossingen die verschillende Ca2+ concentraties bevatten, de bepaling van actin-myosine cross-bridge kinetiek en het meten van de passieve spanning van de gemonteerde cardiomyocyten op vooraf gedefinieerde sarcomerelengtes(figuur 1). Isolatie van permeabiliseerde cardiomyocyten van myocylaten bevroren in vloeibare stikstof (en vervolgens opgeslagen bij -80 °C) is een techniek die gebruik maakt van cellulaire mechanica en eiwitbiochemie voor het meten van maximale Ca2 +-geactiveerde (actieve) kracht per dwarsdoorsnedegebied (Tactief, kN·m-2), Ca2+-onafhankelijk (passieve) spanning (Tpassief, kN·m-2), myofilaments Ca2+-sensitiviteit (pCa50), myofilaments cooperativity (nHill), het tempo van krachtherontwikkeling (ktr) en sarcomere lengte afhankelijkheden van Tactief, Tpassief, pCa50, nHill en ktr.
Het doel van dit protocol is om het potentieel van het cardiomyocyte krachtmeetsysteem te illustreren en samen te vatten als een betrouwbare procedure om de functionele mechanische eigenschappen van enkel gevilde cardiomyocyten geïsoleerd van bevroren monsters van verschillende soorten te beoordelen.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&rsquo;-trifosfaat dinatriumzouthydraat (Na2ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Calciumcarbonaat (CaCO3)</td><td>Merck</td><td>1.02067.0500</td><td></td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>VWR</td><td>24720.157</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat (MgCl2.6H2O)</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride-oplossing (MgCl2 1M)</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES)</td><td>Sigma</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Fosfocreatine dinatriumzouthydraat (Na2PCr)</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCl)</td><td>Merck</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide (KOH)</td><td>Merck</td><td>8.14353.1000</td><td></td></tr><tr><td>Propionzuur (C3H6O2)</td><td>Merck</td><td>8.00605.0500</td><td></td></tr><tr><td>Siliconen spuitbus</td><td>Marineland</td><td>31003</td><td></td></tr><tr><td>Tritiplex (EGTA)</td><td>Merck</td><td>1.08435.0025</td><td></td></tr><tr><td>Triton&reg; X-100 10%</td><td>Merck</td><td>648463</td><td></td></tr><tr><td>Weefselhomogenisator (GKH GT Motor Control)</td><td>Terre Haute Glas-col</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lengteregelaar (Model 315C-I)</td><td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krachttransducer (Model 403 A)</td><td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ASI 600A</td><td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software VSL (Model 900B)</td><td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerd microscoop (IX51)</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro beoordeling van cardiale functie met behulp van gevilde cardiomyocyten

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In dit artikel beschrijven we de stappen die nodig zijn om een enkele permeabiliseerde cardiomyocyte ("gevild") te isoleren en te bevestigen aan een krachtmeetapparaat en een motor om functionele studies uit te voeren. Deze studies zullen het mogelijk maken cardiomyocyte stijfheid (passieve kracht) en de activering ervan met verschillende calcium (Ca2 +)-bevattende oplossingen te bepalen, onder andere: maximale kracht ontwikkeling, myofilament Ca2 +-gevoeligheid (pCa50), cooperativiteit (nHill) en de snelheid van kracht herontwikkeling (ktr). Deze methode maakt het ook mogelijk om de effecten van geneesmiddelen die rechtstreeks op myofilamenten werken en van de expressie van exogene recombinante eiwitten op zowel actieve als passieve eigenschappen van cardiomyocyten te bepalen. Klinisch, gevilde cardiomyocyte studies benadrukken de pathofysiologie van veel myocardiale ziekten en maken in vitro beoordeling van de impact van therapeutische interventies gericht op de myofilaments. Al met al maakt deze techniek het mogelijk om cardiale pathofysiologie te verduidelijken door correlaties te onderzoeken tussen in vitro en in vivo parameters in diermodellen en menselijk weefsel verkregen tijdens een open hart- of transplantatieoperatie.

