Name: Laser-geïnduceerde fluorescentie emissie (L.I.F.E.) als nieuw niet-invasief hulpmiddel voor in-situ metingen van biomarkers in Cryoferische habitats (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: Ontdek een niet-invasieve methode voor in-situ metingen van biomarkers in cryosferische habitats met laser-geïnduceerde fluorescentie. Deze techniek minimaliseert fysieke impact op monsters en biedt hoge ruimtelijke resolutie voor onderzoek naar microbieel leven.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken kolonel (IL) j. Pritzker, de Tawani Foundation, USA, het Oostenrijkse federale ministerie van Wetenschappen, onderzoek en economie (Sparkling Science SPA04_149 and SPA05_201), Alpine forschungsstelle Obergurgl (AFO), Austrian Space Forum ( ÖWF), Romeins Erler van de Hintertuxer Natur eis Palast, de Oostenrijkse federale bosbouw en basis Manager Nick Cox van het Noordpool station in NY Alesund (Spitsbergen). We zijn ook dank verschuldigd aan Sabrina Obwegeser, Carina Rofner en Fabian Drewes voor hun hulp bij het filmen. Tot slot willen we James Bradley bedanken voor het geven van de stem voor de gelijktijdige video.

1. kalibratie en validering
Opmerking: voor de kalibratie van het pigment, bereid verdunnings rijen uit stamoplossingen van CHLa en B-PE. De CHLa Stock Solution wordt verdund met aceton en B-PE wordt verdund met gedistilleerd steriel water. Later zal 15 mL van elke verdunningsstap nodig zijn. Bescherm de pigmenten tegen licht door ze met aluminiumfolie te wikkelen. Bewaar de CHLa in de vriezer en de B-PE in de koelkast tot verder gebruik. Een gedetailleerd protocol voor de verdunnings rij volgt in de paragrafen 1,1 voor CHLa en 1,2 voor B-PE. Zowel de CHLa als de B-PE laboratorium kalibratie voor pigment detectie en kwantificering met het L.I.F.E. instrument wordt hieronder beschreven. Een eerdere kalibratie24 werd gemaakt met dezelfde pigmenten als in deze studie.
<ol><li>
Chlorofyleen verdunnings rij
	<ol>
<li>Los 1 mg CHLa op (gezuiverd van a. nidulans algen) met aceton in een monsterbuisje van 50 ml en Verdun deze CHLeen stamoplossing met aceton naar de volgende eindconcentraties: 1.000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20 10 5 1 en 0,5 ng/mL.</li>
		<li>Breng 15 mL van elke verdunning over in 50 mL monsterbuisjes en bedek ze in aluminiumfolie als gevolg van lichtgevoeligheid. Bewaar de buisjes in een vriezer van a-20 °C tot de kalibratie metingen zijn uitgevoerd. Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken.</li>
		<li>Meet de CHLeen absorptie-eigenschappen van elke verdunning in een dubbelwandige spectrofotometer als triplicates en bereken de CHLa -inhoud zoals beschreven door Lorenzen25, die gedetailleerd zal worden beschreven in punt 2.2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PE-verdunnings rij
	<ol>
<li>Verdun een 4 mg/mL B-PE stamoplossing met steriel gefilterd water (pH = 7) tot de volgende eindconcentraties: 1.000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20 10 en 5 ng/mL B-PE. Breng 15 mL van elke verdunning in een monsterbuisje van 50 mL en dek het af met aluminiumfolie. Bewaren bij 4 °C tot verder gebruik. Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Instellen voor kalibratie
	<ol>
<li>Bouw een rek zoals getoond in Figuur 5 om drie meet platformen te maken, elk 1,5 cm hoger dan de volgende. Opmerking: het rek en de kolom hoogte spelen een belangrijke rol voor de metingen, omdat het oppervlak van de vloeistoffen in het brandpunt van het L.I.F.E.-instrument moet blijven, zoals aangegeven in Figuur 5.</li>
		<li>Voeg 5 mL van de hoogste geconcentreerde verdunning toe in een plastic injectieflacon met polyscintillatie en zet deze op het hoogste punt van het rek. Meet de intensiteit van de fluorescentie.</li>
		<li>Plaats de injectieflacon in de middelste positie van het rek en voeg nog eens 5 mL (10 mL totaal volume) toe. Meet de intensiteit van de fluorescentie. Herhaal de procedure op de laagste positie op het rek met nog eens 5 mL (15 mL totaal volume; totaal 45 mm in kolom hoogte). Opmerking: pas de belichtingstijd voor elke verdunningsstap aan om de verzadiging van de detector te voorkomen (grijswaarden over 255 in 12-bits afbeeldingen) en voor een voldoende signaal-ruis verhouding van de zwakke fluorescentie signalen.</li>
		<li>Herhaal stap 1.3.2 en 1.3.3 met alle verdunningen (stappen 1.1.1 en 1.2.1) van CHLa en B-PE.</li>
		<li>Laad de gegenereerde gegevensbestanden in de wizard gegevensreductie om automatisch de grijze waarden van elke pixel lijn op de Y-as (ruimtelijke verdeling) te tellen en samen te vatten. Opmerking: wisselende belichtingstijden worden automatisch gecompenseerd door de intensiteit van de fluorescentie te normaliseren tot een integratie tijd van 1 sec.</li>
		<li>Bereken de dichtheid van het pigment gebied met een Poisson-regressieanalyse met behulp van de bekende concentraties uit de verdunningsreeks en de genormaliseerde fluorescentie intensiteiten die werden berekend. Normaliseer vervolgens de fluorescentie tellingen van de drie verschillende kolom hoogten tot 1,5 cm (5 mL) door de tellingen te vermenigvuldigen van elke kolom hoogte met een factor (factoren 1, 0,5 en 0,33, respectievelijk voor de 5 mL, 10 mL en 15 mL concentratie oplossingen).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig05.jpg"> Afbeelding 5: opstelling voor de L.I.F.E. kalibratie met CHLa en B-PE onder laboratoriumcondities. A) lens buis van het apparaat. B) groene laser voor B-PE-excitatie. (C) blauwe laser voor CHLeen excitatie. D) injectieflacon met scintillatie. E) het brandpunt van het L.I.F.E.-instrument. F) B-PE/water of CHLa/aceton oplossing met 5 ml, 10 ml en 15 ml. G) spacers die het oppervlak van elke oplossing in het brandvlak voor drie verschillende volumes houden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
2. bemonstering en monsterverwerking
<ol><li>Collectie sneeuw en ijs
	<ol>
<li>Verzamel sneeuw en supraglaciaal ijs van een gletsjer in steriele polyethyleenzakken en bewaar ze bevroren tot verdere verwerking. Opmerking: voor deze studie werden de monsters verzameld bij Midtre Lovenbreen (MLB), een polythermale gletsjer in de buurt van het onderzoekscentrum Ny-Ålesund in de hoge arctische archipel van Spitsbergen (78 ° 53 ' NB, 12 ° 03 ' E).</li>
		<li>Proef bacteriële matten van het forefield van de gletsjer in steriele polyethyleenzakken en Transporte alle monsters naar een laboratorium voor verdere verwerking.</li>
		<li>Smelt bevroren materiaal langzaam in het donker bij 4 °C. Filter vloeibare monsters op GF/F-filters (47 mm diameter) en noteer het gefilterde volume. Bewaar de filters tot verdere verwerking bevroren.</li>
	</ol></li>
	<li>Chlorofyla -metingen
	<ol>
<li>Met behulp van de L.I.F.E. instrument, meet het filter in vier willekeurige gebieden, elk in triplicates met behulp van de groene en blauwe laser. Bereken de totale pigmentconcentratie door de dichtheid van het gebied te vermenigvuldigen met het gefilterde gebied en het gefilterde volume. Normaliseer de pigmentconcentratie (μg/L) tot een volume van 1 L.</li>
		<li>Beoordeel de CHLa inhoud van de GF/F filters met een laboratorium norm volgens het Protocol van Lorenzen25. Om dit te doen, zet elk van de filters in een injectieflacon met 13 mL aceton en bewaar ze in het donker bij 4 °C 's nachts. Neem vervolgens een injectieflacon en plaats deze op het ijs voor sonicatie gedurende 2 minuten bij 50% stroom in continue modus. Knijp en verwijder het filter uit de injectieflacon.</li>
		<li>Bevestig tygon-slangen aan een spuit en verwijder deCHL- extractie-aceton-mix uit de injectieflacon. Vervang de tygon-slang door een GF-5-filterhouder. Breng de oplossing over in een kwarts kuvette.</li>
		<li>Nadat u de absorptie spectrometer voor aceton heeft gekalibreerd, plaatst u het monster in de Cuvette in de spectrometer en meet u de extinctie-eigenschappen tussen 400 – 750 nm. Verwijder vervolgens de Cuvette van de spectrometer en voeg 200 μL van 2 M HCl toe aan het monster. Herhaal vervolgens de extinctie meting om het phaeophytin gehalte in het monster te meten.</li>
	</ol></li>
	<li>Meting van microbiële activiteit via radioactief gelabelde markers en impact van laserintensiteit en belichtingstijd op productiviteits percentages Let op: pas op voor de radioactiviteit van de marker (β-straling). Gebruik een laboratoriumjas, handschoenen en bril en werk onder een rook afzuigkap in een erkend isotoop laboratorium.<ol>
<li>Voor bacteriële productie overdracht vijf aliquots van bacteriële matten in steriele polyethyleenzakken. De controles met formaldehyde inactiveren tot een eindconcentratie van 4%. Opmerking: drie aliquots worden gebruikt voor de 3H-gelabelde Leucine-opname en twee aliquots worden gebruikt als besturingselementen.</li>
		<li>Stel de matten bloot met een blauwe laser (405 nm, 5 mW) en met een groene laser (532 nm, 5 mW) voor 10 s en 30 s per stuk. Herhaal de procedure met 50 mW lasers. Vervolgens, inactiveren van de monsters die niet zijn behandeld met formaldehyde. Opmerking: Eén mat wordt gebruikt voor slechts één Laser blootstelling. Gebruik niet-blootgestelde microbiële matten als besturingselementen.</li>
		<li>Na de laserbehandeling, schatten de bacteriële en primaire productie door het opnemen van 3H-Leucine en Nah14co3, respectievelijk. Gebruik voor bacteriële productie metingen vijf aliquots per monster (20 mL) en voeg formaline (4% eindconcentratie) toe aan twee van de parallellen, die fungeren als besturingselementen voor de abiotische opname van de marker. Voeg 3h-leucine (40 nm) toe aan alle monsters van de verschillende behandelingen en incuberen ze gedurende 4 uur onder in situ omstandigheden (0,1 °c). Beëindig de reactie door formaline toe te voegen aan de overgebleven Live samples.</li>
		<li>Voor bacteriële productie van bacteriële matten, overdracht van gelabelde monsters in cryoflesjes. Extraheer cellen met 5% trichloorazijnzuur en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 5 minuten volgens de protocollen van kirchman26 en Bell27. Voeg Scintillatie Liquid toe en plaats de cryovial in een injectieflacon met polyscintillatie. Analyseer de monsters met een vloeibare Scintillatie teller en bereken de opnamesnelheden. Opmerking: drie aliquots worden gebruikt voor de 3H-gelabelde Leucine-opname, twee aliquots worden gebruikt als besturingselementen.</li>
		<li>Voor de primaire productie, bereid vijf replicaten van verschillende behandelingen (100 mL), wikkel twee van hen in aluminiumfolie om de donkere monsters na te bootsen, en voeg NaH14co3 (1 μci) toe aan iedereen. Inincuberen gedurende 4 uur in het omgevingslicht en in situ temperatuur (0,1 °C). Beëindig de reactie door de resterende drie replicaten donkerder te maken en het monster te filteren op GF/F-filters (diameter 25 mm).</li>
		<li>Voeg 100 μL van 2 N HCl toe aan de filters om alle overtollige koolstof te verwijderen en laat het lucht uit onder de rook afzuigkap. Droog de monsters op een verwarmingsplaat bij 80 °C en plaats monsters in injectieflacons met polyscintillatie.</li>
