Name: Isolatie en cultuur van Oculomotor, Trochlear en spinale motor neuronen van prenatale ISLMN: GFP transgene muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Leer de isolatie en cultuur van oculomotor-, trochlear- en spinale motorneuronen uit embryonale muizen. Deze methode maakt vergelijkend onderzoek naar selectieve kwetsbaarheid in motorneuronziekten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, VS) voor instructie in SMN dissectie technieken; het Dana Farber Cancer Institute flow Cytometrie faciliteit, de immunologie divisie flow Cytometry faciliteit van Harvard Medical School, de Joslin Diabetes Center flow Cytometrie kern, Brigham en Women's Hospital flow Cytometrie kern, en Boston Children's Hospital flow Cytometrie onderzoek faciliteit voor FACS isolatie van primaire motorneuronen; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, extra Engle laboratorium leden en project ALS consortium leden voor technische assistentie en doordachte discussie. Deze studie werd ondersteund door project ALS. Daarnaast werd R.F. gefinancierd door de Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant in het buitenland en NIH training Grant in genetica T32 GM007748; J.J. werd gesteund door het NIH/NEI trainingsprogramma in de moleculaire basissen van oogziekten (5T32EY007145-16) via het Schepens Eye Research Institute en door het ontwikkelingsneurologie trainingsprogramma Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) via het Boston Children's Hospital; M. C. W werd gesteund door NEI (5K08EY027850) en Children's Hospital Ophthalmologie Foundation (Faculty Discovery Award); en E.C.E. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute.

<ol><li>Kiernan, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).</li>
<li>Wood-Allum, C., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurone+disease%3A+a+practical+update+on+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Medicine+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management.</a> Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).</li>
<li>Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+vulnerability+and+resistance+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).</li>
<li>Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+motor+function+in+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Ocular motor function in motor neuron disease.</a> Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).</li>
<li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).</li>
<li>Nimchinsky, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+vulnerability+of+oculomotor%2C+facial%2C+and+hypoglossal+nuclei+in+G86R+superoxide+dismutase+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).</li>
<li>Angenstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+MRI+of+motor+brain+stem+nuclei+in+a+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS.</a> Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).</li>
<li>Niessen, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantification+of+spinal+and+bulbar+motor+neuron+degeneration+in+the+G93A-SOD1+transgenic+mouse+model+of+ALS+by+T2+relaxation+time+and+apparent+diffusion+coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient.</a> Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).</li>
<li>Spiller, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Motor+Neuron+Resistance+and+Recovery+in+a+New+Inducible+Mouse+Model+of+TDP-43+Proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+mouse+motoneuron-enriched+fraction+from+mouse+spinal+cord+on+a+density+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier.</a> Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).</li>
<li>Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+isolation+of+primary+motor+neurons%2C+astrocytes+and+microglia+from+embryonic+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).</li>
<li>Beaudet, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+extraction+of+pure+spinal+motor+neurons%2C+astrocytes+and+microglia+from+single+embryo+and+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord.</a> Scientific Reports. 5, 16763(2015).</li>
<li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li>
<li>Arce, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiotrophin-1+requires+LIFRbeta+to+promote+survival+of+mouse+motoneurons+purified+by+a+novel+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique.</a> Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).</li>
<li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li>
<li>Conrad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+isolation+and+culture+of+mouse+embryonic+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li>
<li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li>
<li>Ferrario, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+in+the+developing+ocular+motor+system+and+Duane+retraction+syndrome+depends+on+Semaphorin+signaling+via+alpha2-chimaerin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).</li>
<li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B12-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li>
<li>Theofilopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholestenoic+acids+regulate+motor+neuron+survival+via+liver+X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).</li>
<li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).</li>
<li>Porter, J. D., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+extraocular+muscle+in+long-term+organotypic+culture%3A+differential+influence+of+appropriate+and+inappropriate+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons.</a> Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).</li>
<li>Serafini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+is+required+for+commissural+axon+guidance+in+the+developing+vertebrate+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system.</a> Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).</li>
<li>Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axon+subpopulations+respond+differentially+to+the+chemorepellents+netrin-1+and+semaphorin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D.</a> Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).</li>
<li>Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+the+trochlear+motor+axon+trajectory%3A+role+of+the+isthmic+organiser+and+Fgf8%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8.</a> Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).</li>
<li>Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF+increases+the+survival+of+developing+oculomotor+neurons+through+a+target-derived+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).</li>
<li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CXCR4%2FCXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li>
<li>Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+Vivo+Oculomotor+Slice+Culture+from+Embryonic+GFP-Expressing+Mice+for+Time-Lapse+Imaging+of+Oculomotor+Nerve+Outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth.</a> Journal of Visualized Experiments. , In press e59911(2019).</li>
<li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56, 604-620 (2007).</li>
<li>Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+defined+and+uniform+population+of+CNS+progenitors+and+neurons+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).</li>
<li>An, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+cranial+and+spinal+motor+neurons+reveal+proteostatic+differences+between+ALS+resistant+and+sensitive+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons.</a> eLife. 8, e44423(2019).</li>
<li>Huber, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+secreted+semaphorin+signaling+in+spinal+motor+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance.</a> Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).</li>
<li>Plachta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+lectin+causing+the+degeneration+of+neuronal+processes+using+engineered+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).</li>
<li>Eide, L., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+adult+mouse+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Culture of adult mouse neurons.</a> BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+elevation+is+sufficient+to+promote+the+survival+of+spinal+motor+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).</li>
<li>Lamas, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+requirements+of+human+motor+neurons+defined+using+amplified+and+purified+stem+cell-derived+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures.</a> Plos One. 9 (10), (2014).</li>
<li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Historisch gezien, in vitro studies van CN3 en/of CN4 motorneuronen hebben vertrouwd op heterogene culturen zoals gezien17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, e...