Dit protocol is bedoeld om stapsgewijze de techniek van extractie en beoordeling van de hartfunctie te beschrijven met behulp van gevilde cardiomyocyten. Deze methode maakt het mogelijk om de myofilamentfunctie te meten en te acuut temodificeren met kleine bevroren biopsieën die kunnen worden verzameld vanaf verschillende hartlocaties, van muizen tot mannen.

In Vitro Beoordeling van cardiale functie met behulp van gevilde cardiomyocyten

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Deze techniek maakt verduidelijking van de pathofysiologie van hartaandoeningen mogelijk door onderzoek van de correlatie tussen in vitro en in vivo parameters in diermodellen en mensen. Het grootste voordeel van deze techniek is dat het de studie van diepe myofilamentfunctie mogelijk maakt met behulp van zeer kleine biopsieën of monsters die ingevroren zijn opgeslagen. Deze techniek maakt het mogelijk om in vitro de impact van therapeutische interventies op myofilamenten te beoordelen.Voordat u een experiment probeert, is het raadzaam om de extractie van cardiomyocyten een paar keer te oefenen om te leren hoe u cardiomyocyten met een goede grootte, striëring en vorm selecteert, plakt en activeert. Voordat u met de procedure begint, stelt u de temperatuur van het testapparaat in de kamer in op 15 graden Celsius en zet u de krachttransducer en de motor aan. Ontdooi drie tot vijf microgram myocardiaal monster in een petrischaal met 2,5 milliliter relax ISO-oplossing en gebruik een scalpel om het weefsel nauwkeurig in kleine stukken te snijden zonder onnodige celschade te veroorzaken.Wanneer al het weefsel is gesneden, gebruikt u een gesneden pipettip om het gehele volume oplossing en weefselfragmenten over te brengen in een Potter-Elvehjem glas en gebruikt u een grinder om het weefsel mechanisch te verstoren bij 30 tot 40 rotaties per minuut. Wanneer een goede cellensuspensie is verkregen, voegt u 250 microliters Triton toe aan een 15 milliliterbuisje met 2,25 milliliter relax ISO en voegt u de cellensuspensie toe aan de resulterende oplossing. Draai voorzichtig het buisje drie keer om te mengen en laat het buisje een minuut op kamertemperatuur staan, gevolgd door een vier minuten durende incubatie op ijs.Aan het einde van de ijsincubatie brengt u het eindvolume van het buisje op 15 milliliter met aanvullende relax ISO en mengt u de buisjes drie keer door inversie zoals gedemonstreerd, centrifugeert u vervolgens de cellen, verwijdert u vervolgens voorzichtig bijna alle vloeistof behalve de laatste drie milliliter van de supernatant. Na de laatste wassing verwijdert u de supernatant tot een volume van vijf tot 10 milliliter cellensuspensie. Voor de selectie van geskinnede cardiomyocyten, brengt u een druppel cellensuspensie aan op een dekglas geplaatst op een glasplaat in een omgekeerde microscoopslide-houder en gebruikt u de 20X objectief om een enkele staafvormige cardiomyocyte met een goed striëringspatroon en grootte te selecteren.Gebruik twee handen om het dekglas te draaien tot de geselecteerde cardiomyocyte horizontaal is gepositioneerd met de uiteinden uitgelijnd met de naald van de krachttransducer en de motor en gebruik een pipettip om een dunne lijn lijm langs de zijkant van het dekglas te plaatsen. Om de cel op zijn plaats te lijmen, dompelt u de naaldpunten van de krachttransducer en de motor in de lijmstrook om een lijmsfeer rond beide