		<li>Voor het meten van radioactieve desintegraties per minuut (DPM) van alle behandelingen van primaire en bacteriële productie, plaats de cryoflesjes in polyscintillation flesjes en voeg 5 ml Scintillatie cocktail. Meet DPM met een vloeibare Scintillatie teller en bereken de opnamepercentages.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Boyd, E. S., Skidmore, M., Mitchell, A. C., Bakermans, C., Peters, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogenesis+in+subglacial+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Methanogenesis in subglacial sediments.</a> Environmental Microbiology Reports. 2, 685-692 (2010).</li>
<li>Sattler, B., Puxbaum, H., Psenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+growth+in+supercooled+cloud+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Geophysical+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Bacterial growth in supercooled cloud droplets.</a> Geophysical Research Letters. 28, 239-242 (2001).</li>
<li>Good, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+recent+developments+in+climate+change+science.+Part+I%3A+Understanding+of+future+change+in+the+large-scale+climate+system%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Physical+Geography%22%5BJournal%5D)">A review of recent developments in climate change science. Part I: Understanding of future change in the large-scale climate system.</a> Progress in Physical Geography. 35, 281-296 (2011).</li>
<li>Fountain, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Disappearing+Cryosphere%3A+Impacts+and+Ecosystem+Responses+to+Rapid+Cryosphere+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22BioScience%22%5BJournal%5D)">The Disappearing Cryosphere: Impacts and Ecosystem Responses to Rapid Cryosphere Loss.</a> BioScience. 62, 405-415 (2012).</li>
<li>Rignot, E., Mouginot, J., Morlighem, M., Seroussi, H., Scheuchl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread%2C+rapid+grounding+line+retreat+of+Pine+Island%2C+Thwaites%2C+Smith%2C+and+Kohler+glaciers%2C+West+Antarctica%2C+from+1992+to+2011%5BTitle%5D)+AND+%22Geophysical+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Widespread, rapid grounding line retreat of Pine Island, Thwaites, Smith, and Kohler glaciers, West Antarctica, from 1992 to 2011.</a> Geophysical Research Letters. 41, 3502-3509 (2014).</li>
<li>McMillan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ice+losses+from+Antarctica+detected+by+CryoSat-2%5BTitle%5D)+AND+%22Geophysical+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Increased ice losses from Antarctica detected by CryoSat-2.</a> Geophysical Research Letters. 41, 3899-3905 (2014).</li>
<li>Barletta, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glacier+shrinkage+and+modeled+uplift+of+the+Alps%5BTitle%5D)+AND+%22Geophysical+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Glacier shrinkage and modeled uplift of the Alps.</a> Geophysical Research Letters. 33, 14307(2006).</li>
<li>Nuth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decadal+changes+from+a+multi-temporal+glacier+inventory+of+Svalbard%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cryosphere%22%5BJournal%5D)">Decadal changes from a multi-temporal glacier inventory of Svalbard.</a> The Cryosphere. 7, 1603-1621 (2013).</li>
<li>Takeuchi, N., Kohshima, S., Seko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+formation%2C+and+darkening+process+of+albedo-reducing+material+%28cryoconite%29+on+a+Himalayan+glacier%3A+A+granular+algal+mat+growing+on+the+glacier%5BTitle%5D)+AND+%22Arctic+Antarctic+and+Alpine+Research%22%5BJournal%5D)">Structure, formation, and darkening process of albedo-reducing material (cryoconite) on a Himalayan glacier: A granular algal mat growing on the glacier.</a> Arctic Antarctic and Alpine Research. 33, 115-122 (2001).</li>
<li>Takeuchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+characteristics+of+cryoconite+%28surface+dust%29+on+glaciers%3A+the+relationship+between+light+absorbency+and+the+property+of+organic+matter+contained+in+the+cryoconite%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Glaciology%22%5BJournal%5D)">Optical characteristics of cryoconite (surface dust) on glaciers: the relationship between light absorbency and the property of organic matter contained in the cryoconite.</a> Annals of Glaciology. 34, 409-414 (2002).</li>
<li>Anesio, A. M., Hodson, A. J., Fritz, A., Psenner, R., Sattler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+microbial+activity+on+glaciers%3A+importance+to+the+global+carbon+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Change+Biology%22%5BJournal%5D)">High microbial activity on glaciers: importance to the global carbon cycle.</a> Global Change Biology. 15, 955-960 (2009).</li>
<li>Anesio, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+fluxes+through+bacterial+communities+on+glacier+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Glaciology%22%5BJournal%5D)">Carbon fluxes through bacterial communities on glacier surfaces.</a> Annals of Glaciology. 51, 32-40 (2010).</li>
<li>Storrie-Lombardi, M. C., Sattler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-Induced+Fluorescence+Emission+%28L.I.F.E%29%3A+In+Situ+Nondestructive+Detection+of+Microbial+Life+in+the+Ice+Covers+of+Antarctic+Lakes%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E): In Situ Nondestructive Detection of Microbial Life in the Ice Covers of Antarctic Lakes.</a> Astrobiology. 9, 659-672 (2009).</li>
<li>Murray, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+life+at+-13+%C2%B0C+in+the+brine+of+an+ice-sealed+Antarctic+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microbial life at -13 °C in the brine of an ice-sealed Antarctic lake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20626-20631 (2012).</li>
<li>Edwards, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+fungal+community+inhabiting+cryoconite+holes+on+glaciers+in+Svalbard%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Ecology%22%5BJournal%5D)">A distinctive fungal community inhabiting cryoconite holes on glaciers in Svalbard.</a> Fungal Ecology. 6, 168-176 (2013).</li>
<li>Miteva, V. Bacteria in Snow and Glacier Ice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiteva%2C+V+%22Psychrophiles%3A+from+Biodiversity+to+Biotechnology%22">Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology</a>. Margesin, R., Schinner, F., Marx, J. C., Gerday, C. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin/Heidelberg, Germany. 31-50 (2008).</li>
<li>Yallop, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysiology+and+albedo-changing+potential+of+the+ice+algal+community+on+the+surface+of+the+Greenland+ice+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Photophysiology and albedo-changing potential of the ice algal community on the surface of the Greenland ice sheet.</a> The ISME Journal. 6, 2302-2313 (2012).</li>
<li>Edwards, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metagenomic+snapshot+of+taxonomic+and+functional+diversity+in+an+alpine+glacier+cryoconite+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">A metagenomic snapshot of taxonomic and functional diversity in an alpine glacier cryoconite ecosystem.</a> Environmental Research Letters. 8, 035003(2013).</li>
<li>Remias, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+UV-and+VIS-absorbing%2C+purpurogallin-derived+secondary+pigment+new+to+algae+and+highly+abundant+in+Mesotaenium+berggrenii+%28Zygnematophyceae%2C+Chlorophyta%29%2C+an+extremophyte+living+on+glaciers%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Characterization of an UV-and VIS-absorbing, purpurogallin-derived secondary pigment new to algae and highly abundant in Mesotaenium berggrenii (Zygnematophyceae, Chlorophyta), an extremophyte living on glaciers.</a> FEMS Microbiology Ecology. 79, 638-648 (2012).</li>
<li>Cook, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+estimate+of+microbially+mediated+carbon+fluxes+from+the+Greenland+ice+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Glaciology%22%5BJournal%5D)">An improved estimate of microbially mediated carbon fluxes from the Greenland ice sheet.</a> Journal of Glaciology. 58, 1098-1108 (2012).</li>
<li>Mueller, D. R., Vincent, W. F., Pollard, W. H., Fritsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glacial+cryoconite+ecosystems%3A+a+bipolar+comparison+of+algal+communities+and+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Nova+Hedwigia+Beiheft%22%5BJournal%5D)">Glacial cryoconite ecosystems: a bipolar comparison of algal communities and habitats.</a> Nova Hedwigia Beiheft. 123, 173-198 (2001).</li>
<li>Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. C., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., Huner, N. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+Acclimation+of+Photosynthetic+Microorganisms+to+Permanently+Cold+Environments%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Adaptation and Acclimation of Photosynthetic Microorganisms to Permanently Cold Environments.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70, 222-252 (2006).</li>
<li>Hodson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryoconite+ecosystem+on+the+Greenland+ice+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Glaciology%22%5BJournal%5D)">The cryoconite ecosystem on the Greenland ice sheet.</a> Annals of Glaciology. 51, 123-129 (2010).</li>
<li>Tilg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.I.F.E.%3A+laser+induced+fluorescence+emission%2C+a+non-invasive+tool+to+detect+photosynthetic+pigments+in+glacial+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+SPIE.+8152%2C+Instruments%2C+Methods%2C+and+Missions+for+Astrobiology+XIV%2C+81520I%22%5BJournal%5D)">L.I.F.E.: laser induced fluorescence emission, a non-invasive tool to detect photosynthetic pigments in glacial ecosystems.</a> Proceedings SPIE. 8152, Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology XIV, 81520I. , (2011).</li>
<li>Lorenzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+chlorophyll+and+pheo-pigments%3A+spectrophotometric+equations%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+%26+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Determination of chlorophyll and pheo-pigments: spectrophotometric equations.</a> Limnology & Oceanography. 12, 343-346 (1967).</li>
<li>Kirchman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+bacterial+biomass+production+and+growth+rates+from+leucine+incorporation+in+natural+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Measuring bacterial biomass production and growth rates from leucine incorporation in natural aquatic environments.</a> Methods in Microbiology. , 227-238 (2001).</li>
<li>Bell, R. T. Estimating production of heterotrophic bacterioplankton via incorporation of tritiated thymidine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+RT+%22Handbook+of+methods+in+aquatic+microbial+ecology.+Edited+by%22">Handbook of methods in aquatic microbial ecology. Edited by</a>. Kemp, P. F., Cole, J. J., Sherr, B. F., Sherr, E. B. , CRC press. Boca Raton, FL. 495-503 (1993).</li>