De cultuur van primaire motorneuronen is een krachtig hulpmiddel dat de studie van neuronale ontwikkeling, functie, en gevoeligheid voor exogene stressoren mogelijk maakt. Motorische neuron culturen zijn vooral nuttig voor de studie van neurodegeneratieve ziekten zoals Amyotrofische laterale sclerose (als)1,2, waarvande ziekte mechanismen zijn niet volledig begrepen. Belangwekkend, ondanks de significante celdood van wervelkolom motorneuronen (smn's) in zowel als patiënten en als model muizen, celdood in Oculomotor neuronen (CN3s) en trochlear neuronen (CN4s) zijn relatief schaars1,3,4,5,6,7,8,9. Daarom kunnen vergelijkende analyses van zuivere culturen van CN3s/CN4s en Smn's belangrijke aanwijzingen geven over mechanismen die onderliggende relatieve kwetsbaarheid vormen. Helaas is een belangrijke barrière voor dergelijke analyses het onvermogen om gezuiverde culturen van deze motorneuronen te kweken.
Veel protocollen zijn beschreven voor de zuivering van Smn's uit diermodellen. De meeste van deze protocollen maken gebruik van dichtheidsgradiënt centrifugeren10,11,12 en/of P75NTR-antilichaam-gebaseerde cel-Sorteer pannen technieken13,14,15,16. Met dichtheidsgradiënt centrifugeren wordt de grotere grootte van Smn's ten opzichte van andere spinale cellen benut, terwijl P75NTR een extracellulair eiwit is dat uitsluitend door smn's in het ruggenmerg wordt uitgedrukt. Bijna 100% zuivere SMN-culturen zijn gegenereerd door een of beide van deze protocollen11,12,14. Deze protocollen zijn echter niet gelukt bij het genereren van CN3/CN4-culturen omdat CN3s/CN4s geen P75NTRExpress en andere specifieke CN3/CN4-markeringen niet zijn geïdentificeerd. Ze zijn ook kleiner dan de Smn's en daarom moeilijker te isoleren op basis van grootte. Integendeel, in vitro studies van CN3s of CN4s hebben zich gebaseerd op dissociatie van17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, en slice27,28 culturen, die zijn samengesteld uit heterogene celtypen, en er bestaan geen protocollen voor de isolatie en cultuur van primaire CN3s of CN4s.
Hier wordt een protocol beschreven voor de visualisatie, isolatie, zuivering en teelt van CN3s, CN4s en Smn's van dezelfde embryonale dag 11,5 (E 11.5) ISLMN: GFP transgene muizen29 (Figuur 1, Figuur 2a). ISLMN: GFP heeft specifiek betrekking op motorneuronen met een door farnesylated GFP die naar het celmembraan lokaliseert. Dit protocol maakt het mogelijk om soorten en leeftijdgebonden vergelijkingen van meerdere soorten motorische neuronen te verhelderen om pathologische mechanismen in de motorische neuron ziekte uit te leggen.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11072</td><td>1:400</td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x), serum free</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td>-</td><td>Dit heeft een 4-lasersysteem uitgerust met 405, 488, 594 en 640 nm lasers.</td></tr><tr><td>BD Falcon 70&mu;m Nylon Cell Strainers</td><td>CORNING</td><td>352350</td><td>Voor het filteren van de dissociërende cellen vóór FACS.</td></tr><tr><td>BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap</td><td>CORNING</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>BDNF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>CYT-207</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well)</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>655090</td><td>We hebben meerdere 96-well platen geprobeerd en deze was de beste voor cultuur en analyses na ICC</td></tr><tr><td>Circular Cover Glasses for microscopy</td><td>Karl Hecht &amp; Assistent</td><td>1001/14</td><td>We gebruikten dit dekglas omdat het gebied groot was (diameter: 14 mm).