Toenemende duurzaamheid van gedissocieerde neurale celculturen met behulp van biologisch actieve coralline matrix

De betekenis van dit protocol is dat het een nieuwe manier biedt om de duurzaamheid en groei van neuronen, gliacellen en stamcellen in vitro te verhogen. Het is ook toepasbaar voor andere cellen. Het grootste voordeel van de techniek is het gebruik van een matrix gemaakt van koraalskelet.

Deze matrix voedt en beschermt neurocellen en bevordert hergroei. Doordat het koraalskelet ondersteunend is voor neurale cellen in vitro, kan het functioneren als een regeneratief implantaat op plaatsen van hersenletsel. Gebruik eerst een hamer om het koraalskelet te breken en verdeel het in fragmenten van 0,5 tot twee centimeter.

Om organische en niet-organische restanten op te lossen, laat je de fragmenten van het koraalskelet 10 minuten weken in een 10% natriumhypochlorietoplossing. Was vervolgens eenmaal met twee keer gedestilleerd water. Om de resterende organische restanten te verwijderen, laat je de fragmenten vijf minuten weken in een eenmolaire natriumhydroxide-oplossing, en was vervolgens eenmaal met twee keer gedestilleerd water.

Ga verder met het verwijderen van de organische afzettingen door de fragmenten 10 minuten in een 30% waterstooplossing te weken, en was de fragmenten drie keer met twee keer gedestilleerd water. Verwijder zoveel mogelijk overtollig twee keer gedestilleerd water en laat de koraalfragmenten in de afzuigkap drogen. Reinig vervolgens de glazen deksels door ze in 10 milliliter 95% ethanol in een 100 millimeter glazen Petri-schaal te weken.

Na 15 minuten, verwijder je het ethanol en was drie keer met twee keer gedestilleerd water, wacht tussen elke wasbeurt 10 minuten. Verwijder het twee keer gedestilleerd water en plaats de schaal op een voorverwarmde verwarmingsplaat van 80 graden Celsius. Roer vervolgens voorzichtig de deksels tot het twee keer gedestilleerd water verdampt.

Autoclaveer de deksels. Maal de fragmenten van het koraalskelet met een vijzel en stamper tot volledige afbraak. Er wordt een mengsel van korrels verkregen met groottes variërend van 20 tot 200 micrometer.

Alternatief, maal de fragmenten van het koraalskelet met een elektrische maalmachine met een bladlengte van zes centimeter en een breedte van 0,5 tot één centimeter, bij een snelheid van 1000 RPM gedurende 30 seconden. Om de korrels te zuiveren, breng je de korrels over op een elektrische 40 micron filtergaas zeef. Pas de instellingen van de elektrische zeef aan op schudden met 600 amplituden per minuut en stuiteren met zes keer per seconde.

Autoclaveer vervolgens de korrels. Onder steriele omstandigheden, voeg je de korrels van het koraalskelet toe aan een PDL van 20 microgram per milliliter, opgelost in Hank's oplossing om de concentratie van vijf milligram of 10 milligram korrels per één milliliter PDL-oplossing te bereiken. Giet de oplossing in flessen en schalen met een concentratie van ongeveer twee milliliter per 25 vierkante centimeter, en incubeer een nacht bij vier graden Celsius.

De korrels zinken en hechten zich aan de bodem. De volgende dag, was je de flessen en schalen eenmaal met sterieel twee keer gedestilleerd water. Laat de flessen en schalen drogen in de afzuigkap.

Om de glazen deksel te coaten, voeg je eerst korrels van het koraalskelet toe aan twee keer gedestilleerd water met een concentratie van vijf of 10 milligram per milliliter. Plaats de deksels op een verwarmingsplaat voorverwarmd tot 80 graden Celsius. Laat vervolgens 40 microliters van de korrelsoplossing druppelen op het centrum van de deksel, en wacht 15 minuten voor volledige verdamping.

Dit zal resulteren in het hechten van de korrels aan de deksel. Autoclaveer de gecoate deksels, en bewaar ze onder steriele omstandigheden. Plaats vervolgens de deksels op het deksel van een steriele 24-well plaat, voeg 100 microliters van 20 microgram per milliliter PDL-oplossing toe aan elke deksel.

Gebruik de punt om ervoor te zorgen dat de vloeistof het hele korrelgebied en de rest van het oppervlak van de deksel bedekt. Bedek het deksel met de bodem van de plaat, en wikkel de zijkanten van de plaats met paraffine film. Incubeer een nacht bij vier graden Celsius.

De volgende dag, was je de deksels eenmaal met twee keer gedestilleerd water en droog ze in de afzuigkap. Na het voorbereiden van de koppen van rattenpups, houd je deze vast met grote pincetten vanuit de mond. Snijd de huid die de schedel bedekt met een kleine schaar.

Met schone schaar, ga je onder de schedel aan de kant van het cerebellum en snijd de schedel naar rechts en naar links om deze te verwijderen. Gebruik kleine pincetten om de schedel van de hersenen te pellen. Scheid de hersenen van het hoofd en plaats ze in een 60 millimeter Petri-schaal met twee milliliter koude MEM.

Gebruik onder een stereomicroscoop twee kleine pincetten om de hippocampus te dissekeren. Breng de hippocampus over in de voorbereide 35 millimeter schotel met MEM. Snijd de hippocampus in ongeveer een millimeter plakjes met behulp van het scalpel.

Voeg 200 microliters trypsinoplossing toe. Meng voorzichtig en incubeer bij 37 graden Celsius en vijf tot 10% koolstofdioxide gedurende 30 minuten. Voeg na de incubatie twee milliliter koude MEM toe aan de schotel om het trypsine te deactiveren.

Gebruik vervolgens een glazen Pasteur-pipet met de grootste diameter om het trypsiniseerde weefsel over te brengen naar een 15 milliliter buisje met één milliliter van het medium van de eerste dag, voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Tritureer het weefsel door het 10 tot 15 keer door de grootste diameter glazen pipet te laten passeren. Herhaal vervolgens dit proces met behulp van de glazen pipet met de medium diameter.

Ga door met tritureren met de pipet met de kleinste diameter. Vermijd bubbelen om celdood te verminderen. Laat de gedissocieerde weefselstukken twee tot vijf minuten zinken.

Breng vervolgens he