<li>Groemer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+trial+of+a+dual-wavelength+fluorescent+emission+%28L.I.F.E.%29+instrument+and+the+Magma+White+rover+during+the+MARS2013+Mars+analog+mission%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Field trial of a dual-wavelength fluorescent emission (L.I.F.E.) instrument and the Magma White rover during the MARS2013 Mars analog mission.</a> Astrobiology. 14, 391-405 (2014).</li>
<li>Beutler, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Spectral+fluorescence+of+chlorophyll+and+phycobilins+as+an+in+situ+tool+of+phytoplankton+analysis-models%2C+algorithms+and+instruments%22">Spectral fluorescence of chlorophyll and phycobilins as an in situ tool of phytoplankton analysis-models, algorithms and instruments</a>. , Christian-Albrechts Universität Kiel. Doctoral dissertation (2003).</li>
<li>Krogmann, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discoveries+in+Oxygenic+Photosynthesis+%281727-2003%29%3A+A+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Discoveries in Oxygenic Photosynthesis (1727-2003): A Perspective.</a> Photosynthesis Research. 80, 15-57 (2004).</li>
<li>Corrêa, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+saturable+absorption+in+chlorophyll+A+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics+B%22%5BJournal%5D)">Reverse saturable absorption in chlorophyll A solutions.</a> Journal of Applied Physics B. 74, 559-561 (2002).</li>
<li>Kaňa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+S+to+M+fluorescence+rise+in+cyanobacteria+is+due+to+a+state+2+to+state+1+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The slow S to M fluorescence rise in cyanobacteria is due to a state 2 to state 1 transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1817, 1237-1247 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Kalibratie Er was een lineaire correlatie tussen de pigmentconcentratie en de intensiteit van de fluorescentie na het normaliseren van fotoptellingen tot een blootstellingstijd van 1 s. monsters met een lage kolom hoogte en lage pigment concentraties leidden tot een overschatting van de doel pigmenten, in vergelijking met hogere kolom hoogtes met dezelfde pigmentconcentratie. Verdere, zwakke fluorescentie signalen vereist lange blootstellings tijden voor voldoende fotottellingen op de sensor. De lange integratie tijden hebben echter ook de hoeveelheid strooilicht op de sensor verhoogd, wat resulteerde in een afname van de signaal-ruis verhouding. In de huidige versie kan de software geen onderscheid maken tussen ruis en signaal tijdens het datareductie proces. Daardoor leidden lage fluorescentie-intensiteit metingen tot een overschatting van het pigment, omdat ruis werd geteld als een signaal dat is afgeleid van de doel pigmenten. Verder vertoonden fluorescentie intensiteiten van meer geconcentreerde pigment oplossingen een grotere variabiliteit dan lage concentratie oplossingen. Dit effect kan worden verklaard door absorptie processen binnen de pigment oplossingen die werden gebruikt voor de kalibratiecurve.
Gegevensvalidatie voor chlorofyleen kwantificering Na het filteren van ijs-en sneeuw monsters verschenen de driedimensionale samples bijna als een tweedimensionaal specimen op het filter. Dit rechtvaardigde een directe vergelijking tussen L. I. F. E (Area density) en spectrophotometrische gegevens (volumetrische meting).
De gegevensset (Figuur 8) gaf aan dat een hoge pigmentconcentratie leidt tot een onderschatting, terwijl een lage pigmentconcentratie leidt tot een overschatting van de werkelijke waarde. Dit effect kan worden verklaard door de dikte van de filter taart en dus het volumetrische karakter van het monster. De laser penetratie diepte hing af van de optische dichtheid en dikte van het preparaat. Hoge pigment inhoud werd onderschat omdat de laser geen pigment fluorescentie kon opwekken in diepere lagen. In dunne filter cakes werden echter lage fluorescentie signalen opgevangen vanwege de lage dichtheden van pigmenten. Blijkbaar, het filter zelf toonde Laser-geïnduceerde signalen na het passeren van de 450 nm long-pass filter (Figuur 12). Dit signaal werd verkeerd geteld als fluorescentie signaal afgeleid van CHLa. Zo zijn dun en te dik filter taarten moeilijk te meten met het L.I.F.E. instrument.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig12.jpg"> Afbeelding 12: fluorescentie signalen van dikke (A) en dunne (B) filter cakes op een GF/F filter. A) zelf-arcering voorkomt Laser-geïnduceerde fluorescentie van diepere lagen, wat resulteert in een onderschat van de werkelijke pigmentconcentratie. B) fluorescentie emissie van filterkoek met overlay door filter reflecties. (C) onbewerkte gegevens tonen filter reflectie (grijs). De spectrale eigenschap van een in het laboratorium afgeleide CHLeen fluorescentie patroon wordt rood geïllustreerd. Schaalbalk = 45 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig12large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Beperkingen van het L.I.F.E. prototype Tijdens de gegevensreductie interpreteerde de MATLAB gecodeerde software de RAW-afbeeldingen door pixel lijnen binnen een bepaald golflengtebereik op te vatten. De huidige versie van de software heeft geen onderscheid gemaakt tussen organische en anorganische afgeleide signalen. De aanwezigheid van meerdere signalen kan leiden tot een overschatting van het werkelijke pigmentgehalte. Lange blootstellings tijden als gevolg van lage fluorescentie intensiteiten leidden tot een afname van de signaal-ruis verhouding, waarbij het effect werd bevorderd zoals hierboven beschreven (Zie Figuur 8 en Figuur 12).
Een geode rots getoond in afbeelding 13 tentoongesteld rood fluorescerende licht bij blootstelling aan groen en blauw licht. Momenteel is het niet duidelijk of de fluorescentie het gevolg is van mineralen of van op porfyrine gebaseerde moleculen. Daarom kan een overlay van biologische en niet-biologische signalen de toepassing van deze methode beperken en eisen dat een fluorescentie databank wordt opgesteld die specifiek is gemaakt voor het L.I.F.E.-prototype.
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig13.jpg"> Figuur 13: minerale fluorescentie van een geode rots, gevonden in NY-Ålesund. De rots was opgewonden met een 532 nm 50 mW Laser (a) en een 405 nm 50 MW laser (B). Beide Foto's werden opgenomen met een Polarisatiefilter bevestigd op de lens, wat leidde tot een vervalsing van de werkelijke fluorescentie kleuren. C) ware kleurenafbeelding zonder gebruik van een Polarisatiefilter onder daglichtomstandigheden. Schaalbalk = 40 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig13large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Beutler e.a.29 concludeerden dat karakteristieke emissiespectra van cyanobacteriën in mariene ecosystemen afhankelijk zijn van omgevingsomstandigheden. Ook heeft de metabole toestand invloed op de fluorescentie-eigenschappen in fototrofische organismen30. Het L. I. F. E-instrument kan onderscheid maken tussen het algen-en cyanobacteriële fluorescentie patroon door gebruik te maken van bio-vingerafdruk bibliotheken die spectrale informatie bevatten van het preparaat dat gecorreleerd is met omgevingscondities.
In donker aangepaste CHLa moleculen, alle reactie centra zijn volledig geoxideerd en beschikbaar voor Fotochemie en geen fluorescentie opbrengst wordt geblust31. Met behulp van de L.I.F.E.-procedure wordt een specimen eerst opgewonden door een 532 nm-Laser (groen) en vervolgens met een 405 nm-Laser (blauw). Tijdens de tweede excitatie door de blauwe laser kan CHLa een verminderde fluorescentie respons vertonen als gevolg van een eerdere excitatie door de groene laser. CHLa absorbeert energie bij 532 nm golflengte, ondanks de afstand tot de absorptie maximale golflengte32. Vóór de eigenlijke CHLa -meting bij 405 nm kan de groene laser fotochemische reacties veroorzaken, waardoor afschrikkings mechanismen in de doel pigmenten worden geactiveerd. Verder leidde pre-verlichting van mariene fototrofische organismen niet tot een verandering in spectrale norm curves tussen 450 nm – 600 nm terwijl de standaarddeviatie in fluorescentie intensiteiten toenam met 25%29. Afhankelijk van de soort zijn de fluorescentie intensiteiten zelfs toegenomen als reactie op eerdere excitatie. Dit onderwerp vereist verder onderzoek.
Toepasselijkheid We testten het L.I.F.E.-instrument in verschillende habitats met de nadruk op cryoconite-gaten. De laser werd met succes toegepast in de bodem en biofilm habitats vanwege de afwezigheid van omgevingslicht tijdens de meting. Cryoconite granulaat kan worden gemeten wanneer sedimentlagen het licht van onder het gat blokkeren (figuur 14A,C). Dunne sediment cryoconiet gaten waren permeabel voor strooilicht van onder (figuur 14B). Strooilicht interfereert met de meting. Zo is pigmentconcentratie in kale ijsoppervlakken nog niet meetbaar onder daglichtomstandigheden. Signaalverwerking inspanningen zijn momenteel aan de gang om de werking van het systeem in hoge omgevingslichtomstandigheden mogelijk te maken.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig14.jpg"> Figuur 14: Cryoconiet gat met vloeibaar water bovenop. A) cryoconiet op gletsjer met L.I.F.E. lens buis. Schaalbalk = 70 mm. (B) de sediment laag (rood) is erg dun. Strooilicht door de cryoconite-laag. C) de sediment laag is dik genoeg om het verdwaalde licht van beneden te blokkeren. Dit type cryoconite-gat is meetbaar met het L.I.F.E.-instrument. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig14large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Tot slot, ons L.I.F.E. instrument gedetecteerd photoautotrofische organismen in terrestrische habitats zoals bodems, bacteriële matten, biofilms, en in cryoconiet gaten op glaciale oppervlakken. De doel moleculen waren CHLa en B-PE. De ruimtelijke resolutie was 30 μm/px. De aantoonbaarheidsgrens voor CHLa was 250 PG/ml en 2 ng/ml voor B-PE. Na een laboratorium kalibratie konden we het pigmentgehalte kwantificeren in monsters die verzameld werden op onze studie plaats in het noordpoolgebied. We hebben zelf geprogrammeerde software toegepast voor een geautomatiseerd datareductie proces. De effecten van de aanwezigheid van mineralen en veranderende lichtomstandigheden tijdens de metingen vereisen verder onderzoek.
Met klimaatopwarming leiden stijgende temperaturen tot verbeterde beschikbaarheid van vloeibaar water, wat resulteert in een hogere biologische activiteit op ijzige oppervlakken van autotrofische en heterotrofische aard. Er moeten krachtige inspanningen worden geleverd om heterotrofe organismen in situ op te sporen om een volledig beeld te geven van het actieve leven in de cryosfeer. Dit kan worden getest met andere doel pigmenten en geschikte laser excitatie golflengten. Vandaar dat L.I.F.E. een geschikt bewakingssysteem biedt met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie voor supraglaciale omstandigheden in context van wereldwijde verandering en mogelijke astrobiologische toepassingen.