</td></tr><tr><td>CNTF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>CYT-272</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1530</td><td>CPA. Een van de ER-stressoren.</td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP25205</td><td></td></tr><tr><td>GDNF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>CYT-305</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&rsquo; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E</td><td>BrainBits</td><td>HE</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E low fluorescence</td><td>BrainBits</td><td>HELF</td><td>Fluorescentie die de waarneming van de GFP-expressies van embryo's belemmert, moet laag zijn.</td></tr><tr><td>Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Tocris Cookson</td><td>2845</td><td>Isobutylmethylxanthine</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&rsquo;s L15 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5913</td><td></td></tr><tr><td>Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-6272</td><td></td></tr><tr><td>Moria Mini Perforated Spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-19</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal antibody to neuronal class III &beta;-tubulin (TUBB3)</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>1:500, TUJ1</td></tr><tr><td>Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software</td><td>Nikon</td><td>-</td><td>Differentiaal interferentie contrast beelden en immunocytochemie beelden van de celculturen werden vastgelegd met deze apparatuur</td></tr><tr><td>Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A202-212</td><td>Voor het spoelen van deksels</td></tr><tr><td>Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td>Dit zijn de buisjes die we beschreven als "1.7 mL microcentrifugebuisjes" in de context.</td></tr><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LK003150</td><td>Papaine oplossing en alubumin-ovomucoid inhibitor oplossing worden bereid uit dit kit.</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Poly D-lysin (PDL)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit monoclonal antibody to Islet1</td><td>Abcam</td><td>ab109517</td><td>1:200</td></tr><tr><td>SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera</td><td>Nikon</td><td>-</td><td>Dissectie werd uitgevoerd en beelden van gedissecteerde embryo's en weefsels worden vastgelegd onder deze fluorescentie microscopen.</td></tr><tr><td>Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit</td><td>Dow Corning</td><td>1696157</td><td>We maken dissectie schotels met behulp van dit kit.</td></tr><tr><td>TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td>We maken dissectie schotels met behulp van dit schaal.</td></tr><tr><td>Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>Transducer for LOGOQ e VET</td><td>GE Healthcare</td><td>L8-18i-RS</td><td>Voor echografie bij vrouwelijke muizen</td></tr><tr><td>Veterinary ultrasound machine</td><td>GE Healthcare</td><td>LOGOQ e VET</td><td>Voor echografie bij vrouwelijke muizen</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software</td><td>Carl Zeiss</td><td>-</td><td>Confocal beeld van het embryo werd vastgelegd met deze apparatuur</td></tr></tbody></table>

