Fluorescentie-geactiveerde celsorde voor de isolatie van scleractinische celpopulaties
31 mei 2020
Koralen creëren biodiverse ecosystemen die belangrijk zijn voor zowel mensen als mariene organismen. We begrijpen echter nog steeds niet het volledige potentieel en de functie van veel koraalcellen. Hier presenteren we een protocol ontwikkeld voor de isolatie, etikettering en scheiding van steenachtige koraalcelpopulaties.
Dit protocol vergemakkelijkt de identificatie en isolatie van levende koraalcelpopulaties op een beschrijvingsniveau dat voorheen niet mogelijk was. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het toegang geeft tot een niveau van celspecificiteit dat tot nu toe meestal onbereikbaar was. Het aantonen van de procedure zal Dr.Shannon Saigh, een onderzoeksmedewerker van de stroom cytometrie gedeelde bron op de Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Als u de stroomcytometer wilt instellen voor het sorteren van levende koraalcellen, opent u een nieuwe projectsjabloon in de stroomcytometersoftware en selecteert u de juiste lasers voor de analyse in het laserpaneel. Maak vervolgens een side scatter versus forward scatter plot in de juiste plots voor het opzetten van de gating en analyse strategie. Voor de stromingscytometrische analyse en het sorteren van de levende koraalcellen, laad het controle-niet-gekleurde celmonster in de monsterkamer van de cytometer en start u het leesproces.
Aangezien koraalcellen bijzonder kwetsbaar zijn, houdt u de cytometerdruk laag om cellyse te voorkomen. Pas in de spreidingsplot de spanning van de fotomultiplier aan om de punten te centreren en begin met het registreren van de gebeurtenissen. In de voorwaartse versus zijverstrooiingsplot, maak een poort rond de cellen rond de 10 tot de 4e markering op de voorwaartse scatter x-as.
Vervang het controlemonster door het eerste monster van gekleurde cellen en neem ongeveer 10.000 cellen op voordat u pauzeert. Bek je vervolgens over de gebeurtenissen die uniek zijn voor de gekleurde steekproefgroep. Om levende koraalcellen te sorteren, plaats na het selecteren van de celpopulatie van belang in de stroomcytometersoftware één microcentrifugebuis met 250 tot 500 microliters van de juiste inzamelingsoplossing in de cytometer-verzamelkamer voor elke te sorteren populatie.
Zodra een geschikte hoeveelheid tijd is verstreken om puin weg te spoelen, beginnen met het sorteren van de gewenste populatie om overal te verzamelen van 10.000 tot enkele miljoenen cellen. Elke keer dat een nieuwe vlek, soort of sorteerder wordt gebruikt, sorteren ten minste 20,000 cellen van belang in 500 microliters van kleuring medium om een zuiverheidscontrole uit te voeren op de populatie van belang en reanalyze de gesorteerde cellen om te bevestigen dat de gebeurtenissen worden gelezen binnen de poort gebruikt voor de eerste sortering. Voor in vitro studies, bewaar de gesorteerde cellen op ijs totdat ze worden overgebracht naar een incubator of gesteriliseerde omgeving.
Om andere niet-cellulaire deeltjes binnen te brengen die niet dezelfde vorm of granulariteit delen als de koraalcellen, kunnen ze uit de analyse worden verwijderd door een poortselectie te maken op een voorwaartse en zijverstrooiingsplot. De dode cellen kunnen worden uitgesloten door het dapi-signaal van de onbevlekte en gekleurde celsuspensies te vergelijken met behulp van een histogram en het uit elkaar halen van de hoge DAPI-uitdrukkende cellen. Tegelijkertijd kunnen cellen die autofluorescentie symbiodeneasia hosten worden verwijderd door tegen cellen met het hoge signaal in het verre rode kanaal te gating.
Na dit iteratieve gatingproces vertegenwoordigen de resterende cellen de intacte levende koraalcelpopulaties die symbiodeneasia missen. Deze cellen kunnen vervolgens worden ingedeeld in verschillende celsubpopulaties door vlekken op kenmerken zoals reactieve zuurstofsoorten activiteit en / of lysosoom gehalte. Het is van cruciaal belang om te onthouden dat sommige cellen kwetsbaarder zijn dan andere en om dit proces zo zorgvuldig mogelijk uit te voeren.