De cryosfeer herbergt zeeijs, gletsjers, hoge bergmeren, sneeuw gebieden, meer ijs, smeltwater stromen en permafrost. Deze gebieden beslaan ongeveer 11% van de aard van de landmassa's1,2en worden door de atmosfeer overbogen als een erkende cryoferische omgeving. Recente studies tonen aan dat massieve gebieden van de cryosfeer snel terugvallen op3,4. De Antarctische wateren5,6, de Alpen7, de Arctische8en andere regio's vertonen negatieve ijsmassa balansen. De terugtrekking van ijskappen en gletsjers leidt tot de uitputting van ons grootste zoet waterreservoir op aarde. In sommige gebieden is Glacier Retreat niet te stoppen5.
Lange tijd werden ijsecosystemen als steriele omgevingen beschouwd. Ondanks de barre omstandigheden is de aanwezigheid van het actieve leven in de cryosfeer van de aarde evident,9,10,11,12,13,14,15 . Door de trend naar massale verliezen van ijs door te smelten, gaat de cryosfeer door een verschuiving in biologische activiteit, waardoor aangrenzende habitats worden aangetast. Om die gedeeltelijk onomkeerbare veranderingen te begrijpen, hebben we methoden nodig om de biologische activiteit in ijs te onderzoeken onder omstandigheden in situ met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.
In supraglaciale omgevingen kan het leven worden gevonden in cryoconiet gaten, sneeuw kappen, gesmolten water, beekjes en op kale ijsoppervlakken. De meest voor de hand liggende habitats van supraglaciale zijn echter cryoconiet gaten. Ze komen wereldwijd voor in glaciaal omgevingen en werden voor het eerst beschreven door de Zweedse ontdekkingsreiziger Adolf Erik Nordenskjold tijdens een expeditie naar Groenland in de16,17van 1870. De naam is afkomstig van de Griekse woorden "kryos" (koud) en "Konia" (stof). Het organisch-organische en anorganische puin wordt op het ijsoppervlak bevestigd en de albedo lokaal verminderd. Zonnestraling bevordert het smelten van het puin in diepere ijslagen, en vormt cilindrische bekkens met sediment (cryoconiet) in de bodem9. Cryoconietgaten beslaan 0,1 – 10% van de glaciale ablatie zones11.
Cryoconite gemeenschappen bestaan uit virussen, schimmels, bacteriën, cyanobacteriën, microalgen en protozoa. Afhankelijk van de regio kunnen ook metazoaanse organismen zoals rotifers, nematoden, copepoden, tardigrades en insecten larven worden gevonden. Edwards en anderen18 beschrijven cryoconiet gaten als "ijskoude hotspots". Ze getraceerde ook functionele genen in cryoconite-gaten die verantwoordelijk zijn voor N-, Fe-, S-en P-fietsen. De ecosystemen van het mini-meer en de fotosynthese zijn te vinden in veel warmere en meer voedingsrijke habitats11. Deze bevindingen benadrukken de belangrijke rol van microbiële sekwestratie in supraglaciale omgevingen. Naast levende gemeenschappen in cryoconiet gaten, worden kale ijsoppervlakken bewoond door ijsalgen. Hun fysiologie is goed bestudeerd19 maar hun ruimtelijke verdeling is niet beoordeeld20. Hun aanwezigheid in supraglaciale omgevingen vermindert de albedo en bevordert daarmee het smelten dat leidt tot een nutriënt naar buiten en nutriënten input in downstreamhabitats9. Toenemende temperaturen en dus een hogere beschikbaarheid van vloeibaar water, beïnvloedt de netto ecosysteem productiviteit in deze ijzige ecosystemen.
In supraglaciale omgevingen transformeren fotosynthetisch actieve organismen anorganische koolstof en stikstof in organische, beschikbare bronnen voor het microbiële voedsel web21,22. Tot nu zijn er weinig studies die supraglaciale koolstof fluxen11,20,23schatten. Het verschil in voorgestelde percentages van de koolstof flux is het gevolg van een lage ruimtelijke en temporele gegevens resolutie. Verder wordt de ruimtelijke spreiding van supraglaciale gemeenschappen buiten cryoconietgaten nauwelijks beoordeeld. Cook en anderen20 voorspeld in hun modellen dat supraglaciale algen Gemeenschappen tot 11x meer koolstof herstellen dan hedendaagse cryoconite gaten vanwege hun grote oppervlakte dekking. De detectie van supraglaciale algen gemeenschappen die de integriteit van monsters veiligstellen, wordt nog steeds belemmerd door ontbrekende hulpmiddelen voor in-situ detectie en kwantificering.
In reactie op problemen in de logistiek worden ijsecosystemen minder vaak bestudeerd dan habitats in gematigde gebieden. De gegevens resolutie is afhankelijk van het aantal beoordeelde monsters en is afhankelijk van de toegankelijkheid van de studie sites. Standaard bemonsteringsmethoden zoals zagen, coring en daaropvolgende smelting impliceren manipulatie van de microbiële Gemeenschap. Bijvoorbeeld, chlorofyla (CHLa) beoordeling in vaste ijs monsters is onmogelijk met standaardmethoden zonder substantiële interferentie. Vandaar dat smelt veroorzaakte temperatuurveranderingen binnen de onderzochte microbiële gemeenschappen onvermijdelijk zijn. In reactie op de thermolabiliteit van het photosystem II en andere cellulaire structuren in psychrophiles22, zullen laboratoriumanalyses van gesmolten ijsmonsters altijd leiden tot een vervalsing van in-situ omstandigheden.
Niet-destructieve in-situ metingen zijn de enige redelijke manier om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Dit doel kan worden bereikt met behulp van fluorescentie-gebaseerde methoden. Vanwege hun lichte oogst functie zijn CHLa en b-phycoerythrin (b-PE) aanwezig in organismen die bijdragen aan de koolstofkringloop in supraglaciale omgevingen, zoals door anesio en anderen11is bewezen. Daarom zijn deze fluorescerende moleculen geschikt biomarkers voor de kwantificering van microbiële gemedieerde koolstof stromen in ijsecosystemen.
In deze studie presenteren we de ontwikkeling, kalibratie en toepasbaarheid van een nieuw niet-invasief hulpmiddel voor in-situ kwantificering van CHLa -en B-PE-moleculen in terrestrische en ijsecosystemen. Het prototype apparaat is gebaseerd op laser-geïnduceerde fluorescerende emissie, ook bekend als L.I.F.E. Het optische instrument (Figuur 1) vangt fluorescerende biomarkerhandtekeningen na laser-geïnduceerde fluorescentie excitatie. De procedure is niet-destructief en kan worden uitgevoerd op de studie locatie of in een laboratorium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig01.jpg"> Figuur 1: het prototype L.I.F.E.. Left: Foto van het apparaat zonder beschermende deksel. Rechts: Schematische illustratie van het instrument. Totale massa = 5,4 kg (laser en optiek = 4,025 kg, laptop = 1,37 kg). Aluminium frame = 32,5 cm x 20,3 cm x 6,5 cm. optische buis: 18,4 cm x 4 cm (diameter). CCD: BlueFox mv220g sensor; F: servo-gestuurde long-pass filters (450 nm en 550 nm); L: optische lenzen; M1: spiegels; M2: dichroïde spiegel; MC: microcontroller; P: prisma; PBS: polariserende bundel splitter; S: spleet diafragma gemaakt van verstelbare Scheermesjes. Schaalbalk = 70 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