isolatie en cultuur van oculomotor, trochlear en spinale motor neuronen van prenatale islmn: gfp transgene muizen

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neuronen (CN3s) en trochlear neuronen (CN4s) vertonen opmerkelijke weerstand tegen degeneratieve motorische neuron ziekten zoals Amyotrofische laterale sclerose (ALS) in vergelijking met spinale motorneuronen (Smn's). De mogelijkheid om de primaire muis CN3s, CN4s en Smn's te isoleren en te cultuur zou een aanpak bieden voor het bestuderen van mechanismen die aan deze selectieve kwetsbaarheid ten grondslag liggen. Tot op heden maken de meeste protocollen gebruik van heterogene celculturen, wat de interpretatie van experimentele uitkomsten kan Verdoe- Om de problemen in verband met gemengde celpopulaties te minimaliseren, zijn zuivere culturen onmisbaar. Hier beschrijft het eerste protocol gedetailleerd hoe efficiënt CN3s/CN4s naast SMNs-tegenhangers uit dezelfde embryo's te zuiveren en te cultiveren met behulp van embryonale dag 11,5 (E 11.5) ISLMN: GFP transgene muis embryo's. Het protocol bevat details over de weefsel dissectie en dissociatie, FACS-gebaseerde celisolatie, en in vitro teelt van cellen uit CN3/CN4 en SMN kernen. Dit protocol voegt een roman in vitro CN3/CN4 cultuur systeem toe aan bestaande protocollen en biedt tegelijkertijd een zuivere soort en leeftijdsgebonden SMN-cultuur ter vergelijking. Analyses gericht op de morfologische, cellulaire, moleculaire en elektrofysiologische kenmerken van motorneuronen zijn haalbaar in dit cultuur systeem. Dit protocol zal onderzoek mogelijk maken naar de mechanismen die de ontwikkeling van motorische neuron, selectieve kwetsbaarheid en ziekte bepalen.

Het doel van dit protocol was om zowel de primaire CN3s/CN4s als de KMO op lange termijn te zuiveren en te kweken om vergelijkende analyses mogelijk te maken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan motorische neuron stoornissen (Zie Figuur 1 en Figuur 2 voor overzicht).
Zodra neuronen met succes werden geïsoleerd en gekweekt in cultuur, werden bijna zuivere prim...

Dit werk presenteert een protocol voor het opleveren van homogene celculturen van primaire Oculomotor, trochlear, en ruggengraat motorneuronen. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor vergelijkende analyses van de morfologische, cellulaire, moleculaire en elektrofysiologische kenmerken van oculaire en spinale motorneuronen.

Isolatie en cultuur van Oculomotor, Trochlear en spinale motor neuronen van prenatale ISLMN: GFP transgene muizen

