Name: Bereiding van mitochondriën van ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels voor kwantitatieve Proteomics analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Leer hoe u mitochondriën isoleert uit eierstokkankerweefsel en controles voor kwantitatieve proteomics. Deze methode combineert differentiële centrifugatie met dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor hoogwaardige monsters.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door het Hunan Provincial Hundred talent plan (to X.Z.), de Xiangya Hospital funds for talent Introduction (to XZ), de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81572278 en 81272798 tot XZ), de subsidies uit China "863" plan Project (Grant No. 2014AA020610-1 tot en met XZ), en de Hunan Provincial Natural Science Foundation van China (Grant No. 14JJ7008 tot XZ). X.Z. bedacht het concept voor het huidige manuscript, verkreeg de itraq kwantitatieve proteomica gegevens van mitochondriën samples, schreef en reviseerde het manuscript, coördineerde het relevante werk en was verantwoordelijk voor de financiële steun en de bijbehorende Werk. H.L. bereide mitochondriën monsters. S.Q. deelgenomen aan gedeeltelijk werk. X. H. Z nam deel aan schriftelijke en bewerkte Engelse taal. N.L. analyseerden de itraq proteomica-gegevens. Alle auteurs keurden het eind manuscript goed.

Voor dit protocol werden eierstokweefsel monsters met inbegrip van eierstokkanker weefsels (n = 7) en normale controle ovariële weefsels (n = 11) gebruikt. Het huidige protocol3,4,5 is goedgekeurd door het xiangya ziekenhuis medisch ethisch comité van Central South University, China.
1. bereiding van mitochondriën van menselijke ovariële kanker weefsels
<ol><li>Bereid 250 mL van de mitochondriale isolatie buffer door het mengen van 210 mM mannitol, 70 mM sucrose, 100 mM kaliumchloride (KCl), 50 mM tris-HCl, 1 mM diamine tetraazijnzuur (EDTA), 0,1 mM ethyleenglycol bis (2-aminoethyl ether) tetraazijnzuur (EGTA), 1 mM fenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) proteaseremmer, 2 mM natrium orthovanadaat (V) en 0,2% boviene serumalbumine (BSA), pH 7,4.</li>
	<li>Plaats ~ 1,5 g ovariële kanker weefsels in een schone glazen schaal.</li>
	<li>Voeg 2 mL van de voorgekoelde mitochondriale isolatie buffer toe om het bloed licht uit het weefseloppervlak 3x te wassen.</li>
	<li>Gebruik een schone oftalmische schaar om het weefsel volledig in ongeveer 1 mm3 stuks te maken en breng de fijngehakte weefsels over in een centrifugebuis van 50 ml.</li>
	<li>Voeg 13,5 mL mitochondriale isolatie buffer met 0,2 mg/mL nagarse toe en gebruik vervolgens een elektrische homogenisator om te homogeniseren (gebruik schaal 2, 10 s 6x, interval 10 s) de fijngehakte weefsels (2 min, 4 °C).</li>
	<li>Voeg nog eens 3 mL mitochondriale isolatie buffer in het weefsel homogeniteert en meng ze goed door pipetteren.</li>
	<li>Centrifugeer het bereide weefsel homogenaat (1.300 x g, 10 min, 4 °c). Verwijder de ruwe nucleaire fractie (d.w.z. de pellet) en houd het supernatant.</li>
	<li>Recentrifuge het supernatant (10.000 x g, 10 min, 4 °c). Verwijder de microsomen (d.w.z. de supernatant) en houd de pellet.</li>
	<li>Voeg 2 mL mitochondriale isolatie buffer toe en breng de pellet goed door met lichte Pipetteer.</li>
	<li>Centrifugeer de pellet suspensie (7.000 x g, 10 min, 4 °c). Gooi het supernatant weg en houd de ruwe mitochondriën (d.w.z. de pellet).</li>
	<li>Voeg 12 mL 25% dichtheidsgradiënt medium (d.w.z. Nycodenz) toe om de geëxtraheerde ruwe mitochondriën te hervatten.</li>
	<li>Maak een discontinue dichtheidsgradiënt door een buisje van onder naar boven te vullen met 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (met de ruwe mitochondriën uit stap 1,11), 8 mL 23% en 3 mL 20% dichtheidsgradiënt medium, en Centrifugeer het (52.000 x g, 90 min, 4 °c).</li>
	<li>Gebruik een lange en stompe spuit om de gezuiverde mitochondriën op de interface tussen het 25% en 30% dichtheidsgradiënt medium in een schone buis te verzamelen.</li>
	<li>Voeg mitochondriale isolatie buffer in de verzamelde mitochondriën te verdunnen naar een drie-voudige volume. Centrifugeer (15.000 x g, 20 min, 4 °c) en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Voeg 2 mL mitochondriale isolatie buffer toe om de pellet te hervatten en centrifugeer (15.000 x g, 20 min, 4 °c). Gooi het supernatant weg en houd de pellet.</li>
	<li>Verzamel de laatste pellet (d.w.z. de gezuiverde mitochondriën) en bewaar deze bij-20 °C. Opmerking: Combineer alle gezuiverde mitochondriën van het ovariële kanker weefsel als de mitochondriën monster voor kwantitatieve proteomica analyse.</li>
</ol>2. bereiding van mitochondriën van menselijke controle ovariële weefsels
<ol><li>Bereid 250 mL van de mitochondriale isolatie buffer zoals beschreven in stap 1,1.</li>
	<li>Plaats ~ 1,5 g van de normale controle ovarium weefsels in een schone glazen schaal.</li>
	<li>Voeg 2 mL pre-gekoelde mitochondriale isolatie buffer toe om het bloed licht uit het weefseloppervlak 3x te wassen.</li>
	<li>Gebruik een schone oftalmische schaar om het weefsel volledig in ongeveer 1 mm3 stuks te maken en breng de fijngehakte weefsels over in een centrifugebuis van 50 ml.</li>
	<li>Voeg toe 8 mL van 0,05% trypsine/20 mM EDTA in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de fijngehakte controle weefsels, en Digest (30 min, kamertemperatuur), die helpt om de weefsels en cellen lyse en vrijlating mitochondriën. Vervolgens Centrifugeer (200 x g, 5 min). Gooi het supernatant weg en bewaar de weefsels en cellen.</li>
	<li>Voeg 13,5 mL mitochondriale isolatie buffer met 0,2 mg/mL nagarse toe en gebruik vervolgens een elektrische homogenisator om te homogeniseren (gebruik schaal 2, 10 s 6x, interval 10 s) de fijngehakte weefsels (2 min, 4 °C).</li>
	<li>Voeg nog eens 3 mL mitochondriale isolatie buffer in het weefsel homogeniteert en meng ze goed door pipetteren.</li>
	<li>Centrifugeer het bereide weefsel homogenaat (1.300 x g, 10 min, 4 °c). Verwijder de ruwe nucleaire fractie (d.w.z. de pellet) en houd het supernatant.</li>
	<li>Recentrifuge het supernatant (10.000 x g, 10 min, 4 °c). Verwijder de microsomen (d.w.z. de supernatant) en houd de pellet.</li>
	<li>Voeg 2 mL mitochondriale isolatie buffer toe om de pellet goed te hervatten door lichte Pipetteer mogelijkheden.</li>
	<li>Centrifugeer de pellet suspensie (7.000 x g, 10 min, 4 °c). Gooi het supernatant weg en houd de ruwe mitochondriën (d.w.z. de pellet).</li>
	<li>Voeg 12 mL 25% dichtheidsgradiënt medium toe om de geëxtraheerde ruwe mitochondriën te hervatten.</li>
	<li>Maak een discontinu dichtheidsgradiënt door een buis van onder naar boven te vullen met 8 mL 38%, 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (met de ruwe mitochondriën uit stap 2,12), 8 mL 23% en 3 mL 20% dichtheidsgradiënt medium, en Centrifugeer het (52.000 x g, 90 min, 4 °c).</li>
	<li>Gebruik een lange en stompe spuit om de gezuiverde mitochondriën in het bereik van de interface tussen 25% en 30% te verzamelen tot de interface tussen 34% en 38% in een schone buis.</li>
	<li>Voeg mitochondriale isolatie buffer in de verzamelde mitochondriën te verdunnen naar een drie-voudige volume. Centrifugeer (15.000 x g, 20 min, 4 °c) en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Voeg 2 mL mitochondriale isolatie buffer toe om de pellet te hervatten en Centrifugeer het (15.000 x g, 20 min, 4 °c). Gooi het supernatant weg en houd de pellet.</li>