De draagbare Dual-golflengte kit weegt 4,5 kg en wordt gebruikt op een statief in combinatie met een externe computer. De veld instelling is snel en eenvoudig. Het instrument is aangesloten op het statief, en de lens buis is aangesloten op het apparaat, samen met een USB-kabel en de camera kabel. De externe computer is aangesloten op het apparaat met behulp van een USB-kabel. De statief poten worden zodanig afgesteld dat de lens buis naar het preparaat gericht en bedekt is. Vervolgens raakt een 5 mW groene laser het monster na het passeren van een polariserende straal splitter die gepolariseerd licht omleidt naar de optische as van de spectrometer. Het preparaat vertoont een fluorescerende licht, geïllustreerd in rood in Figuur 1. De helft van het collimated licht passeert de polariserende straal splitter en is gericht door een servo-gestuurde long-pass filter die de laser signalen verwijdert. Vervolgens raakt het signaal een diafragma spleet die bestaat uit twee verstelbare Scheermesjes. Een prisma onderscheidt de fijne lijn van het licht orthogonaal naar de spleet opening voordat het signaal door de sensor wordt opgevangen. De procedure wordt herhaald met een blauwe laser. De onbewerkte gegevens worden automatisch overgebracht naar een draagbare computer die ook wordt gebruikt voor de software bewerking.
Het instrument wordt bestuurd door een externe computer met behulp van een LabVIEW-omgeving die de beeldweergave synchroniseert met de CCD-camera, lasers in-of uitschakelt en het lange-pass-filter wiel draait. De grafische gebruikersinterface (GUI) is onderverdeeld in drie hoofdsecties. De belichtingscorrectie wordt handmatig uitgevoerd. Hoewel de correctie tussen de blootstellingstijd en de signaalintensiteit lineair is (Figuur 2b), is de maximale belichtingstijd beperkt tot 10 sec., omdat langere integratie tijden leiden tot een significante afname van de signaal-ruis verhouding. Het veld Opmerking wordt gebruikt voor de omschrijving van het monster (Figuur 2a). In het rechter gedeelte worden RAW-afbeeldingen weergegeven zodra de metingen zijn voltooid. Deze functie is cruciaal voor directe gegevensevaluatie in het veld (Figuur 2C – E). Rode gebieden geven overbelichte pixels aan, wat kan worden vermeden door de belichtingstijd te verkorten.
Het daaropvolgende proces voor het reduceren van onbewerkte gegevens wordt losgekoppeld van de beeldverwervings procedure en kan op elk moment na het verzamelen van afbeeldingen worden uitgevoerd.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig02.jpg"> Afbeelding 2: L.I.F.E. grafische gebruikersinterface voor het verzamelen van gegevens en de evaluatie van onbewerkte gegevens. (A) de software maakt handmatige tekstinvoer voor voorbeeld beschrijvingen mogelijk. B) de blootstellingstijd kan vóór de meting worden aangepast. (C − E) De RAW-afbeeldingen worden aan de rechterkant van de interface weergegeven. E) rode kleuren duiden op een verzadiging van de sensor. (F) de activering van de knop uitvoerings meting activeert het proces voor het verzamelen van gegevens. In de array (G) worden alle opdrachten weergegeven die automatisch worden uitgevoerd tijdens het verzamelen van gegevens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig03.jpg"> Afbeelding 3: voorbeeld van een RAW-afbeelding. Left: Ruwe gegevens van CHLa standaard in aceton oplossing, opgenomen met het L. I. F. E-instrument. Als gevolg van de optische eigenschappen van het apparaat, wordt het signaal weergegeven als een vervormde lijn. Rechts: Interpretatie van het RAW-beeld per pixel (px). De spectrale as (5 nm/PX resolutie) wordt uitgezet tegen de ruimtelijke as (30 μm/PX resolutie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
De 12-bits grijs-schaal RAW-beelden tonen een ruimtelijke component als gevolg van de ééndimensionale diafragma spleet en een spectrale component als gevolg van het prisma voor de CCD (Figuur 3). In reactie op optische beperkingen worden de RAW-beelden vervormd. Daarom moeten ze worden bijgesneden en dewarped door het toepassen van een code die de mate van vervorming herkent. Dit wordt gedaan met een software wizard (Figuur 4). Vervolgens wordt de golflengte kalibratie uitgevoerd met de 532 nm laser. Het groene licht wordt geproduceerd door een frequentie verdubbeling van een 1.064 nm infrarood laser. Beide golflengten kunnen worden gedetecteerd door de CCD en daarom kan de spectrale positie van elke pixel automatisch worden berekend in dewarped beelden (Figuur 4).
De foto wordt vervolgens bijgesneden tot een bepaald golflengtebereik (550 – 1000 Nm voor groene laser metingen en 400 – 1000 voor blauwe laser metingen). Grijze waarden van elke pixel in een geselecteerde pixel lijn worden geteld en samengevat. Een grijze waarde kan variëren van 0 – 255. Daarna wordt elke pixel lijn voor één nummer in rekening. Verdere software-instructies op het scherm leiden tot het genereren van een plot met de grijze waarde telt van elke pixel lijn uitgezet tegen de ruimtelijke coördinaten. Dit maakt een kwantitatieve ruimtelijke discriminatie van CHLa en B-PE tegelijkertijd in het monster mogelijk. Bovendien kunnen de spectrale eigenschappen van een monster automatisch worden uitgezet vanuit geselecteerde pixel lijnen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig04.jpg"> Afbeelding 4: RAW-afbeeldingen Dewarpingen. Left: RAW-beeld vastgelegd met een groene laser. Er is geen filter gebruikt. Signalen worden weergegeven bij 532 nm en 1.064 nm. Belichtingstijd = 0,015 s. centrum: het bijgesneden 532 nm signaal wordt gebruikt als een referentielijn om een set beelden te verdraaien. Rechts: De ontwarped afbeelding uit de onbewerkte afbeeldingsbron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>aceton</td><td>Merck</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>B-Phycoerythrin</td><td>Invirtrogen</td><td>P6305</td><td></td></tr><tr><td>Chlorophyll a standard</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6144-1MG</td><td></td></tr><tr><td>formaline</td><td>Merck</td><td>HT501128</td><td>36%</td></tr><tr><td>GF/C filters</td><td>Whatman</td><td>WHA1822025</td><td>25mm diameter</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>H1758</td><td>36,5-38%</td></tr><tr><td>L.I.F.E. Prototype</td><td>University of Innsbruck</td><td></td><td>built on demand</td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Software, Laboratory Virtual Instrumentation Engineering Workbench</td></tr><tr><td>Leucine, L-[4,5-3H], 1 mCi</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET1166001MC</td><td>radioactive</td></tr><tr><td>Liquid scintillation cocktail Beckman Ready Use</td><td>Beckman</td><td>not more available, can be compensated by Ultra Gold, Packard</td><td></td></tr><tr><td>liquid scintillation counter</td><td>Beckman</td><td>out of stock</td><td>LSC 6000 IC</td></tr><tr><td>NaH14CO3 (4 &micro;Ci/ml)</td><td>DHI Denmark</td><td>4 &mu;Ci/ml, 1 ml</td><td>radioactive</td></tr><tr><td>Osmonics polycarbonate filters</td><td>DHI Denmark</td><td>PCTE</td><td>25mm diameter, 0,2&micro;m pore size</td></tr><tr><td>Polyscintillation vials</td><td>Perkin Elmer</td><td>WHA1825047</td><td>20ml</td></tr><tr><td>sample tubes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2318-500EA</td><td>Greiner centrifuge tubes, 50ml</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td>Model U2001, any photometer for absorption spectroscopy measuring at 664nm and 750nm would be appropriate</td></tr><tr><td>trichloric acetic acid (TCA)</td><td>Merck</td><td>T6399</td><td>100%</td></tr><tr><td>ultrasonic probe</td><td>nano lab</td><td>QS1T-2</td><td></td></tr></tbody></table>