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Dit is het eerste protocol om gelijktijdig en efficiënt te zuiveren en cultuur primaire oculaire en spinale motorneuronen van embryonale muizen. Het maakt de studie van mechanismen die ten grondslag liggen aan motorische neuron ziekte. Dit protocol voegt een nieuwe in vitro oculomotorische cultuurcomponent aan bestaande systemen toe en verstrekt zuivere soorten en leeftijdsgelijke motorische neuronculturen voor vergelijking.In amyotrofische laterale sclerose ontaarden spinale motorneuronen terwijl oculomotorische neuronen relatief gespaard blijven. Het vergelijken van deze culturen kan inzicht geven in ziektemechanisme en therapie. Deze methode zal vergemakkelijken studies van de mechanismen die ten grondslag liggen motorische neuron ontwikkeling, ziekte, en selectieve kwetsbaarheid.Ons cultuursysteem maakt karakterisering van motorneuronmorfologie, moleculaire biologie en elektrofysiologie mogelijk. Voor degenen die nieuw zijn in deze techniek, raden we veel oefening aan. Dissectie kan technisch uitdagend zijn en meerdere dissectoren kunnen nodig zijn om voldoende neuronen te verkrijgen voor de primaire cultuur.Begin met het oogsten van Islet1 EFG positieve embryo's van een zwangere muis ongeveer 11,5 dagen na de bevruchting. Spray de buik grondig met ethanol en verwijder de baarmoeder met steriele microdissection schaar en duim dressing tangen. Was de baarmoeder kort in steriele PBS.Breng het vervolgens over op de dissectieplaat gevuld met voorgekoelde steriele PBS. Onder het felle licht van de microscoop, voorzichtig verwijderen van de embryo's uit de baarmoeder met behulp van microdissection schaar, duim dressing tangen, en Dumont 5 pincet. Gebruik vervolgens een steriele Moria mini geperforeerde lepel om elk embryo over te brengen naar een aparte put van een 24-put plaat gevuld met voorgekoelde winterslaap E lage fluorescentie medium aangevuld met 1X V27.Terwijl u de plaat op ijs houdt, breng u één embryo over op een steriele dissectieplaat en bedek deze volledig met ijskoude steriele Hank's Balanced Salt Solution of HBSS. Gebruik een pincet om het gezicht van het embryo en de staart te verwijderen zonder de midbrain te beschadigen. Plaats vervolgens het embryo gevoelig met ledematen straddled en staart wijzen naar de voorkant van de microscoop.Gebruik een pincet om het dak van de vierde ventrikel open te snijden om een kleine opening te genereren. Gebruik deze opening om pincet haak in de ruimte gemaakt tussen de vierde ventrikel en het dak. Ontleden langs het dorsale oppervlak van het embryo rostral naar de cortex en laterale naar de vloerplaat en motorkolom.Open vervolgens het ontleed weefsel op een open boekmanier om de GFP-positieve CN3- en CN4-kernen te onthullen. Scheid de ventrale midbrain voorzichtig van het embryo en verwijder meningeale weefsel met pincet en een microdissection mes. Ontleden de bilaterale GFP positieve CN3 en CN4 kernen uit de buurt van de vloerplaat en andere GFP positieve omringende weefsel zorgen om te voorkomen dat aanraken of beschadigen van de neuronen.Als het verzamelen van afzonderlijke CN3 en CN4 kernen, snijd langs de midbrain van deze twee kernen en gebruik een P1000 pipet om de ontleed ventrale midbrain weefsel met minimale HBSS te verzamelen. Plaats het in een gelabelde 1,7 milliliter microcentrifuge buis gevuld met dissectie medium en bewaar de buis op ijs tot dissociatie. Blijf ventrale middenhersenen uit extra embryo's in dezelfde buis trekken totdat het totale aantal aan experimentele eisen voldoet.Om het ventrale ruggenmerg te ontleden, houdt u het embryo gevoelig met het hoofd naar de voorkant van de microscoop. Houd het met een pincet en steek de punt van het andere paar in het ongeopende caudal deel van de vierde ventrikel. Open de rest van het achterbrein en ruggenmerg dorsaal over de gehele rostrocaudale omvang van het embryo.Snijd