	<li>Verzamel de laatste pellet (d.w.z. de gezuiverde mitochondriën) en bewaar deze bij-20 °C. Opmerking: Combineer alle gezuiverde mitochondriën van het controle ovariumweefsel als de mitochondriale monsters voor kwantitatieve proteomica analyse.</li>
</ol>3. verificatie van de kwaliteit van de mitochondriale monsters van gezuiverde weefsels
<ol><li>Neem een buis van gezuiverde mitochondriale monsters (d.w.z. de pellets uit de eierstokkanker weefsels uit stap 1,16 en de controle ovariële weefsels uit stap 2,17) voor verificatie met elektronenmicroscopie (EM). Opmerking: het gedetailleerde protocol is eerder15,16beschreven.</li>
	<li>Bereid de mitochondriale EiwitExtractie buffer door het mengen van 8 M ureum, 2 M thiourea, 40 mm tris, 1 mm EDTA, 130 mm dithiotreïtol (DTT), en 4% (w:v) 3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio) -1-propanesulfonaat (chaps). Stel de pH in op 8,52.</li>
	<li>Neem een buis van gezuiverde mitochondriale monsters (d.w.z. de pellets uit de eierstokkanker weefsels in stap 1,16 en de controle ovariële weefsels in stap 2,17) en voeg mitochondriale EiwitExtractie buffer (mitochondriale monsters aan EiwitExtractie buffer, 1:5) aan respendeer de pellet. Vries de monsters in vloeibare stikstof 3x en bewaar deze bij kamertemperatuur 2 uur.</li>
	<li>Centrifugeer bij 12.000 x g, 30 min, 4 °c, verzamel het supernatant (d.w.z. het geëxtraheerde mitochondriale eiwit monster) en meet het eiwitgehalte met een bicinchonininezuur (BCA) eiwit assay kit.</li>
	<li>Bereid 50 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) voor door 9,08 g tris en 40 mL ddH2o te mengen, de pH op 8,8 aan te passen met behulp van HCl en DDH2o toe te voegen aan een eindvolume van 50 ml. Bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid 50 mL van 1 M Tris-HCl (pH 6,8) door 6,06 g tris en 40 mL ddH2o te mengen, de pH op 6,8 aan te passen met behulp van HCl en DDH2o toe te voegen aan een eindvolume van 50 ml. Bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid 100 mL van 30% acrylamide-bis-oplossing door het mengen van 29 g acrylamide, 1 g bis-acrylamide en 80 mL ddH2o en DDH2o toe te voegen aan een eindvolume van 100 ml. Bewaar het in een bruine fles bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid 1.000 mL van 10x tris-Glycine elektroforese buffer door het mengen van 29 g Glycine, 58 g Tris, 3,7 g natriumdodecylsulfaat (SDS), en 800 mL ddH2o, en vervolgens DDH2o toe te voegen aan een eindvolume van 1.000 ml.</li>
	<li>Bereid 10 ml van de laad buffer door 2 ml glycerine, 0,02 g Broom fenol Blue, 0,4 g SDS, 2 ml tris-HCl pH 6,8 en 7 ml DDH2o te mengen en vervolgens DDH2o toe te voegen aan een eindvolume van 10 ml.</li>
	<li>Bereid 10 mL van 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) voor het oplossen van gel door 4 mL ddH2O te mengen, 3,3 ml 30% acrylamide-bis oplossing, 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml 10% SDS, 0,1 ml 10% ammonium persulfaat en 0,004 ml tetramethylethyleendiamine (TEMED). Giet de SDS-PAGE het oplossen van de geloplossing in de plaat tussen de glazen platen naar het niveau van de bodem van de kam. Voeg 2 mL isopropylalcohol toe aan de bovenkant. Laat 30 minuten staan.</li>
	<li>Verwijder de isopropylalcohol en was de bovenkant met ddH2O 3x. Giet de 5% concentratie gel oplossing met 4,1 mL ddH2O, 1,0 ml 30% acylamide-bis oplossing, 0,75 ml 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 ml 10% SDS, 0,06 ml 10% ammonium persulfaat en 0,006 ml TEMED. Plaats de kam onmiddellijk in de concentratie-gel-oplossing, laat 30 minuten staan en haal de kam eruit.</li>
	<li>Bereid de 1x tris-Glycine elektroforese buffer door verdunt 100 mL van 10x tris-Glycine elektroforese buffer met 900 mL ddH2O en giet in de elektrofortische tank.</li>
	<li>Meng 30 μg van de mitochondriale eiwitten uit de ovariële kanker en bedien de ovariële weefsels van stap 3,4 met de laad buffer om een eindvolume van 20 μL te bereiken. Kook het mengsel gedurende 5 minuten en scheid het vervolgens met de 10% SDS-PAGE oplossing gel met een constante spanning van 100 V. Wanneer de bromfenol blauw de bodem bereikt, stop de elektroforese.</li>
	<li>Bereid 1,5 L elektroforetisch overdrachts buffer door het mengen van 150 mL 10x tris-Glycine elektroforese buffer, 1.050 mL ddH2O en 300 ml methanol.</li>
	<li>Dompel het PVDF-membraan gedurende 10 min in 100% methanol en breng gedurende ten minste 5 minuten in de elektrofortische overdrachts buffer vijf vellen filtreerpapier in 1x elecrofioretische overdrachts buffer gedurende ten minste 5 min.</li>
	<li>Haal de SDS-PAGE gel met de eiwitten eruit en week deze in de elektrofortische overdrachts buffer gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Maak een transfer cassette door een natte spons op de witte plaat te plaatsen, drie vellen NAT filterpapier, het PVDF-membraan, de SDS-PAGE gel met de eiwitten, twee vellen NAT filterpapier en de natte spons van onder naar boven. Vermijd eventuele bubbels.</li>
	<li>Plaats de transfer cassette in de elektrofortische tank, giet in de elektroforetisch overdrachts buffer en breng deze vervolgens over 2 h onder een constante 200 mA-stroom.</li>
	<li>Bereid 10x tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) voor, door 12,114 g Tris, 29,22 g NaCl te mengen en ddH2O toe te voegen aan een eindvolume van 500 ml. Bereid 2 L 1x TBST voor door het mengen van 200 mL 10x TBS, 2 mL tween-20 en 1.798 mL ddH2O. bereid 100 ml van de blokkerende oplossing door 100 ml TBST en 5 g BSA te mengen.</li>
	<li>Na de overdracht, neem het PVDF-membraan, was lichtjes in TBST gedurende 5 minuten, en Blokkeer het in blokkerende oplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incuberen het PVDF-membraan (4 °C 's nachts) met verschillende primaire antilichamen die specifiek zijn voor verschillende subcellulaire organellen, waaronder Lamin B (celkern; geit anti-humaan antilichaam 1:1.000 blokkerende oplossing), flotillin-1 (cytomembrane; konijn anti-mens antilichaam 1:500 blokkerende oplossing), COX4I1 (mitochondrion; konijn anti-humane 1:1000 blokkerende oplossing), GM130 (Golgi-apparaat; muis anti-humaan antilichaam 1:1000-blokkerende oplossing), katalase (Peroxisome; konijn anti-humaan antilichaam 1:1000 blokkering oplossing), en door B (lysosome; konijn anti-humaan antilichaam 1:1000 blokkerende oplossing). Lichtjes wassen in TBST voor 5 min 3x.</li>
	<li>Inbroed het PVDF-membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met de corresponderende secundaire antilichamen (konijn-anti-geit, geit-anti-konijn of geit-anti-muis). Lichtjes wassen in TBST voor 5 min 3x. Visualiseer het met electrochemiluminescentie (ECL).</li>
</ol>4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS-analyse
Opmerking: de gedetailleerde procedures voor sectie 4 verwijzen naar de iTRAQ-instructies (tabel met materialen).
<ol><li>Voeg SDT-buffer (4% SDS, 100 mM tris-HCl pH 7,6 en 100 mM DTT) toe aan de gezuiverde mitochondriale monsters (d.w.z. de pellets uit de eierstokkanker weefsels uit stap 1,16 en de controle ovariële weefsels uit stap 2,17). Vortex het monster totdat er geen zichtbaar precipitaat is. Opmerking: het mitochondriale monster tot SDT-buffer verhouding moet 1:5 zijn.</li>
	<li>Kook het SDT-behandelde monster gedurende 5 minuten, koel het monster af op ijs en centrifugeer vervolgens (2.000 x g, 2 min).</li>
	<li>Verzamel de supernatant als de geëxtraheerde mitochondriale eiwit monsters en meet het eiwitgehalte met een BCA eiwit assay kit.</li>
	<li>Neem SDT-geëxtraheerde mitochondriale eiwitten (200 μg van elk monster) voor reductie, alkylatie, spijsvertering met trypsine, ontzilting en lyofilisatie3,4. Voer drie replicaties uit voor elk voorbeeld.</li>