laser-geïnduceerde fluorescentie emissie (l.i.f.e.) als nieuw niet-invasief hulpmiddel voor in-situ metingen van biomarkers in cryoferische habitats

Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E.) as Novel Non-Invasive Tool for In-Situ Measurements of Biomarkers in Cryospheric Habitats

De opwarming van de aarde beïnvloedt microbiële gemeenschappen in een verscheidenheid aan ecosystemen, met name cryoferische habitats. Er is echter weinig bekend over microbiële gemedieerde koolstoffluxen in extreme omgevingen. Vandaar dat de methodologie van monster overname beschreven in de weinige beschikbare studies twee grote problemen impliceert: A) gegevens met een hoge resolutie vereisen een groot aantal monsters, die moeilijk te verkrijgen zijn in afgelegen gebieden; B) onvermijdelijke monster manipulatie zoals snijden, zagen en smelten van ijskernen die leidt tot een misverstand over in-situ omstandigheden. In deze studie wordt een prototype-apparaat dat geen monstervoorbereiding of monster vernietiging vereist, gepresenteerd. Het apparaat kan worden gebruikt voor in-situ metingen met een hoge spectrale en ruimtelijke resolutie in terrestrische en ijsecosystemen en is gebaseerd op de L-Aser-Induced Fluorescentie EMission (L.I.F.E.)-techniek. Fotoautotrofische supraglaciale gemeenschappen kunnen worden geïdentificeerd door de detectie van L.I.F.E. handtekeningen in fotografie. De L.I.F.E. instrument kalibratie voor de porfyrine derivaten van chlorofyla (CHLa) (405 nm Laser excitatie) en b-PHYCOERYTHRIN (b-PE) (532 nm Laser excitatie) wordt aangetoond. Voor de validering van deze methodologie werden L.I.F.E. gegevens geratificeerd door een conventionele methode voor CHL,een kwantificering waarbij pigment extractie en daaropvolgende Absorptie spectroscopie betrokken waren. De prototype toepasbaarheid in het veld werd bewezen in extreme polaire omgevingen. Verder testen op terrestrische habitats vond plaats tijdens Mars analoge simulaties in het Marokkaanse dessert en op een Oostenrijkse rotsklimmen. Het L.I.F.E.-instrument maakt scans met een hoge resolutie van grote gebieden mogelijk met een aanvaardbare bedrijfs logistiek en draagt bij aan een beter begrip van het ecologische potentieel van supraglaciale gemeenschappen in de context van mondiale verandering.

Laboratorium kalibratie voor B-PE De respons signalen van de B-PE-verdunnings rij werden gemeten met het L.I.F.E.-instrument in een donkere kamer bij 20 °C (Figuur 6). De telsnelheid hing af van zowel de concentratie als de kolom hoogte van het gemeten monster. Lage concentratie en lage kolom hoogte B-PE specimen fluoresceerd sterker in vergelijking met monsters van dezelfde concentratie en hogere kolom hoogte.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig06.jpg"> Figuur 6: B-PE laboratorium kalibratie. B-PE-inhoud en kalibratie van kolom dichtheid wordt weergegeven. Genormaliseerde tellingspercentages werden berekend voor een kolom hoogte van 1,5 cm. opnieuw afdrukken met toestemming28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Er werd een Poisson-regressie gebruikt voor de uiteindelijke kalibratie lijn. Er was een lineaire correlatie tussen de gebieds dichtheden en het aantal pixels grijswaarde. De functie van de curve was y = 81.04 x (Figuur 7), wat betekent dat een grijswaarde tellings percentage van 8.104 in een 1 s blootgesteld monster gelijk is aan een gebied dichtheid van 100 ng/cm2 B-PE. De CHLa -kalibratie wordt op analoge wijze ingesteld. De functie was y = 8.94 x.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig07.jpg"> Figuur 7: eind kalibratiecurve voor B-PE. De grijze waarde tellingen werden genormaliseerd naar een belichtingstijd van 1 s en uitgezet tegen de dichtheid van het gebied. Opnieuw afdrukken met toestemming28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Toepassing op cryoconite monsters van Spitsbergen en laboratorium validatie van gegevens De gemiddelde waarden van de L.I.F.E. metingen en de enkelvoudige metingen van dezelfde monsters afgeleid van conventionele extractie met behulp van aceton en daaropvolgende analyse met een spectrofotometer worden geïllustreerd in Figuur 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig08.jpg"> Figuur 8: gegevensvalidatie met natuurlijke monsters. De monsters (MLB) worden gerangschikt naar CHLa inhoud, op basis van de resultaten van een laboratorium spectrofotometer (enkelvoudige waarden) en vergeleken met de CHLeen fluorescentie gegevens gemeten op vier willekeurige gebieden per filter. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van de L.I.F.E.-metingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
CHLeen inhoud variërend van 48 μg/l – 67 μg/l werden onderschat, en lagere CHLeen inhoud variërend van 0,7 μg/l – 7 μg/l werden overschat door de L.I.F.E. prototype. De standaardafwijkingen van de L.I.F.E. metingen waren laag.
Vergelijking van spectrale gegevens uit in-situ metingen met laboratorium normen CHLa Spectra waren vergelijkbaar tussen cryoconiet monsters en die van gezuiverd uit a. nidulans algen. De fluorescentie pieken in alle monsters bevonden zich op 700 nm – 710 nm. Spectra uit cryoconiet monsters toonden echter hogere geluidssignalen aan tussen 400 nm – 650 nm en van 800 nm – 1000 nm in vergelijking met spectra van de CHLa pigment norm (Figuur 9).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig09.jpg"> Figuur 9: spectrale gegevens interpretatie. Metingen van vier cryoconite korrels (blauw) en een CHLeen standaard pigment oplossing (rood) na excitatie met 405 nm lasers. De spectra werden 1 jaar na monsterafname opgenomen. De monsters werden bevroren gehouden en werden vóór de meting niet aan het licht blootgesteld. In reactie op golflengte kalibratie problemen, de fluorescentie piek bevindt zich op 700 nm – 710 nm in plaats van 680 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Geautomatiseerde cryoconite korrel analyse In een voorbeeld van een geautomatiseerde analyse van een cryoconiet gat (Figuur 10), werden de hoogste dichtheden van pigment gebied waargenomen bij pixel lijn 50. Het sample spectrum na excitatie met een 532 nm Laser toonde een piek met een cut off bij een grijze waarde van 255 in reactie op oververzadiging van de sensor. Deze piek is afgeleid van de groene laser en niet van het fluorescerende signaal.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig10.jpg"> Figuur 10: geautomatiseerde gegevensanalyse van één cryoconiet korrel met een diameter van 1 mm. Het monster werd verzameld bij Vestre Brøggerbreen (VBB) en gemeten binnen 4 uur na bemonstering in een donkere laboratoriumruimte bij de faciliteit van het Noordpoolgebied (GB) in NY-Ålesund. De linker kolom toont B-PE metingen en de rechterkolom vertegenwoordigt CHLa data. De RAW-afbeeldingen worden bovenaan weergegeven. Laser-geïnduceerde fluorescentie reacties worden grijs weergegeven. Rode gebieden geven de respons van standaard pigmenten aan. De middelste sectie illustreert de ruimtelijke verdeling van de doel pigmenten. De spectrale eigenschappen van het fluorescentie signaal worden in de onderste afbeeldingen weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Impact van laser excitatie op de productiviteit in bacteriële matten De primaire of bacteriële productiviteit werd niet beïnvloed bij het vergroten van de kracht van de laser en/of de blootstellingstijd (Figuur 11). Er werden geen significante verschillen gedetecteerd onder laserbehandelingen met toegenomen vermogen.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig11.jpg"> Figuur 11: productiviteits metingen van monsters van Spitsbergen. Bacteriële matten werden blootgesteld aan groene en blauwe lasers van variërende Laser intensiteiten en blootstellings tijden. De gegevens worden gekleurd volgens de laser golflengte bron (groen en blauw). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Koolstoffluxen in de cryosfeer worden nauwelijks beoordeeld maar zijn cruciaal voor de klimaatverandering. Hier tonen we een nieuw prototype apparaat dat het fototrofische potentieel in supraglaciale omgevingen vangt op basis van laser-geïnduceerde fluorescentie emissie (L.I.F.E.) technologie met hoge spectrale en ruimtelijke resolutie gegevens onder in situ omstandigheden.

