Synthese van informatiedragende Peptoids en hun reeks-geleide Dynamische Covalent Zelfassemblage

Dit protocol maakt de informatie-gerichte assemblage van oligomerische sequenties mogelijk door dynamische covalente interacties, waarbij de sequentie-selectieve hybridisatie van nucleïnezuren echt nabootst, maar met een verhoogde interstrandbindingsterkte. Dynamische covalente samenstellingen zijn meestal beperkt tot eenvoudige architecturen vanwege hun beperkte capaciteit voor het herschikken en foutcorrectie. In tegenstelling, door het verhogen langs de concentratie van een Lewis zuur te beïnvloeden binding dissociatie en vervolgens katalyseren band herschikking, deze techniek vermindert de heersende kinetische vang vang beperkingen van de zelfassemblage systemen.

Deze methode kan worden gebruikt in een verscheidenheid van gebieden die gebruik maken van covalente binding herschikking reacties, van covalente organische kaders met uitzonderlijk lage defecten tot biomaterieel weefsel interfaces die in staat zijn aan te passen en tegemoet te komen aan de verdere verbouwing van het weefsel substraat. Bij het uitvoeren van deze techniek voor de eerste keer, individuen kunnen vinden kinetisch gevangen assemblages, zelfs na langdurige annealing tijden. Wij adviseren nieuwe gebruikers om te proberen hybridisaties tussen oligomers die uitsluitend aldehyde en uitsluitend amineresiduen dragen, waardoor de gecodeerde informatie en dus hybridisatie worden vereenvoudigd.

Om deze procedure te beginnen, weegt 0,125 gram FMOC fotolabile solid support hars en voeg het toe aan een fritted geautomatiseerd synthesizer reactievat. Steek het vat in het magnetrongedeelte van de synthesizer. Vul de hoofdoplosmiddelenfles met DMF en de deprotectiefles met een oplossing van 20%4-methylpiperidine in DMF en leg het afval.

Bereid vervolgens een molaire oplossingen van broomzuur en DIC in DMF met totale volumes van 1,5 milliliter voor elk residu in volgorde en 0,47 milliliter azijnzuuranhydride tot 4,53 milliliter DMF om een vijf milliliter aftopping oplossing te maken. Bereid 0,5 molaire oplossingen van elke primaire amine voor die in NMP moet worden gebruikt. Het totale volume van elke oplossing moet 2,5 milliliter bedragen voor elk residu van de juiste primaire amine plus een extra 2,5 milliliter.

Voeg alle oplossingen toe aan het geautomatiseerde synthesizerspruitstuk. Met behulp van een geautomatiseerde peptide synthesizer, zwellen de hars, klijken de FMOC-groep, en het uitvoeren van de verplaatsing reactie zoals beschreven in de tekst protocol. Verzilt hierna de wanden van een fritted glazen reactievat uitgerust met een driewegstopcock door deze naar de top te vullen met een oplossing van 5%dichlorodimethylsilane in DCE.

Laat het 30 minuten zitten en laat het vat uitlekken en was het met DCE en methanol. Nadat het vat droog is, moet u de hars erop overbrengen. Was de hars drie keer met DCM met behulp van vijf milliliter voor elke wasbeurt tijdens het borrelen met stikstofgas door de ene arm en het trekken van vacuüm met een andere.

Droog en bewaar de hars en de bijgevoegde oligopeptoïde tot deprotectie en decolleté. Wanneer klaar om verder te gaan, re-zwellen de hars als het is opgeslagen voor meer dan een dag door borrelen met vijf milliliter DMF gedurende 10 minuten. Giet het vat af en voeg een kleine magnetische roerstaaf en drie milliliter droge DCM toe aan het glazen peptidevat.

Weeg 0,1 equivalenten van de palladiumkatalysator en 25 equivalenten fenylsilane per allocgroep. Gebruik een klem om het reactievat onder een hoek boven de roerplaat zodanig te positioneren dat de hars zachte agitatie ondergaat terwijl het in het oplosmiddel blijft hangen en het vat afdoven om te voorkomen dat de DCM verdampt. Na een uur filter je de oplossing eraf en was je de hars drie keer met DCM met vijf milliliter per wasbeurt.