uiteinden te creëren en beweegt u snel de naaldpunt van de krachttransducer naar beneden zodat deze aan de ene kant van de cardiomyocyte plakt. Herhaal deze procedure met de punt van de motor en het andere uiteinde van de cel.Na vijf tot acht minuten, verplaatst u beide micro manipulators gelijktijdig om de naalden ongeveer 15 micrometer omhoog te brengen om te voorkomen dat de cel aan het dekglas wordt gelijmd. Om de actieve en passieve krachten en de calciumgevoeligheid te meten, vult u de eerste experimentele put met 55 tot 100 microliters ontspanningsoplossing en vult u de tweede experimentele put met 55 tot 100 microliters activerende oplossing. Gebruik de camerasoftware om het gebied van belang in te stellen op een gebied van de cardiomyocyte met een duidelijk striëringspatroon en stel de sarcomeerlengte in op 2,2 micrometer.Meet de afstand tussen de twee uitersten van de cardiomyocyte en noteer de waarde als de myocytlengte binnen de software. Vervolgens verplaatst u de naalden iets hoger en beweegt u voorzichtig het microscoopplatform zodat de cel van het dekglas naar de put met de ontspanningsoplossing aan de achterkant van het platform beweegt. Selecteer het protocol dat twee celverkortingen bevat die optreden wanneer de cel sequentieel in de calcium- en ontspanningsoplossingen terechtkomt.Om een isometrische samentrekking te veroorzaken, verplaatst u het microscoopplatform zodat de cardiomyocyte van de ontspannende naar de activerende oplossing beweegt. Wanneer het krachtplateau is bereikt, begint u de krachtgegevens te registreren. Na 10 seconden schakelt u de cel over naar de ontspanningsoplossing en registreert u de gegevens totdat het test stopt.Om de calciumgevoeligheid te bepalen, vervangt u de activerende oplossing door 55 tot 100 microliters van elke calciumoplossing en registreert u de gegevens zoals zojuist is gedemonstreerd. Aan het einde van de meting rekt u de uiteinden van de krachttransducer en motor uit om de naalden uit de cel te verwijderen en gebruikt u een wattenstaafje gedrenkt in aceton om voorzichtig de lijmsfeer van de naaldpunten te verwijderen. Hoewel een zekere mate van achteruitgang en krachtvermindering te verwachten is na langdurige experimenten, zouden de waarden van actieve spanning binnen de functionele permeabiliseerde cardiomyocyten relatief stabiel moeten zijn.Hier worden representatieve krachttrajecten van drie van de acht krachtopnamen die nodig zijn om een protocol van myofilament calciumgevoeligheid uit te voeren, getoond. Door de cel over te brengen naar een put met de activerende oplossing, beginnen de cardiomyocyten kracht te ontwikkelen totdat deze een plateau bereikt. Na een snelle ontspanningstest kunnen de basiswaarden van nulkracht worden verkregen.De helling van het laatste deel van deze curve kan worden gebruikt om de waarde van de snelheid van krachtontwikkeling te bepalen, wat een maatstaf is voor de schijnbare snelheid van crossbridge-aanhechting en loskoppeling. Nadat de cel is teruggeplaatst in een put met de ontspanningsoplossing, ontspant de cel en daalt de kracht. Naast de calciumgevoeligheid van myofilamenten en de lengteafhankelijke activeringsmetingen, kunnen de sarcomeerlengteafhankelijkheden van passieve spanning en de sarcomeerlengteafhankelijke calciumgeactiveerde kracht per dwarsdoorsnede en de calciumonafhankelijke spanning worden berekend.Ten slotte is het