het rugweefsel vanaf de vierde ventrikel en werken in de richting van het centrale kanaal van de staart ruggenmerg met behulp van de tang als schaar. Houd vervolgens het embryo met een set pincet en knijp de flap van het rugweefsel aan elke kant met het andere paar. Verwijder het ventrale ruggenmerg met behulp van het microdosiemes om direct onder de GFP-positieve SMN te doorboren die het ventrale ruggenmerg optilt met zaagachtige bewegingen aan beide zijden.Snijd het ruggenmerg dwars aan de bovengrens van de onderste ledemaat en verwijder het cervicale lendengedeelte. Snijd dwars boven C1 waar de eerste GFP positieve voorste hoorn projecten. Plaats de ventrale ruggenmerg rugzijde omhoog en houd het door het GFP negatieve weefsel tussen de GFP positieve SMN kolommen met een pincet.Verwijder de resterende bijgevoegde mesenchyme, DRGs en ruggenmerg door beide zijden van de GFP-positieve SMN-kolom te trimmen met het microdissection-mes. Gebruik een P1000 pipet om het ontleed ventrale dwarslaesieweefsel te verzamelen met minimale HBSS en plaats het in een gelabelde 1,7 milliliter microcentrifuge buis gevuld met dissectie medium. Bewaar het op ijs tot dissociatie en blijven trekken ventrale ruggenmerg van extra embryo's in dezelfde buis.Voeg het juiste volume papaïneoplossing toe aan elk van de microcentrifugebuizen met de ontleed weefselmonsters. Incubeer de buizen op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten roeren de buizen om de 10 minuten door vinger flicking. Na de incubatie, voorzichtig trituraat elke suspensie acht keer met een P200 pipet en centrifugeren op 300 keer g gedurende vijf minuten.Resuspend de cel pellets met de juiste volume van albumine ovomucoïde remmer oplossing door zachtjes pipetteren op en neer. Herhaal de centrifugatie. Verwijder vervolgens voorzichtig de supernatant met een P1000 pipet.Resuspend de cellen in de juiste volume van dissectie medium. Filter de suspensies door een 70 micrometer celzeef. Gebruik vervolgens FACS-sortering om GFP-positieve cellen te isoleren die zijn ontleed van CN3/CN4 en SMN.Verdun de geïsoleerde celsuspensies met motorneuroncultuurmedium voorverwarmd tot 37 graden Celsius aan de juiste dichtheden en voeg 200 microliters van de suspensie toe aan een put van een PDL laminine-gecoate 96-well plaat. Cultuur van de neuronen in een 37 graden Celsius en 5% kooldioxide incubator ervoor te zorgen dat de motorneuron cultuur medium te vernieuwen om de vijf dagen. Wanneer met succes geïsoleerde neuronen werden geteeld in de cultuur, bijna pure primaire CN3 /CN4 en SMN culturen werden verkregen en onderhouden voor 14 dagen in vitro.De zuiverheid van de culturen op twee dagen in vitro waren 93,5% voor CN3/CN4 en 86,7% voor SMN wanneer beoordeeld door immunocytochemie met de motorneuron marker Islet1 en neuronale marker TUJ1. De zuiverheidszuiverheden waren sterk afhankelijk van de leeftijd van de embryo's en op het vaststellen van de juiste drempels voor GFP-poorten tijdens FACS. De zuiverheid van neuronen geïsoleerd uit E10.5 embryo's waren vergelijkbaar met die van E11.5 embryo's.De zuiverheid nam echter aanzienlijk af toen E13.5 embryo's werden gebruikt. Om te bepalen of primaire CN3/CN4's en SMNs differentiële reacties vertoonden op endoplasmische reticulumstressoren, werden de cellen behandeld met verschillende concentraties cyclopiazonzuur of CPA op twee dagen in vitro en drie dagen later vastgesteld voor immunocytochemie om overlevingsratio's te evalueren. Het aantal levensvatbare neuronen in elk monster werd geteld en overlevingsratio's werden berekend.CN3/CN4 monoculturen waren aanzienlijk beter bestand tegen CPA-behandeling in vergelijking met SMN-monoculturen. Na deze procedure kunnen veel aanvullende methoden worden uitgevoerd om motorneuronen te onderzoeken. Enkele voorbeelden zijn studies naar elektrofysiologie, celbiologie, transcriptie of chromatinetoegankelijkheid.