	<li>Behandel de tryptische peptiden (100 μg van elk monster) uit stap 4,4 met 100 mm tetraethylammoniumbromide oplossing (pH 8,5) en label de tryptische peptiden met een van de 6-Plex itraq-reagentia volgens de instructies3,4. Label elk voorbeeld 3x.</li>
	<li>Meng even 6 gelabelde tryptische peptide monsters (drie van eierstokkanker weefsels en drie van de controle ovariële weefsels) en droog met een vacuümconcentrator.</li>
	<li>Fractioneren de gemengde iTRAQ-gelabelde peptiden met SCX-chromatografie in 60 fracties (één fractie per 1 min), dan combineren elke twee fracties als een SCX-fractioneerd monster (n = 30).</li>
	<li>Onderwerp elke SCx-fractionated monster aan LC-MS/MS analyse op een massaspectrometer3,4 in combinatie met een nano LC-systeem binnen een 60-min LC scheiding gradiënt om MS/MS-gegevens te verkrijgen.</li>
	<li>Doorzoek de MS/MS-gegevens om eiwitten te identificeren met de zoekmachine (tabel met materialen).</li>
	<li>Gebruik de iTRAQ reporter-Ion-intensiteiten om elk eiwit te kwantificeren en bepaal mitochondriale differentiaal uitgedrukte eiwitten (mtDEPs) met een verandering van > 1.5 of <-1,5 fold, en p < 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Availability+of+healthcare+resources+and+epithelial+ovarian+cancer+stage+of+diagnosis+and+mortality+among+Blacks+and+Whites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites.</a> Journal of Ovarian Research. 10, 57(2017).</li>
<li>Gadducci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+procedures+for+patients+treated+for+epithelial+ovarian+cancer%3A+a+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Gynecological+Cancer%22%5BJournal%5D)">Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature.</a> International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).</li>
<li>Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+mitochondrial+proteome+in+human+ovarian+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas.</a> Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).</li>
<li>Li, N., Zhan, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lncRNA+SNHG3+regulates+energy+metabolism+of+ovarian+cancer+by+an+analysis+of+mitochondrial+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes.</a> Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).</li>
<li>Li, N., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathway+network+alterations+in+human+ovarian+cancers+identified+with+quantitative+mitochondrial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22EPMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics.</a> EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).</li>
<li>Deng, P., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+cancer%3A+Potential+roles+of+ATF5+and+the+mitochondrial+UPR%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR.</a> Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).</li>
<li>Georgieva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+redox+imbalance+as+a+diagnostic+marker+of+%22free+radical+diseases%22%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases".</a> Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).</li>
<li>Sotgia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mitochondrial+based+oncology+platform+for+targeting+cancer+stem+cells+%28CSCs%29%3A+MITO-ONC-RX%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX.</a> Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individualized+metabolic+profiling+stratifies+pancreatic+and+biliary+tract+cancer%3A+a+useful+tool+for+innovative+screening+programs+and+predictive+strategies+in+healthcare%5BTitle%5D)+AND+%22EPMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare.</a> EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).</li>
<li>Zhan, X., Long, Y., Lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+variations+in+proteome+and+metabolome+for+predictive+diagnostics+and+personalized+treatment+algorithms%3A+Innovative+approach+and+examples+for+potential+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application.</a> Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).</li>
<li>Lu, M., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crucial+role+of+multiomic+approach+in+cancer+research+and+clinically+relevant+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22EPMA+Journal%22%5BJournal%5D)">The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes.</a> EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).</li>
<li>Hu, R., Wang, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parameter+systematic+strategies+for+predictive%2C+preventive+and+personalised+medicine+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EPMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer.</a> EPMA Journal. 4, 2(2013).</li>
<li>Cheng, T., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+for+predictive%2C+preventive%2C+and+personalized+medicine+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EPMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer.</a> EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).</li>
<li>Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentially+mitochondrial+proteomic+dataset+in+human+ovarian+cancer+relative+to+control+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues.</a> Data in Brief. 20, 459-462 (2018).</li>
<li>McMillan, J. D., Eisenback, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+for+analysis+of+mitochondria+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle.</a> Bio-protocol. 8, e2455(2018).</li>
<li>Paul, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+TRAF6+inhibits+skeletal+muscle+wasting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).</li>
<li>Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-+and+antioxidant+functions+of+the+peroxisome-mitochondria+connection+and+its+impact+on+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841(2017).</li>
<li>Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome-mitochondria+interplay+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Peroxisome-mitochondria interplay and disease.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).</li>
<li>Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+structure+and+dynamics+by+the+cytoskeleton+and+mechanical+factors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812(2017).</li>
<li>Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+characterization+of+mitochondrial+proteome+from+human+T+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).</li>
<li>Zhan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?</a> Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).</li>
<li>Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revival+of+2DE-LC%2FMS+in+proteomics+and+its+potential+for+large-scale+study+of+human+proteoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Med+One%22%5BJournal%5D)">Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms.</a> Med One. 3, e180008(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Mitochondriale veranderingen zijn een kenmerk van ovariële kanker. Voorbereiding van hoogwaardige mitochondriale monsters van menselijke ovariële kanker en controle weefsels voor grootschalige kwantitatieve proteomica profiteren van de diepgaande kennis van de mitochondriale functie in ovariële kanker pathogenese en mitochondriale moleculaire netwerkveranderingen, en helpen verduidelijken het moleculaire mechanisme voor latere ontdekking van de doelgroep therapie en effectieve biomarkers op basis van mitochondriën<sup cl...