Herhaal vervolgens de alloc-deprotectie nogmaals. Spoel vervolgens de hars achtereenvolgens met methanol en DCM twee keer en breng de hars en magnetische roerstaaf over op een flacon van 20 milliliter. Dompel de hars onder in DMF, roer en kleef zoals beschreven in het tekstprotocol.

Gebruik vervolgens een spuitfilter om bevrijde oligopeptoïde van de hars te scheiden en het oplosmiddel onder vacuüm te verwijderen. Reconstrueer de peptoïden in een 50-50 mengsel van water en acetonitril en zuiveren met omgekeerde fase preparative HPLC. Combineer de gezuiverde fracties, dan bevriezen en lyofieliseren om een off-white poeder opleveren.

Analyseer het poeder met ESI en MALDI massaspectrometrie. Om de zuiverheid te evalueren, voert u analytische HPLC uit van de gezuiverde oligopeptoïden. Bereid eerst 10 millimolar stock oplossingen van elke oligopeptoïde sequentie gebruikt voor zelfassemblage en een 10 millimolar voorraad oplossing van scandium triflate in watervrije acetonitril.

Voeg 20 microliter van elke peptoïde voorraadoplossing toe aan een drie milliliter flacon uitgerust met een magnetische roerstaaf. Voeg 1,5 equivalenten van de scandiumtriflateoplossing per potentiële aminebinding uit de voorraadoplossing toe en voeg voldoende water en acetonitril toe om 200 microliters van een 2%water- en acetonitriloplossing te vormen. Roer voorzichtig op 70 graden Celsius gedurende twee uur voor acetyl deprotectie van de aldehyde en dissociatie van alle strengen.

Laad hierna de flacon op met 200 microliter chloroform en twee milliliter water. Schud de flacon voorzichtig. Laat het mengsel minstens 15 minuten staan.

Bij volledige fasescheiding, extract de organische laag met een microliter spuit. Breng de organische laag naar een nieuwe flacon en roer op 70 graden Celsius voor oligomer annealing die meestal zes uur duurt. Om het vermogen van informatiegecodeerde peptoïden aan te tonen om sequentie-selectieve dynamische covalente zelfassemblage ondergaan in moleculaire ladders, een representatieve streng wordt gesynthetiseerd en gehybridiseerd met zijn complementaire peptoïde sequentie.

De monomeren NPAM en NPAL worden gebruikt als dynamische covalente reactant paren met NEEE helpen oplosbaarheid van de uiteindelijke zelf geassembleerde producten. Na voltooiing van de vaste fase submonomerensynthese wordt de allocgroep verwijderd. Voorafgaand aan en na de bescherming, werden delen van de hars gespleten onder 405 nanometer licht en gekenmerkt door elektrospray ionisatie massaspectrometrie.

De sequentie wordt gezuiverd door prep HPLC, vervolgens lyophilized om een off-white poeder te bereiken en de zuiverheid wordt bevestigd met analytische HPLC. De oligopeptoid wordt vervolgens gehybridiseerd met zijn aanvullende volgorde om een in-register ladder bevestigd door MALDI-MS veroorloven. Bij het uitvoeren van deze procedure, vergeet niet om voldoende tijd voor de lagen volledig scheiden totdat de waterige fractie transparant wordt, ten minste 15 minuten om voldoende katalysator extractie te garanderen.

Na het voltooien van deze assemblageprocedure moet massaspectrometrie worden uitgevoerd om de mate van hybridisatie te bepalen. Bovendien kan inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie of fluor NMR worden gebruikt om de scantriumconcentratie na extractie te beoordelen. Hoewel deze techniek onlangs is ontwikkeld, verwachten we dat de biomimetische benadering die in ons werk wordt beschreven, een belangrijke rol zal spelen bij het aansturen van het toekomstige ontwerp en de informatiegestuurde assemblage van complexe nanostructuren.

Verschillende van de reagentia die hier worden gebruikt zijn gevaarlijk. Wees voorzichtig bij het hanteren van deze of andere chemische stoffen. Draag alle persoonlijke beschermingsmiddelen en voer alle experimenten uit in een rookkap.