isolation-culture-oculomotor-trochlear-spinal-motor-neurons-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een alternatieve manier van isoleren van muis embryonale motorneuronen van het ruggenmerg wordt beschreven. De methode houdt rekening met het feit dat de lectine kan binden aan de lage affiniteit zenuw groeifactor receptor p75NTR. Deze lectine-based preplating kan een zuivering vergelijkbaar met die met een specifiek antilichaam tegen de p75NTR.

Lectine-based Isolatie en cultuur van de muis embryonale motoneuronen

Isolatie van embryonale neurale lijst van de neurale buis vergemakkelijkt het gebruik...

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The video demonstrates the isolation of oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons from a transgenic mouse embryo. The embryo expresses motor neurons labeled with a green fluorescent protein (GFP) for easy visualization and identification. The motor neurons are surgically isolated under a fluorescence microscope and maintained in a culture medium.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from a Mouse Embryo

This video demonstrates the ex vivo culture and imaging of oculomotor slices from transgenic mouse embryos. The embryos are isolated and embedded in agarose. Using a vibratome, slices containing the oculomotor nuclei and eyes are obtained. The slices are maintained in culture and imaged using a fluorescence microscope.

Ex Vivo Culture and Imaging of Oculomotor Slices from Transgenic Mouse Embryos

De oorzaken van degeneratie van dopaminerge neuronen in de middenhersenen tijdens de ziekte van Parkinson zijn niet volledig begrepen. Cellulaire kweeksystemen bieden een essentieel hulpmiddel voor de studie van de neurofysiologische eigenschappen van deze neuronen. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol dat kan worden gebruikt voor in vitromodellering van neurodegeneratie.

Isolatie, Cultuur en onderhoud op lange termijn van de Primary mesencefale dopaminerge neuronen uit embryonale knaagdieren Brains

Deze studie presenteert een techniek voor de isolatie van neuronen van WT-neonatale muizen. Het vereist de zorgvuldige dissectie van het ruggenmerg van de neonatale muis, gevolgd door de scheiding van neuronen uit het ruggenmergweefsel door mechanische en enzymatische splitsing.

Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen

We beschrijven de immunomagnetic isolatie van primaire muisknop oligodendrocyten, waarmee het snelle en specifieke isolement van de cellen voor in vitro cultuur.

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

Het doel van deze techniek is om voor te bereiden een hoogverrijkt cultuur van primaire motoneurons (MNs) van lymfkliertest ruggenmerg. Om te beoordelen van de gevolgen van mutaties veroorzaakt MN ziekten, beschrijven we hier het isolement van deze geïsoleerd MNs en hun transfectie door magnetofection.

Modelleren ziekte van Charcot-Marie-Tooth In Vitro door muis primaire Motoneurons Transfecting

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Een ex vivo slice assay maakt het mogelijk om de zenuw uitgroei van de Oculomotor in real-time te laten afbeelen. Segmenten worden gegenereerd door het insluiten van E 10.5 ISLMN: GFP embryo's in agarose, snijden op een vibratome, en groeien in een podium-top incubator. De rol van Axon guidance trajecten wordt beoordeeld door remmers toe te voegen aan de cultuur media.

Ex vivo Oculomotor segment cultuur van embryonale GFP-uitdrukken van muizen voor timelapse-beeldvorming van Oculomotor zenuw uitgroei

Chick ciliary ganglia (CG) maken deel uit van het parasympathische zenuwstelsel. Neuronale culturen van kuiken CG neuronen bleken effectieve celmodellen in de studie van zenuwspier interacties. We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de dissectie, dissociatie en in vitro cultuur van CG neuronen uit kuikenembryo's.

Isolatie en cultuur van Chick Ciliary Ganglion Neurons

Leer de isolatie en cultuur van oculomotor-, trochlear- en spinale motorneuronen uit embryonale muizen. Deze methode maakt vergelijkend onderzoek naar selectieve kwetsbaarheid in motorneuronziekten mogelijk.

Isolatie en cultuur van Oculomotor, Trochlear en spinale motor neuronen van prenatale ISL^MN: GFP transgene muizen

Meer video's verkennen