Ovariële kanker is een veel voorkomende gynaecologische kanker met hoge sterfte maar onduidelijk moleculair mechanisme1,2. De meeste van ovariële kankers worden gediagnosticeerd in de gevorderde fase, die ernstig belemmert therapie. Mitochondriale veranderingen zijn een kenmerk van menselijke ovariële kankers, en mitochondriën zijn de centra van energiemetabolisme, cel signalering, en oxidatieve stress3,4,5,6,7. Diepgaand inzicht in de veranderingen van het mitochondriale Proteoom in ovariële kankers in vergelijking met controle ovariumweefsel zal profiteren van diepgaand begrip van de moleculaire mechanismen van eierstokkanker, en de ontdekking van effectieve en betrouwbare biomarkers en therapeutische doelen. Mitochondriale metabolisme is voorgesteld en erkend als een doelwit voor kankertherapie, en antimitochondrial therapie zou uiteindelijk zeer gunstig zijn voor het voorkomen van de herhaling en metastase van kanker8. Individuele metabole profilering wordt ook al beoefend als een nuttig instrument voor kanker stratificatie en voorspellende strategieën9,10.
Het langetermijndoel van dit onderzoek is het ontwikkelen en gebruiken van een kwantitatieve mitochondriale proteomica-methode om ovariële kanker te bestuderen voor verduidelijking van mitochondriale Proteoom veranderingen tussen eierstokkanker en controle van ovariële weefsels, en hun moleculaire netwerk wijzigingen van een systematische multi-omics hoek11,12, die zal resulteren in de ontdekking van mitochondriën gerichte moleculaire biomarkers13 voor verduidelijking van de moleculaire mechanismen van eierstokkanker, voorspelling en gepersonaliseerde behandeling van ovariële kankerpatiënten. Isobaric-Tags voor relatieve en absolute kwantificering (itraq)-labeling3,4 zijn een effectieve methode om de mitochondriale eiwit veranderingen te kwantificeren. Voorbereiding van hoogwaardige mitochondriale monsters van menselijke ovariële kanker en controle ovariële weefsels zijn de voorwaarde voor iTRAQ kwantitatieve analyse van mitochondriale proteomes3. Mitochondriale voorbereiding in combinatie met itraq kwantitatieve proteomica is met succes gebruikt in langetermijnonderzoek Programma's over de menselijke ovariële kanker mitochondriale Proteoom, met inbegrip van de oprichting van mitochondriale Proteoom referentiekaarten3, de analyse van differentiaal uitgedrukt mitochondriale profielen4,14 en post-translationele modificaties, met inbegrip van fosforylering, die al heeft geresulteerd in de ontdekking van belangrijke signalering traject netwerkveranderingen in menselijke ovariumkanker5, met inbegrip van veranderingen in het energiemetabolisme4, lipide metabolisme, en mitophagy pathway-systemen3.
Eerdere studies hebben geconstateerd dat het differentieel toerental centrifugeren in combinatie met dichtheidsgradiënt centrifugeren een effectieve methode is om mitochondriën te isoleren en te zuiveren van menselijke ovariële kanker en controle van ovariële weefsels3,4,5,14. De iTRAQ labeling in combinatie met sterke kation Exchange (SCX)-vloeistofchromatografie (LC)-tandem massaspectrometrie (MS/MS) is de belangrijkste techniek om te detecteren, identificeren en kwantificeren van de eiwitten uit de voorbereide mitochondriale monsters.
Hier worden gedetailleerde protocollen voor mitochondriale voorbereiding in combinatie met iTRAQ kwantitatieve proteomica beschreven. Deze zijn met succes gebruikt in de analyse van menselijke ovariële kanker weefsel mitochondriale proteomes. De protocollen omvatten de bereiding van monsters, differentiële-snelheid centrifugeren, dichtheidsgradiënt centrifugeren, kwaliteitsbeoordeling van mitochondriale monsters, eiwit vertering met trypsine, iTRAQ-labeling, SCX-fractionering, LC, MS/MS, database zoeken en kwantitatieve analyse van mitochondriale eiwitten. Bovendien vertaalt dit Protocol zich gemakkelijk om andere menselijke weefsel mitochondriale proteomes te analyseren.