Laser-geïnduceerde fluorescentie emissie (L.I.F.E.) als nieuw niet-invasief hulpmiddel voor in-situ metingen van biomarkers in Cryoferische habitats

Global warming affects microbial communities in a variety of ecosystems, especially cryospheric habitats. However, little is known about ...

Het algemene doel van deze studie is het kalibreren en testen van een nieuw apparaat dat kan worden gebruikt voor in-situ metingen van biomarkers in cryosferische habitats. Het apparaat is gebaseerd op Laser-Induced Fluorescentie Emissie technologie, aangeduid als LIFE. De huidige standaardbemonsteringsmethoden leiden tot fysieke effecten op het monster als gevolg van steengroeven, desintegratie van monsters door chippen en zagen, en temperatuurverschuiving door smelten.Deze methoden leiden vaak tot vervalsing van in-situ voorwaarden. Daarom is een nieuwe methodologie voor de in-situ detectie en karakterisering van microbiële leven cruciaal. We hebben een nieuwe niet-invasieve, niet-destructieve methode ontwikkeld met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.De toepassing van een laser-geïnduceerde fluorescentieemissietechniek is gebaseerd op het feit dat supraglaciale omgevingen worden bewoond, onder andere door fototropische organismen. Deze organismen kunnen worden getraceerd door de detectie van fluorescerende patronen van de porfyrine-gebaseerde accessoire pigmenten chlorofyl A en fycoerythrin die worden opgewekt door een blauwe en groene laser respectievelijk. De draagbare dubbele golflengte kit weegt 4,5 kilogram en wordt gebruikt op een statief in combinatie met een externe computer.De lensbuis is gericht op het monster. Dan, een groene vijf milliwatt laser raakt het monster na het passeren van een polariserende bundel splitter die gepolariseerd licht omleidt naar de optische as van de spectrometer. Het exemplaar vertoont een fluorescerend licht geïllustreerd in het rood.De helft van het verzamelde licht passeert de polariserende bundelspl splitter en is gericht door middel van een lange-pass filter dat de lasersignalen verwijdert. Vervolgens raakt het signaal een diafragma spleet die bestaat uit twee verstelbare scheermesjes. Een prisma spectrally scheidt een fijne lijn van licht orthogonale aan de spleet diafragma voordat het signaal wordt vastgelegd op een sensor.De procedure wordt herhaald met de blauwe laser. De ruwe gegevens worden automatisch overgebracht naar een draagbare computer die ook wordt gebruikt voor de software-operatie. Het is verdeeld in drie hoofdsecties.De belichtingsaanpassing gebeurt handmatig. Hier is de correctie tussen belichtingstijd en signaalintensiteit lineair. Het commentaarveld wordt gebruikt voor de beschrijving van een voorbeeld.In de rechtersectie worden ruwe afbeeldingen weergegeven zodra de meting is voltooid. Deze functie is van cruciaal belang voor onmiddellijke gegevensevaluatie in het veld. Rode gebieden geven overbelichte pixels aan die kunnen worden vermeden door de belichtingstijd te verkorten.De 12-bits grijswaarden raw beelden tonen een ruimtelijke component als gevolg van de eendimensionale diafragma spleet en een spectrale component als gevolg van het prisma voor de CCD. In reactie op optische beperkingen worden de ruwe beelden vervormd. Daarom moeten ze worden bijgesneden en ontwared door het toepassen van een code die de mate van vervorming herkent.Vervolgens wordt de golflengte kalibratie gedaan met behulp van de 532 nanometer laser. Het groene licht wordt geproduceerd door frequentieverdubbeling van 1, 064 nanometer infraroodlaser. Beide golflengten kunnen worden gedetecteerd door de CCD en daarom kan de spectrale positie van elke pixel worden berekend in gedewarerde beelden.Vervolgens wordt de afbeelding bijgesneden tot een bepaald golflengtebereik. Grijze waarden van elke pixel in een geselecteerde pixelregel worden geteld en samengevat. Een grijze waarde kan variëren van nul tot 255.Daarna is elke pixelregel goed voor één nummer. In deze grafiek worden de grijze waardetellingen van elke pixelregel uitgezet op basis van de ruimtelijke coördinaten. Dit maakt een kwantitatieve ruimtelijke discriminatie van chlorofyl en fycoerythrin gelijktijdig in het monster mogelijk.Bovendien kunnen de spectrale eigenschappen van een voorbeeld worden uitgezet uit geselecteerde pixellijnen. De veldopstelling is snel en eenvoudig. Bevestig het instrument op een statief.Bevestig de lensbuis aan het apparaat. Bevestig de Arduino USB-kabel en de camerakabel. Sluit de externe computer aan op het instrument via een USB-kabel.Stel de statiefpoten zo in dat de lensbuis het monster bedekt. Voer de software uit, beschrijf het voorbeeld en start een metingsrun. Voor de pigmentkalibratie moet u een verdunningsrijreeks voorbereiden van een voorraadoplossing zoals weergegeven.De chlorofyl Een voorraadoplossing moet worden verdund met aceton en fycoerythrinverdunning wordt uitgevoerd met gedestilleerd steriel water. Vijftien milliliter van elke verdunningsstap zal later nodig zijn. Bescherm de pigmenten tegen licht door ze onder aluminiumfolie te wikkelen.Bewaar het chlorofyl in een vriezer en de fycoerythrin in een koelkast tot verder gebruik. Bouw vervolgens een rek zoals afgebeeld met een hoogteverschil van 1,5 centimeter. Voeg vijf milliliter van de hoogste geconcentreerde verdunning toe in een poly-scintillatie plastic flacon.Dit volume komt overeen met een 15 millimeter hoge waterkolom in de flacon en meet de fluorescentieintensiteit. Plaats vervolgens de flacon in de middelste positie van het rek en voeg nog eens vijf milliliter van dezelfde oplossing toe. Herhaal de procedure met nog eens vijf milliliter die gelijk is aan 45 millimeter in kolomhoogte.Herhaal de procedure met alle verdunningsstappen voor chlorofyl en fycoerythrin. Het rek en de kolomhoogte spelen een belangrijke rol voor de meting aangezien de oppervlakte van de vloeistoffen in het brandpunt van het instrument life ligt. Verzamel sneeuw- en ijsmonsters van een gletsjer.Bovendien, verzamelen microbiële mat monsters van de gletsjer voorveld. In deze studie werd gekozen voor Midtre Lovenbreen, een gletsjer in de buurt van de onderzoeksfaciliteiten van Ny-Alesund in de hoge arctische archipel van Svalbard. Smelt sneeuw- en ijsmonsters en vacuüm filter ze onder GF/F-filters.Let op het gefilterde volume. Meet vervolgens de filters met het LIFE-apparaat op vier willekeurige gebieden, elk in drievoudige met behulp van de groene en blauwe laser. Bereken de totale pigmentconcentratie door de gebiedsdichtheid te vermenigvuldigen met het gefilterde gebied en het gefilterde volume.Normaliseer de pigmentconcentratie tot een volume van één liter. Doe de filters in een flesje met 30 milliliter aceton en bewaar ze 's nachts in het donker op vier graden Celsius. Neem vervolgens een flesje en plaats het op ijs voorafgaand aan sonicatie gedurende twee minuten op 50% vermogen in continue modus.Knijp en verwijder het filter uit de flacon. Het filter is niet meer nodig. Bevestig Tygon buizen aan een spuit en verwijder de chlorofyl extractie aceton mix uit de flacon.Vervang de Tygon-slang door een GF5-filterhouder. Breng de oplossing over in een kwarts cuvette. Na het kalibreren van de absorptiespectrometer voor aceton, plaats het monster met cuvette in de spectrometer en meet de absorbantiefuncties tussen 400 en 750 nanometer.Verwijder vervolgens de cuvette uit de spectrometer en voeg 200 microliter van twee molaire zoutzuur toe aan het monster. Herhaal vervolgens de absorptiemeting om het pheophytinegehalte in het monster te meten. Het effect van de lasermeting op de activiteit van bacteriële gemeenschappen wordt nog niet in detail beschreven.Daarom is het effect onderzocht via primaire en secundaire productie. Voor bacteriële productie, neem vijf aliquots van onze bacteriële mat. Drie aliquots worden gebruikt voor de tritium-gelabelde leucine opname en twee aliquots worden gebruikt als controles.Activeer de besturingselementen met formaldehyde. Voeg tritium-gelabelde leucine toe aan alle aliquots. Herhaal die procedure met alle monsters.Hier wordt de vereiste monsterhoeveelheid getoond voor ons experimenteel ontwerp. Vervolgens bloot de bacteriële mat met de groene en blauwe laser zoals aangegeven in de experimentele setup. Activeer vervolgens alle monsters die nog niet met formaldehyde zijn behandeld.Breng het monster in een cryovial en voeg trichloorazijnzuur of TCA. Centrifuge het flesje op 10.000 g gedurende vijf minuten. Voeg scintillatievloeistof toe en stop de cryovial in een poly-scintillatie flacon.Analyseer de monsters met een vloeibare scintillatieteller en bereken de opnamepercentages. Voor fotosynthese, bereid vijf aliquots als voorheen waarvan er twee zijn verduisterd. Voeg de radioactieve tracer NaH14 CO3 toe en incubbate gedurende vier uur.Na incubatie, stop de reactie door de monsters in aluminiumfolie te verpakken. Meet desintegratie per minuut door vloeibare scintillatie zoals eerder beschreven. Na het normaliseren van de gegevens voor een belichtingstijd van één seconde en een kolomhoogte van 15 millimeter, werd de uiteindelijke kalibratieregel berekend met behulp van een Poisson-regressie.De correlatie tussen gebiedsdichtheid en fotontellingen heeft een lineair karakter. De helling van de bocht is 81,04. Dat betekent dat een foton telling tarief van 8, 104 in een monster blootgesteld voor een seconde is gelijk aan een oppervlaktedichtheid van 100 nanogram per centimeter kwadraat van fycoerythrin.De standaarddeviatie in hogere geconcentreerde monsters kan worden verklaard door een zelfabsorptieproces in het monster. De chlorofyl A kalibratiecurve vertoont vergelijkbare kenmerken en heeft een lineair karakter met een helling van 8,94. Zes gefilterde ijs- en sneeuwmonsters werden gemeten met het LIFE-instrument vóór chlorofylextractie en daaropvolgende absorptiespectrummetingen voor chlorofylgehalteanalyse.De monsters worden besteld door hun chlorofylgehalte verkregen door de absorbantimetrie. De LIFE-gegevens tonen kleine standaarddeviaties waaruit blijkt dat het materiaal op het filter relatief gelijkmatig is verdeeld. Het LIFE-instrument onderschat het chlorofylgehalte van de eerste drie filters.De laatste drie filters, die een lager chlorofylgehalte vertonen, worden overschat door het LIFE-instrument. De reden voor de gegevensongelijkheid kan worden verklaard door de dikte van de filtercake. In dunne filtertaarten, geïllustreerd in oranje, worden lage fluorescentiesignalen vastgelegd als gevolg van lage oppervlaktedichtheden van de pigmenten.De chlorofyl A signalen worden in rood geïllustreerd in dit ruwe beeld. Alle grijze gebieden in deze ruwe afbeelding geeft aan dat het filter zelf laser-geïnduceerde signalen vertoont na het passeren van het 450 nanometer long-pass filter. De software op misleidende wijze telde dit signaal als chlorofyl A fluorescentie.Hoge pigmentinhoud werd onderschat omdat de laser geen fluorescentierespons kon veroorzaken in chlorofyl A moleculen in diepere lagen van de filtercake. Het laserblootstellingsexperiment geeft geen significant effect op de primaire en secundaire productiviteit van bacteriële matten. Noch de belichtingstijd van vijf tot 60 seconden, noch de laserintensiteit variërend van vijf tot 50 milliwatt toonde enig effect op de productiviteitsresultaten.Dit houdt in dat de hogere intensiteiten en blootstellingstijden die nodig zijn om betere signalen te produceren, de cellen niet zouden schaden. Vier cryoconites werden ter plaatse gemeten en ze worden vergeleken met chlorofylstandaardoplossing die werd gemeten onder laboratoriumomstandigheden die in het rood werden weergegeven. De spectrale fluorescentie pieken in blauw afgestemd op de chlorofyl standaard spectrum, waardoor het concept van in-situ metingen.LIFE-metingen zijn uitgevoerd op bodems, bacteriële matten, biofilms en cryoconites. LIFE-metingen van cryoconites met een dikke sedimentlaag zijn mogelijk als het met cryoconite bedekte oppervlak meer dan 12,5 centimeter in het kwadraat bedraagt. Dit soort cryoconite blokken strooien licht van onder het ijs.In dunne cryoconite lagen worden de fluorescentiesignalen gehuld door omgevingslicht. Daarom zijn LIFE-metingen van kale ijsoppervlakken niet mogelijk, terwijl alle andere monstertypen kunnen worden geanalyseerd door het LIFE-instrument. Temperatuurveranderingen leiden tot een grotere beschikbaarheid van vloeibaar water, wat resulteert in een hogere biologische activiteit op gletsjeroppervlakken.Als gevolg hiervan kan de pigmentconcentratie toenemen. Het is van cruciaal belang om deze veranderingen te volgen en mogelijke en waarschijnlijke toekomstscenario's te voorspellen.

