Een geïntegreerde Raman-spectroscopie en massaspectrometrie platform voor het bestuderen van de opname van één cel drug, metabolisme, en effecten

We ontwikkelden een innovatieve methode voor metabolomics. We combineerden de Belfort spectrale beeldvorming van levende cellen met eencellige massaspectrometrie. Onze techniek kan de metabolische veranderingen van enkele cellen tegen geneesmiddelen monitoren en voorspellen.

En dit opent veel toepassing voor basics onderzoek en industrie. Onze methode voegt eencellige resolutie aan de huidige drug evaluatie technieken die sterk zal helpen toekomstige drug discovery inspanningen. Onze techniek kan ons ook helpen de rol te begrijpen die cellulaire heterogeniteit speelt bij kankerresistentie.

De single-cell sampling en data-analyse zijn de meest uitdagende aspecten in dit experiment. We zijn momenteel bezig met het automatiseren van deze twee stappen, met name het bemonsteringsgedeelte. We raden u aan de bemonstering met één cel ruim voor het experiment te oefenen, omdat elke micromanipulator-instelling iets anders is en u de tijd moet nemen om vertrouwd te raken met de besturingselementen.

Na het uitbroeden van cellen tot 70% samenvloeiing, cultuur cellen van belang in een geschikte cultuur media, voeg Penicilline-Streptomycine om besmetting te voorkomen. Na het meten van de celdichtheid op een hemocytometer, subcultuur cellen in een 35 millimeter glazen bodem rooster schotel of kwarts dia's, met behulp van hetzelfde medium bij een zaaidichtheid van 0,7 keer 10 tot de zesde. Dan incubeer op 37 graden celsius voor 24 uur.

De volgende dag bereiken de cellen een samenloop van 50 tot 60%Was de cellen twee keer met een voorverwarmde PBS-buffer bij 37 graden Celsius. Verdeel de cellen in behandelde en onbehandelde subgroepen in 35 millimeter kweekschotels. Meng Tamoxifen opgelost in dimethylsulfoxide met de kweekmedia om een eindvolume van twee milliliter en Tamoxifen concentratie van 10 micromolar te verkrijgen.

Dit is de behandelde groep. Meng een overeenkomstig volume DMSO in het medium als een controlegroep om de effecten van DMSO te bestuderen. Broed beide groepen in twee milliliter van de spiked media gedurende 24 uur om een samenvloeiing van 70 tot 80% voorafgaand aan spectrale metingen te bereiken, controleer het gaatje en laser positie overeenkomen met behulp van een doel.

Om de spectrofotometer voorafgaand aan elk experiment te kalibreren, plaatst u ethanol in een glazen bodemschaal, meet u het spectrum bij een bepaalde laserintensiteit gedurende een seconde en koppelt u de piek aan bekende golflengten. Stel vervolgens de microkamer in op 5% kooldioxide en 37 graden Celsius. Zodra het microscoopsysteem klaar is, verwijder cellen uit de couveuse en spoel onmiddellijk cellen tweemaal met opgewarmde PBS buffer bij 37 graden celsius.

Voeg vervolgens twee milliliter opgewarmde PBS of FluoroBrite DMEM toe. Voeg 10 microliter water toe aan de objectieve lens van de wateronderdompeling. En delicaat plaats de glazen bodem cel schotel op de microscoop podium.

Bevestig het celbemonsteringssysteem op de Raman microscoop. Sluit de 3D-micromanipulator aan op de glazen capillaire houder die is bevestigd aan een lege spuit om het monster te zuigen. Stel de microscoop op een hoge vergroting veld van 40 keer om de punt van het glas capillaire observeren, en zorg ervoor dat het niet is gebroken.

Bedien de positie van de glazen capillaire met behulp van de micromanipulator. Zorg ervoor dat de capillaire tip gecentreerd is in het gezichtsveld. Verplaats vervolgens de capillaire op de Z-as om later toestemming te geven voor het kweekgerecht.

Plaats de monsterschotel op het podium van de microscoop, pas de vergroting en focus aan, selecteer de doelcel op de rasterschaal en verplaats deze naar het midden van de weergave. Meet elke cel door de laserlijn scherp te stellen. Een blootstellingstijd van 15 seconden per cel is voldoende om een dwarsdoorsnede van een cel met een duidelijk Raman-signaal te verkrijgen.

Een galvano-spiegel maakt het scannen van een cel of een groep cellen binnen enkele tientallen minuten. Laat de glazen capillaire vervolgens voorzichtig zakken met behulp van micromanipulator totdat de punt in beeld komt. Raak onder microscopisch beeld de doelcel aan met de capillaire punt.

Dan beginnen met het toepassen van negatieve druk met behulp van de spuit om de cel val in de capillaire tip. Neem deze procedure op door een video te maken om de timing en de gezogen locatie van de cel nauwkeurig te controleren. Verplaats de capillaire omhoog op de Z-as.

Maak vervolgens de capillaire los van de capillaire houder met behulp van tangen ter voorbereiding op massaspectrometrieanalyse. Na het opzetten van de massaspectrometrie-instrument en het analyseren van de media, voeg twee microliters van de ionisatie oplosmiddel aan de capillaire met de cel. Bevestig de capillaire op een nano-elektrospray adapter aangesloten op een geschikte massaspectrometer en start de automatische acquisitiemethode.

Hier wordt een vergelijkende analyse van het gemiddelde spectrum van elke aandoening, met en zonder behandeling van geneesmiddelen, getoond. Het gemiddelde spectrum van de twee voorwaarden verschilt duidelijk op verschillende pieken. Met name de pieken op 1.000 per centimeter, wat een teken is voor aromatische verbindingen zoals fenylalanine en tyrosine, vertonen sterke verschillen.

Op basis van de projectie op latent structuurmodel werden de VIP-scores berekend die het belang van golflengten vertegenwoordigen bij het discrimineren van de experimentele omstandigheden. Belangrijk is dat de hoogste pieken van de VIP-profielen overeenkwamen met Raman-pieken waarvoor sterke verschillen werden gezien tussen de twee behandelingen. Dit bevestigde de specifieke moleculaire verschillen tussen behandelde en onbehandelde cellen.

Na positieve identificatie werden de relatieve overvloed van het medicijn en de metabolieten gemeten in elke cel en vergeleken met achtergrondpieken in onbehandelde cellen. Sterke variatie werd waargenomen in Tamoxifen overvloed. En dit fenomeen was nog duidelijker in het geval van zijn metaboliet 4-hydroxy-tamoxifen.

Onderzoekers kunnen geïnteresseerd zijn in het verkennen van het verband tussen spectrale beelden en de metabole profielen van cellen. Ons onderzoek heeft ook industriële toepassingen omdat het lokale screening van cellen voor farmaceutische productie mogelijk maakt. Er moet voor worden gezorgd bij de voorbereiding van het ionisatieoplosmiddel voor de metingen van de massaspectrometer.

Het moet worden bereid onder een rookkap. Let ook op dat u de ionenbron van het massaspectrometerinstrument niet aanraakt om te voorkomen dat het geëlektrocuteerd wordt. Ten slotte zijn de bemonsteringsvaten die tijdens de meting worden gebruikt, zeer scherp, dus behandel ze met zorg om letsel te voorkomen.