<table><tbody><tr><td>BCA-eiwitanalysekit</td><td>Vazyme</td><td>E112</td><td>BCA-eiwitanalysekit is een speciale 3-componentversie van onze populaire BCA-reagentia, geoptimaliseerd om de totale eiwitconcentratie van verdunde eiwitoplossingen (0,5 tot 20 microgram/ml) te meten (A562nm).</td></tr><tr><td>Rund serum albumine (BSA)</td><td>Solarbio</td><td>A8020-5G</td><td>Heat shock fractie, Australische oorsprong, proteasevrij, laag vetzuur, laag IgG, pH 7, &ge;98%</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>XiangYi</td><td>TDZ4--WS</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C9426-5G</td><td>BioReagent, geschikt voor elektroforese, &ge;98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)</td></tr><tr><td>Diaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>798681-100G</td><td>Watervrij, vrij vloeibaar, Redi-Dri, &ge;98%</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>1,4-Dithiothreitol</td></tr><tr><td>Easy nLC</td><td>Proxeon Biosystems (nu Thermo Fisher Scientific)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyleenglycol bis(2-aminoethylether)tetraazijnzuur (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E0396-10G</td><td>BioXtra, &ge;97 .0%</td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>SilentShake</td><td>HYQ-3110</td><td></td></tr><tr><td>iTRAQ-reagenskit</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Applied Biosystems iTRAQ Reagents&ndash;Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A</td></tr><tr><td>Laagtemperatuur supersnelheidscentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Macklin</td><td>M813424-100G</td><td>Mannitol is een polyol (polyhydrisch alcohol) geproduceerd uit waterstof uit fructose dat functioneert als zoetstof, bevochtiger en bulking agent. Het heeft lage hygroscopiciteit en slechte olieoplosbaarheid.</td></tr><tr><td>MASCOT-zoekmachine</td><td>Matrix Science, Londen, VK; versie 2.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nagarse</td><td>Solarbio</td><td>P9090</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (SDT)</td><td>Sigma</td><td>56480-25G</td><td>Purum, &ge;97.0% (T)</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Alere/Axis-Shield</td><td>1002424-1</td><td></td></tr><tr><td>Fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF) proteaseremmer</td><td>Solarbio</td><td>P0100-1ML</td><td>PMSF is een proteaseremmer die reageert met serineresiduen om trypsine, chymotrypsine, trombine en papaine te remmen.</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Macklin</td><td>P816354-25G</td><td>Kaliumchloride, KCl, ook bekend als kaliummuriaat en sylviet, is een kleurloos kristallijn vast lichaam met een zoute smaak dat smelt bij 776&deg;C (1420 OF). Het is oplosbaar in water, maar onoplosbaar in alcohol. Kaliumchloride wordt gebruikt in meststoffen, geneesmiddelen, fotografie en als zoutvervanger.</td></tr><tr><td>Proteome Discover 1.4</td><td>Matrix Science, Londen, VK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF-membraan</td><td>Millipore</td><td>05317</td><td>Het is 1 rol, 26,5 cm x 1,875 m, 0,45 &micro;m poriëngrootte, hydrofobe PVDF-overdrachtsmembraan met lage achtergrondfluorescentie voor western blotting. Het is compatibel met zichtbare en infrarode fluorescentie sondes.</td></tr><tr><td>Q Exactive massaspectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCX-kolom</td><td>Sigma</td><td>58997</td><td>Het is 5-&mu;m deeltjesgrootte, lengte 5 cm &times; i.d. 4,6 mm (Supelco).</td></tr><tr><td>Natriumorthovanadate (V)</td><td>Macklin</td><td>S817660-25G</td><td>Natriumorthovanadate (vanadate) is een algemene competitieve remmer voor eiwitfosfotyrosylfosfatasen. De remming door natriumorthovanadate is omkeerbaar bij toevoeging van EDTA of door verdunning.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Macklin</td><td>S824459-500G</td><td>Vetec reagenskwaliteit, 99%</td></tr><tr><td>Thioureum</td><td>Sigma</td><td>62-56-6</td><td>ACS reagens, &ge;99,0%</td></tr><tr><td>Tris-basis</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td>TRIS-basis is nuttig in het pH-bereik van 7,0-9,0. Het heeft een pKa van 8,1 bij 25&deg;C.</td></tr><tr><td>Trypsine (celcultuurgebruik)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Deze vloeibare formulering van trypsine bevat EDTA en fenolrood. Gibco Trypsin-EDTA is gemaakt van trypsinepoeder, een bestraald mengsel van proteasen afgeleid van varkens pancreas. Vanwege zijn spijsverteringskracht wordt trypsine veel gebruikt voor celdissociatie, routinematige celcultuurpassagering en primaire weefseldondissociatie.</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378-100G</td><td>poeder, BioReagent, voor moleculaire biologie, geschikt voor celcultuur</td></tr></tbody></table>