in-vitro-assessment-of-cardiac-function-using-skinned-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Individuele cardiomyocyten van wilde type en mutante muizen kunnen uit het hart worden geïsoleerd om hun contractiliteit en calciumtransienten te bestuderen. Dit maakt het mogelijk om de bijdrage van cellulaire disfunctie aan hartdisfunctie, van welke oorzaak dan ook, te karakteriseren.

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Het epicardium is een essentiële bron van multipotente cardiovasculaire stamcellen en paracriene factoren die nodig zijn voor cardiovasculaire ontwikkeling en regeneratie. We beschrijven hier een methode om muis embryonale epicardiale cellen te kweken.

In Vitro Cultuur van epicardiale cellen uit muis embryonale Heart

Hier tonen we de generering van humane gemanipuleerde hartweefsel van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een methode om contractiekracht en voorbeeldige verandering van contractie patroon geanalyseerd door hERG kanaal remmer E-4031. Deze werkwijze vertoont een hoge mate van robuustheid en geschiktheid voor cardiale geneesmiddelscreening.

Geautomatiseerde Contractie Analyse van Human Engineered hartweefsel voor Cardiac Drug Safety Screening

Hier presenteren we een protocol voor de opleiding van de bevolking van een cel met behulp van elektrische en mechanische stimuli emuleren cardiale fysiologie. Deze elektromechanische stimulatie verbetert het cardiomyogenic potentieel van de behandelde cellen en is een veelbelovende strategie voor verdere celtherapie, ziekte modellering en drug screening.

Gelijktijdige elektrische en mechanische stimulatie ter verbetering van de cellen Cardiomyogenic potentieel

Dit protocol beschrijft de procedure voor het doorsnijden en kweken van menselijke cardiale plakjes voor preklinische geneesmiddelentesten en beschrijft het gebruik van optische mapping voor het opnemen van transmembranespanning en intracellulaire calciumsignalen gelijktijdig van deze plakjes.

Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes

We presenteren een model van ischemische hartziekten met behulp van cardiomyocyten afkomstig van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, samen met een methode voor kwantitatieve evaluatie van weefselschade veroorzaakt door ischemie. Dit model kan een nuttig platform bieden voor screening van geneesmiddelen en verder onderzoek naar ischemische hartziekten.

Model van ischemische hartziekten en video-gebaseerde vergelijking van Cardiomyocyte Contractie met behulp van hiPSC-afgeleide Cardiomyocyten

Hier beschrijven we een eenvoudig te gebruiken methodologie om 3D zelfgeassembleerde cardiale microtissue-arrays te genereren die zijn samengesteld uit vooraf gedifferentieerde door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen. Deze gebruiksvriendelijke en laagcellige techniek die nodig is om cardiale microtissues te genereren, kan worden geïmplementeerd voor ziektemodellering en vroege stadia van medicijnontwikkeling.

Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen

We beschrijven hier de oprichting en toepassing van een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aangeduid als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) muisreporterlijn voor cardiale herprogrammeringsbeoordeling. Neonatale cardiale fibroblasten (NPF's) geïsoleerd uit de muizenstam worden omgezet in geïnduceerde cardiomyocyten (iCM's), waardoor een gemakkelijke en efficiënte evaluatie van de herprogrammeringsefficiëntie en functionele rijping van iCM's via calcium (Ca2 +) flux...

In vitro beoordeling van cardiale herprogrammering door het meten van cardiale specifieke calciumflux met een GCaMP3 Reporter

De analyse van veranderingen in contractiele functie en cellulaire integriteit van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten is van immens belang voor de ontwikkeling van niet-klinische geneesmiddelen. Een hybride 96-well celanalysesysteem behandelt beide parameters op een real-time en fysiologische manier voor betrouwbare, voor de mens relevante resultaten, die nodig zijn voor een veilige overgang naar klinische stadia.

Hybride celanalysesysteem om structurele en contractiele veranderingen van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten te beoordelen voor preklinische cardiale risico-evaluatie

Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) bieden een alternatief voor het gebruik van dieren voor preklinische cardiotoxiciteitsscreening. Een beperking voor de wijdverbreide toepassing van hiPSC-CMs in preklinische toxiciteitsscreening is het onrijpe, foetale fenotype van de cellen. Hier worden protocollen gepresenteerd voor robuuste en snelle rijping van hiPSC-CMs.

High-throughput cardiotoxiciteitsscreening met behulp van volwassen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenmonolagen

Hier demonstreren we een niet-invasieve contractiliteitsevaluatiemethode voor cardiale medische hulpmiddelen met behulp van 2D-door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM) monolagen, verguld op een flexibel substraat, gekoppeld aan videogebaseerde microscopie. Deze tool zal nuttig zijn voor de in vitro evaluatie van de contractiele eigenschappen van cardiale elektrofysiologische apparaten.

Evaluatie van cardiale contractiliteitsmodulatietherapie in 2D-van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Leer de extractie en beoordeling van cardiale functie met gevilde cardiomyocyten. Deze methode analyseert myofilamentfunctie en calciumgevoeligheid uit kleine biopten voor cardiovasculair onderzoek.

In Vitro Beoordeling van cardiale functie met behulp van gevilde cardiomyocyten

Meer video's verkennen