Zodra specifieke cellen zijn geïsoleerd, kunnen ze worden gebruikt voor x-vivo functionele tests, zoals het vaststellen van celculturen en het maken van transcriptomische profielen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op de behoefte aan beter begrip van koraalcellen, die cruciaal zijn voor biodiversiteit in mariene ecosystemen. De auteurs presenteren een nieuw protocol voor het isoleren en labelen van populaties van steenkoraalcellen, waarbij een ongekend niveau van celspecificiteit wordt bereikt.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Koraalbiologie
- Technieken voor celisolatie
- Biodiversiteit van ecosystemen
Achtergrond
- Koralen vormen essentiële ecosystemen voor zeeleven.
- Huidige kennis van koraalcelfuncties is beperkt.
- Het isoleren van specifieke koraalcelpopulaties is vitaal voor verder onderzoek.
Gebruikte methoden
- Flowcytometrie voor het sorteren van levende cellen
- Steenkoraal als modelorganisme
- Gatingstrategie voor het identificeren en isoleren van specifieke celtypen
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt identificatie en sorteer van levende koraalcelpopulaties mogelijk.
- Garandeert zuiverheid en levensvatbaarheid van gesorteerd cellen voor toekomstige tests.
- Vaciliteert het onderzoek naar subpopulaties en hun functies.
Conclusies
- De studie presenteert een betrouwbare methode voor het isoleren van koraalcellen, waardoor het onderzoekspotentieel wordt vergroot.
- Bevindingen leveren waardevolle inzichten in koraalbiologie en gezondheid van ecosystemen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolating specific cell populations from complex tissues remains a critical challenge in early-stage target validation and mechanistic de-risking. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables high-resolution cellular interrogation, supporting predictive confidence in pathway-specific responses. This capability is directly applicable to biopharma discovery workflows requiring precise functional assays and transcriptomic profiling of rare or fragile cell types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses at single-cell resolution by isolating live populations for functional validation.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by separating viable cell subpopulations from debris, dead cells, and symbiont-associated signals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating purified inputs for downstream assays that clarify target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, viable cell suspensions suitable for reproducible functional assays and dose-response profiling.
- Operational Value: Establishes gating strategies that ensure assay readiness and minimize variability across experimental runs.
- Scalability: Allows collection of sufficient cell numbers (10,000 to several million) for multi-well screening and omics applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by enabling consistent isolation of disease-relevant cell populations for mechanistic follow-up.
- Biomarker Alignment: Facilitates staining for stress-response markers (e.g., reactive oxygen species, lysosome content) to correlate cellular phenotypes with functional outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Purified populations improve data reliability in preclinical models, reducing false positives from heterogeneous samples.
Pipeline & Workflow Integration
FACS integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by enabling precise cellular inputs at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating live coral (or analogous mammalian) cell populations for pathway-specific functional interrogation.
- Screening: Delivers standardized, gated cell populations that enhance assay reproducibility and quantitative readout reliability.
- Analytics: Generates high-purity samples enabling accurate transcriptomic, proteomic, or metabolic profiling to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation through consistent preparation of viable, stress-responsive cell subsets.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across projects requiring subcellular resolution, independent of model system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing noise from non-target cells and enabling mechanistic de-risking of targets.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through reproducible gating, low-pressure sorting, and viability-preserving collection methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing cleaner biological data, reducing late-stage failure risk from flawed target assumptions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable subpopulation-specific data that informs advancement criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, including laser selection, voltage optimization, and scatter plot gating for fragile cells.
- Dependent on instrumentation capable of low-pressure sorting and multi-parameter detection (forward/side scatter, fluorescence channels).
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols, collection media, and gating thresholds to ensure reproducibility.
- Must account for variability in cell fragility across species or conditions, requiring iterative optimization of shear stress and staining duration.
- Limited by sample preparation quality; enzymatic or mechanical dissociation must preserve epitope integrity and cell viability for accurate sorting.