bereiding van mitochondriën van ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels voor kwantitatieve proteomics analyse

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Ovariële kanker is een veelvoorkomende gynaecologische kanker met een hoge sterfte maar onduidelijk moleculair mechanisme. De meeste ovariële kankers worden gediagnosticeerd in de vergevorderd stadium, die ernstig belemmert therapie. Mitochondriale veranderingen zijn een kenmerk van menselijke ovariële kankers, en mitochondriën zijn de centra van energiemetabolisme, cel signalering, en oxidatieve stress. Diepgaand inzicht in de veranderingen van het mitochondriale Proteoom in ovariële kankers in vergelijking met controle ovariumweefsel zal profiteren van diepgaand begrip van de moleculaire mechanismen van eierstokkanker, en de ontdekking van effectieve en betrouwbare biomarkers en therapeutische doelen. Een effectieve mitochondriale bereidingsmethode in combinatie met een isobarische tag voor relatieve en absolute kwantificering (itraq) kwantitatieve proteomica worden hier gepresenteerd om menselijke ovariële kanker te analyseren en mitochondriale proteomes te beheersen, inclusief differentieel toerental centrifugeren, dichtheidsgradiënt centrifugeren, kwaliteitsbeoordeling van mitochondriale monsters, eiwit vertering met trypsine, itraq-labeling, sterke kationen uitwisselings fractionering (SCx), vloeistofchromatografie (LC), tandem massaspectrometrie (MS/ MS), database-analyse en kwantitatieve analyse van mitochondriale eiwitten. Veel eiwitten zijn met succes geïdentificeerd om te maximaliseren van de dekking van de menselijke ovariële kanker mitochondriale Proteoom en het bereiken van de differentiaal uitgedrukt mitochondriale eiwit profiel in menselijke ovariële kankers.

Er was een verschil in de voorbereiding van de mitochondriën van ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels. Deze studie vond dat het veel gemakkelijker was om mitochondriën te bereiden van eierstokkanker weefsels dan van controle ovariële weefsels3,4. Enkele verbeteringen moesten worden aangebracht in het protocol voor de bereiding van mitochondriën van controle ovariële weefsels. Ten eerste moest voorafgaand aan de w...

Dit artikel presenteert een protocol van differentiële-snelheid centrifugeren in combinatie met dichtheidsgradiënt centrifugeren te scheiden mitochondriën van menselijke ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels voor kwantitatieve proteomica analyse, resulterend in een hoge kwaliteit mitochondriale monster en hoge doorvoer en hoge reproduceerbaarheid kwantitatieve proteomica analyse van een menselijke ovariële kanker mitochondriale proteome.

Bereiding van mitochondriën van ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels voor kwantitatieve Proteomics analyse