laser-induced-fluorescence-emission-life-as-novel-non-invasive-tool

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Laser ablatie electrospray ionisatie (LAESI) is een atmosferische druk ionenbron voor massaspectrometrie. In de beeldvorming modus, een mid-infrarood laser peilt naar de verdeling van moleculen over een tissue sectie of een biofilm. Deze techniek biedt een nieuwe aanpak voor de diverse bio-analytische studies onder autochtone experimentele omstandigheden uitgevoerd.

Atmosferische druk moleculaire beeldvorming van biologische weefsels en biofilms door LAESI massaspectrometrie

Laser-induced afbraak spectroscopie uitgevoerd op dunne orgaan-en tumorweefsel met succes natuurlijke elementen en kunstmatig geïnjecteerd gadolinium (Gd), die met ingang van Gd-gebaseerde nanodeeltjes aangetroffen. Afbeeldingen van chemische elementen bereikt een resolutie van 100 micrometer en kwantitatieve sub-mm gevoeligheid. De verenigbaarheid van de setup met standaard optische microscopie benadrukt het potentieel om meerdere beelden van een zelfde biologisch weefsel te bieden.

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: Een nieuwe aanpak voor de nanodeeltjes&#39;s Mapping en kwantificering in orgaanweefsel

Coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie gebaseerd op inherente trilling van molecuul obligaties maakt label-free chemisch selectieve live cell imaging. Dit werk toont de uitvoering van een aanvullende microscopietechniek op een standaard multifoton laser scanning microscoop gebaseerd op een femtoseconde Ti: saffier laser en een OPO laser.

Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop

Er is een methode ontwikkeld om de specifieke warmtecapaciteit en thermische geleidbaarheid van bladweefsel te bepalen door niet-invasieve, contactloze nabij-infrarode laseronderzoek, wat minder dan 1 minuut per monster vereist.

Een Rapid Laser Probing Methode faciliteert de niet-invasieve en Contacteer-vrij Bepaling van Leaf thermische eigenschappen

In het hart, moleculaire gebeurtenissen coördineren van de elektrische en contractiele functie van het orgel. Een set van de lokale veld fluorescentiemicroscopie technieken hier gepresenteerde maakt de registratie van cellulaire variabelen in intacte harten. Het identificeren van mechanismen voor het definiëren van de hartfunctie is van cruciaal belang in het begrijpen hoe het hart werkt onder pathologische situaties.

Lokale Field fluorescentiemicroscopie: Beeldvorming van cellulaire signalen in Intact Hearts

Low-Intensity Pulsed echografie stimulatie (LIPUS) is een modaliteit voor niet-invasieve mechanische stimulatie van endogene of gemanipuleerde cellen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie. In dit artikel wordt beschreven hoe implementeren van LIPUS om een epi-fluorescentie Microscoop en minimaliseren van akoestische impedantie mismatch langs het pad van de echografie om te voorkomen dat ongewenste mechanische artefacten.

Multiplexing gericht echografie stimulatie met fluorescentie microscopie

Dit protocol beschrijft een originele Setup met een combinatie van spectrale en fluorescentie levensduur metingen om Förster Resonance Energy Transfer (FRET) te evalueren tussen de op Rhodamine gebaseerde fluorescentie sondes en lignine Polymer rechtstreeks in dikke plantendelen.

Meten van interacties tussen fluorescentie sondes en lignine in plantendelen door sFLIM op basis van inheemse Autofluorescentie

Dit artikel beschrijft het gebruik van een nieuwe, snelle optische imager voor de macroscopische fotoluminescentie lifetime imaging van monsters die lang verval uitzenden. De integratie-, beeldacquisitie- en analyseprocedures worden beschreven, samen met de voorbereiding en karakterisering van de sensormaterialen voor de beeldvorming en de toepassing van de imager bij het bestuderen van biologische monsters.

Fluorescentie Lifetime Macro Imager voor biomedische toepassingen

In dit artikel wordt een methode beschreven voor het meten van straling in situ in levend weefsel. Dit werk omvat details van de constructie van sondes op microschaal voor verschillende metingen van straling en bestraling, biedt richtlijnen voor het monteren van weefsel voor de karakterisering van straling en schetst computationele methoden voor het analyseren van de resulterende gegevens.

Een intra-tissue radiometrie microprobe voor het meten van straling in situ in levend weefsel

Deze workflow maakt lamellenproductie mogelijk die gericht is op fluorescerend gelabelde biologische structuren die klein (&lt;1 μm in axiale omvang) en zeldzaam (1 kopie per cel) zijn met behulp van een cryogeen tri-samenvallend beeldvormingsplatform. Dit platform integreert fluorescentiemicroscopie, gefocusseerd ionenbundelfrezen en scanning-elektronenmicroscopie op een enkele brandpuntspositie en maakt gelijktijdige fluorescentiemicroscopie tijdens het malen mogelijk.

Workflow met behulp van een cryogene samenvallende fluorescentie-, elektronen- en ionenbundelmicroscoop voor het gericht frezen van cellen

Ontdek een niet-invasieve methode voor in-situ metingen van biomarkers in cryosferische habitats met laser-geïnduceerde fluorescentie. Deze techniek minimaliseert fysieke impact op monsters en biedt hoge ruimtelijke resolutie voor onderzoek naar microbieel leven.

Laser-geïnduceerde fluorescentie emissie (L.I.F.E.) als nieuw niet-invasief hulpmiddel voor in-situ metingen van biomarkers in Cryoferische habitats (Video) | JoVE Journal

Laser-geïnduceerde fluorescentie emissie (L.I.F.E.) als nieuw niet-invasief hulpmiddel voor in-situ metingen van biomarkers in Cryoferische habitats

Meer video's verkennen