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Mitochondriale veranderingen spelen een belangrijke rol bij menselijke eierstokkanker. Dit protocol stelt een effectief platform op om mitochondriën te isoleren en te zuiveren van menselijke eierstokkanker en de controleweefsels voor grootschalige proteomics-analyse. Mitochondriën, als een centra van energiemetabolisme, celsignalering, en oxidatieve stress, inzicht in mitochondriale proteoom veranderingen in eierstokkanker ten goede komen aan ons begrip moleculair mechanisme, en is een ontdekking van effectieve biomarkers en de therapeutische doelen.Deze techniek maakt gebruik van differentiële snelheid centrifugatie in combinatie met dichtheid gradiënt centrifugatie te scheiden mitochondriën van menselijke eierstokkanker in de controle weefsels, wat resulteert in hoge kwaliteit mitochondriën monsters voor kwantitatieve proteomics analyse. De mitochondriën preparaat, in combinatie met iTRAQ kwantitatieve proteomics, zijn met succes gebruikt bij de analyse van menselijke eierstokkanker weefsel, die gemakkelijk vertaalt naar andere weefsel te analyseren, mitochondriën proteomics. Degenen die nog nooit hebben uitgevoerd deze methode kan vinden dat het moeilijk kan zijn om mitochondriën te isoleren van de eierstokcontrole dan kankerweefsels.Het is noodzakelijk om een trypsine toe te voegen om de controle weefsel homogenisatie te verbeteren en voeg een extra laag van dichtheid gradiënt medium om mitochondriën scheiding te verbeteren. Om deze procedure te beginnen, bereid 250 milliliter van de mitochondriale isolatiebuffer zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats ongeveer 1,5 gram eierstokkanker weefsels in een schone glazen schotel.Voeg twee milliliter voorgekoelde mitochondriale isolatiebuffer toe om het bloed van het weefseloppervlak licht te wassen. Herhaal deze was drie keer. Gebruik vervolgens een schone oogheelkundige schaar om het weefsel volledig te gehakt in stukken die ongeveer een kubieke millimeter zijn, en breng de gehakte weefsels over in een 50 milliliter centrifugebuis.Voeg 13,5 milliliter mitochondriale isolatiebuffer toe met nagarse bij een concentratie van 0,2 milligram per milliliter. Gebruik een elektronische homogenisator om de gehakte weefsels twee minuten te homogeniseren bij vier graden Celsius. Voeg hierna nog eens drie milliliter mitochondriale isolatiebuffer toe aan de weefselhomogenates en meng ze goed door pipetteren.Centrifugeer het bereide weefsel homogenaat op 1, 300 xg, en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder de pellet en houd de supernatant. Vervolgens centrifuge de supernatant op 10,000 xg en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Verwijder de microsome-bevattende supernatant, en houd de pellet. Voeg 2 milliliter mitochondriale isolatiebuffer toe en hang de pellet grondig op door lichtpipetting. Centrifuge deze pellet suspensie op 7,000 xg en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Gooi de supernatant, en houd de pellet, die de ruwe mitochondriën bevat. Voeg 12 milliliter van 25% dichtheidgradiënt medium toe om de geëxtraheerde ruwe mitochondriën opnieuw op te schorten. Maak een discontinu dichtheidsgradiënt met de opnieuw opgehangen ruwe mitochondriën zoals beschreven in het tekstprotocol, en versteen het op 52,000 xg en bij vier graden Celsius gedurende 90 minuten.Gebruik een lange en stompe spuit om de gezuiverde mitochondriën te verzamelen op de interface tussen de 25% en 30% gradiënt mediums, en breng dit naar een schone buis. Voeg mitochondriale isolatiebuffer toe aan de verzamelde mitochondriën om het te verdunnen tot een drievoudig volume. Centrifuge op 15,000 xg, en op vier graden Celsius gedurende 20 minuten.Gooi de supernatant weg en houd de pellet. Verzamel de laatste pellet die de gezuiverde mitochondriën bevat, en bewaar het op 20 graden Celsius. Bereid eerst 250 milliliter van de mitochondriale isolatiebuffer voor, zoals beschreven in het tekstprotocol.Voeg ongeveer 1,5 gram van de normale controle eierstokweefsels toe aan een schone glazen schaal. Voeg twee milliliter voorgekoelde mitochondriale isolatiebuffer toe om het bloed van het weefseloppervlak licht te wassen. Herhaal deze was drie keer.Met behulp van schone oogheelkundige schaar, volledig gehakt het weefsel in stukken die ongeveer 1 kubieke millimeter, en breng de gehakte weefsels in een schone 50 milliliter buis. Voeg acht milliliter van een oplossing met 0,05% trypsine en 20 millimolar EDTA en PBS toe aan de gehakte controleweefsels en vert verteer 30 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te helpen lyse en laat de mitochondriën los. Centrifuge op 200 xg gedurende vijf minuten.Gooi de supernatant, en houd de weefsels en cellen. Voeg 13,5 milliliter mitochondriale isolatiebuffer toe met nagarse bij een concentratie van 0,2 milligram per milliliter en gebruik een elektrische homogenisator om de gehakte weefsels twee minuten lang te homogeniseren bij vier graden Celsius. Voeg nog eens drie milliliter mitochondriale isolatiebuffer toe aan de weefselhomogenates en meng grondig door pipetting.Centrifugeer het bereide weefsel homogenaat op 1, 300 xg en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder de pellet en houd de supernatant. Centrifuge de supernatant op 10,000 xg en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Verwijder de supernatant, die de microsomen bevat, en houd de pellet. Voeg vervolgens 2 milliliter mitochondriale isolatiebuffer toe en hang de pellet opnieuw grondig op door lichtpipetting. Centrifuge deze pellet suspensie op 7,000 xg en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Gooi de supernatant en houd de pellet die de ruwe mitochondriën bevat. Voeg 12 milliliter van 25% dichtheidgradiënt medium toe om de geëxtraheerde ruwe mitochondriën opnieuw op te schorten. Maak een discontinu dichtheidsgradiënt met de ruwe mitochondriën zoals beschreven in het tekstprotocol en verstek het op 52,000 xg en bij vier graden Celsius gedurende 90 minuten.Gebruik een lange en stompe spuit om de gezuiverde mitochondriën te verzamelen in het bereik van de interface tussen de 25 en 30% gradiënt mediums tot de interface tussen de 34 en 38% gradiënt mediums. Breng de gezuiverde mitochondriën over op een schone buis. Voeg mitochondriale isolatiebuffer toe aan de verzamelde mitochondriën om het te verdunnen tot een drievoudig volume.Centrifuge op 15,000 xg en op vier graden Celsius gedurende 20 minuten, en gooi de supernatant. Voeg 2 milliliter mitochondriale isolatiebuffer toe om de pellet opnieuw op te schorten en te centrifugeren bij 15, 000 xg en gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en houd de pellet.Verzamel de laatste pellet en bewaar het op 20 graden Celsius. In deze studie worden hoogwaardige mitochondriale monsters bereid van menselijke eierstokkanker en controleweefsels voor grootschalige kwantitatieve proteomics. Er zijn een paar verschillen in de voorbereiding van de mitochondriën van eierstokkanker weefsels en controle eierstokweefsels, met inbegrip van het gebruik van een andere discontinu dichtheid gradiënt.Na centrifugatie, de gezuiverde mitochondriën uit eierstokkanker weefsels worden gevonden op de interface tussen 25%en 30%, terwijl die van controle eierstokweefsels worden gevonden in het bereik van de interface tussen 25%en 30%- tot de interface tussen 34%en 38%De kwaliteit van de voorbereide mitochondria wordt vervolgens geëvalueerd met differentiële snelheid centrifugatie en dichtheidsverloop via elektronenscopie. De elektronenmicroscoop beelden tonen aan dat in zowel eierstokkanker en controle eierstokweefsels, de belangrijkste organellen geïsoleerd zijn mitochondriën, met uitzondering van een kleine hoeveelheid peroxisomen. Echter, de morfologie van de mitochondriën wordt gezien om meer te veranderen in eierstokkanker dan controle eierstokweefsel.De kwaliteit van de bereide mitochondriën wordt ook geëvalueerd via western vlek. De westelijke vlek beelden tonen ook aan dat de belangrijkste component in voorbereide mitochondriale monsters van eierstokkanker en controle eierstokken is mitochondriën, met uitzondering van een kleine hoeveelheid peroxisomen, die in overeenstemming is met het elektron microscopie analyse. Het is redelijk dat peroxisomen in de voorbereide mitochondriën worden opgenomen, omdat mitochondriën op grote schaal interageren met peroxisomen, wat op zijn beurt de functionele volledigheid van de mitochondriën weerspiegelt.Deze resultaten tonen de hoge kwaliteit van de bereide mitochondriale monsters aan. Als ik deze procedure uitvoer, is het erg belangrijk dat je weefsels volledig gehakt voor homogenisatie, en voeg de trypsine aan de gehakte controle weefsels. Het is ook belangrijk dat u maakt en of voorbereid discontinu dichtheid gradiënt voor de kanker monsters en de controles.Na deze procedure kunnen iTRAQ- of TMT-kwantitatieve proteomics of fosfoproteomics worden uitgevoerd om het eierstokkanker mitochondriën proteomeprofiel te verduidelijken en kan een fosfoprotenoomprofiel worden vastgesteld om de rol van mitochondriën bij eierstokkanker in grote diepte te verduidelijken. Deze techniek effent de weg voor onderzoekers om systematisch mitochondriën proteoom en het fosfoprotenoom bij eierstokkanker te bestuderen, het netwerksysteem van de signaleringsroute te construeren en de betrouwbare biomarkers en de therapeutische doelen te ontdekken.

preparation-mitochondria-from-ovarian-cancer-tissues-control-ovarian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video describes the procedure for isolating mitochondria from human ovarian cancer tissues using differential-speed centrifugation in combination with density gradient centrifugation. The isolated mitochondria can be used for proteomic analysis of human ovarian cancer mitochondrial proteome.

Mitochondrial Isolation: A Technique to Isolate Mitochondria from Human Ovarian Cancer Tissue Sample

This protocol describes a technique for sample preparation by co-culturing ovarian explants with the fallopian tube cancer cells. These samples are visualized using imaging mass spectroscopy, or IMS,  to detect small molecule exchange between the cells and tissues leading to tumor development.

Modeling Ovarian Cancer Communication for Imaging Mass Spectrometry Analysis: A Method to Identify Small Molecule Chemical Communicators in Metastatic Ovarian Tumor Development

Deze studie beschrijft een gedetailleerde methode voor de isolatie en karakterisering van primaire eierstokkanker cellen van vaste klinische monsters. Eierstokkanker klinische monsters worden onderworpen aan enzymatische vertering om levensvatbare, fibroblast gratis ovariumcarcinoom (EOC) cellen zeer geschikt voor verdere toepassingen te verkrijgen.

Methode voor het verkrijgen van Primary eierstokkankercellen Van Solid Exemplaren

Hier presenteren we een aanpassing van een eerder gerapporteerde methode die de isolatie van hoogwaardige en gezuiverde mitochondriën mogelijk maakt uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier. Deze procedure resulteert in sterk gekoppelde mitochondriën die ademen met hoge functionaliteit tijdens microplate-gebaseerde respirometrische analyses.

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Immunohistochemische kleuring en 16S ribosomale RNA-gen (16S rRNA-gen) sequencing werden uitgevoerd om bacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokweefsels in situ te ontdekken en te onderscheiden. De samenstellings- en functionele verschillen van de bacteriën werden voorspeld met behulp van BugBase en Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).

Karakterisering en functionele voorspelling van bacteriën in eierstokweefsels

We ontwikkelden een praktisch protocol en een analytische benadering om mitochondriale oxidatieve fosforylering en elektronenoverdrachtscapaciteit in verse tumorhomogenaten te evalueren. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om verschillende mitochondriale functies te onderzoeken die bijdragen aan het initiëren, progressie en behandelingsrespons van kanker.

Analytische bepaling van mitochondriale functie van weggesneden vaste tumorhomogenaten

We presenteren een tweestappenprotocol voor hoogwaardige mitochondrische isolatie dat compatibel is met eiwitontdekking en kwantificering op proteoomschaal. Ons protocol vereist geen genetische manipulatie en is dus geschikt voor het bestuderen van mitochondriën uit primaire cellen en weefsels.

Tweestaps tagvrije isolatie van mitochondriën voor verbeterde eiwitontdekking en kwantificering

Dit protocol beschrijft de opstelling van een driedimensionaal (3D) ex vivo model van de interactie tussen kankercellen en omtentum. Het model biedt een platform voor het ophelderen van pro-tumormechanismen binnen de vetniche en voor het testen van nieuwe therapieën.

Een ex vivo-model van peritoneale metastase van eierstokkanker met behulp van humaan omentum

Dit protocol beschrijft een techniek voor de analyse van respiratoire supercomplexen wanneer slechts kleine hoeveelheden monsters beschikbaar zijn.

Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters 

Dit protocol bereidde met succes voldoende hoogwaardig neovasculair weefsel van gliomamonsters met behulp van laser-capture microdissectie voor kwantitatieve proteomics-analyse van tumorangiogenese, waarmee de beperkingen van studies die traditioneel vooral op angiogene factoren gericht zijn overwonnen en een grootschalig proteomica-profiel van glioma-angiogenese werden geleverd.

Voorbereiding van neovasculaire weefsels uit humane gliomaweefsels voor kwantitatieve proteomanalyse van tumorangiogenese

Leer hoe u mitochondriën isoleert uit eierstokkankerweefsel en controles voor kwantitatieve proteomics. Deze methode combineert differentiële centrifugatie met dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor hoogwaardige monsters.

Bereiding van mitochondriën van ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels voor kwantitatieve Proteomics analyse

Meer video's verkennen