Genetische modificatie van cyanobacteriën door conjugatie met behulp van de CyanoGate modulaire kloon Toolkit

Cyanobacteriën zijn een belangrijk phylum van fotosynthetische microben die steeds meer worden erkend als nuttige platforms voor synthetische biologie en toepassingen van hernieuwbare biotechnologie. Het is dus belangrijk om robuuste technieken te ontwikkelen om het ontwerp, klonen en introductie van heterologe DNA in verschillende cyanobacteriële soorten te vereenvoudigen. Deze techniek toont een gevestigde methode aan, vervoeging of triparental paring genoemd voor het introduceren van DNA in cyanobacteriële soorten die niet van nature getransformeerd zijn.

Vervoeging is met succes uitgevoerd in een breed scala van cyanobacteriële stammen van eencellige tot meercellige filamenteuze soorten. Als u probeert deze techniek voor de eerste keer, zorg ervoor dat zowel uw cyanobacteriële en uw E.coli stammen met zorg te behandelen. Bijvoorbeeld, niet centrifugeren boven de waarden in het protocol en niet vortex.

Het mengen van bacteriën en Cyanobacteriën lijkt misschien vreemd voor de eerste keer gebruikers. Wij hopen dat wij door het vervoegingsproces te demonstreren, zullen helpen dit te verduidelijken. Na de bouw van niveau een assemblages, kies een geschikt niveau T acceptor vector.

Kies een geschikte eindkoppeling om het drietal van het uiteindelijke level één-assemblage te verbinden met de niveau T-backbone. Als u een of meer niveau één samenstellingen in niveau T wilt assembleren, bereidt u een reactiemix voor met PBI1 en de vereiste eindkoppelingsvector. Stel het thermische cycler programma in en ga verder volgens het manuscript.

Kweek op dag één de cyanobacteriële cultuur door een frisse cultuur van Synechocystis PCC 6803 of Synechococcus elongatus UTEX 2973 op te zetten. Schraap met een warmtesteriele lus de cellen van de axenic BG-11 agarplaat en plaats in een 100 milliliter conische kolf gevuld met 50 milliliter verse BG-11 medium om in te enten. Plaats de kolf in een schuddende couveuse met verlichting om de Synechocystis PCC 6803 celculturen te laten groeien bij 30 graden Celsius bij 100 RPM.

Voor Synechococcus elongatus UTEX 2973, groeien de celculturen op 40 graden Celsius bij 100 RPM. Teken na één tot twee dagen een milliliter van de celcultuur en meet op een spectrofotometer. De absorptie bij OD 750 bereikt 0,5 tot 1,5.

Op dag twee inenteert u een MC1061 E.coli helperstam met vectoren PRK24 en PRL528 in vijf milliliter LB-medium met ampicilline bij een concentratie van 100 microgram per milliliter en chloorramphenicol bij een concentratie van 25 microgram per milliliter. Groeien op 37 graden Celsius 's nachts op 225 RPM in een schudden incubator. Dan inenting vijf milliliter van LB medium met geschikte antibiotica met de E.coli cultuur die het niveau T lading vector.

Kweek de cultuur op 37 graden Celsius 's nachts op 225 RPM in een schudden incubator. Op dag drie, centrifuge de helper en de lading E.coli 's nachts culturen op 3,000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant weg zonder de celpellet te verstoren.

Was de pellets door het toevoegen van vijf milliliter verse LB medium zonder antibiotica. Resuspend de pellet door zachtjes pipetten op en neer en centrifuge om de supernatant te verwijderen. Herhaal deze wasstap drie keer om resterende antibiotica uit de nachtcultuur te verwijderen.

Na de laatste wasbeurt, resuspend de cel pellet in de helft van het volume van LB medium van de initiële cultuur volume. Combineer vervolgens 450 microliter van de helperstam met 450 microliters van de ladingssoort in een twee milliliter buis en laat op kamertemperatuur. Bereid vervolgens de cyanobacteriële cultuur voor door een milliliter cyanobacteriële cultuur op 1, 500 g gedurende 10 minuten op kamertemperatuur te centrifugeren.

Gooi vervolgens de supernatant voorzichtig weg zonder de celpellet te verstoren. Was de pellet vier keer door het toevoegen van verse BG-11 medium van hetzelfde initiële volume. Voeg 900 microliter van de gewassen cyanobacteriële cultuur toe aan 900 microliter van de gecombineerde E.coli-stammen in een twee milliliterbuis.

Meng de culturen door zachtjes pipetten op en neer. Incubeer het mengsel op kamertemperatuur gedurende 30 minuten voor Synechocystis PCC 6803 of twee uur voor Synechococcus elongatus UTEX 2973. Centrifugeren het mengsel op 1, 500 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder 1,6 milliliter van de supernatant en resuspend de pellet in de resterende supernatant. Plaats een 0,45 micron membraanfilter op een LB BG-11 agar plaat zonder antibiotica. Zorgvuldig verspreid 200 microliters van de E.coli/cyanobacteriële cultuur mix op het membraan met een steriele spreader of een steriele gebogen tip.

Verzegel de plaat met paraffinefolie en plaats de plaat 24 uur in een verlichte couveuse. Breng het membraan na 24 uur voorzichtig over met vlamgesteriliseerde tangen naar een verse BG-11 agarplaat met geschikte antibiotica om te selecteren voor de ladingsvector. Verzegel de plaat met paraffinefilm en incubbate onder dezelfde omstandigheden als voorheen totdat er kolonies verschijnen.

Kolonies verschijnen meestal na 7-14 dagen voor Synechocystis PCC 6803 en 3-7 dagen voor Synechococcus elongatus UTEX 2973. Om vervoeging te selecteren, selecteert u met behulp van een warmtesteriele inenterende staaf ten minste twee afzonderlijke kolonies uit het membraan en streept u op een nieuwe BG-11 agarplaat met geschikte antibiotica. Dan inenting een streep van cyanobacteriële cultuur in een 15 milliliter centrifuge buis met vijf milliliter LB medium en incubaat bij 37 graden Celsius 's nachts bij 225 RPM in een schudden incubator.

De duidelijke cultuur bevestigt de afwezigheid van E.coli besmetting. Na een voldoende groeiperiode van zeven dagen, kies individuele axenic kolonies op te zetten vloeibare culturen voor de lange termijn cryo opslag of latere experimenten. In deze studie werd de golden gate assembly workflow gedemonstreerd.

Na de transformatie van de assemblagereactie werden succesvolle assemblages geïdentificeerd met behulp van standaard blauwwitte screening van E.coli kolonies. De eYFP-expressiecassette in de vector van niveau één en de eindkoppeling één vector werden vervolgens geassembleerd in een niveau T acceptor vector om de vector cpcBA-eYFP te geven. De geassembleerde cpcBA-eYFP vector werd geverifieerd door beperking spijsvertering.

Succesvolle echtelijke overdracht van cpcBA-eYFP of de pPMQAK1-T vector resulteerde in de groei van maximaal enkele honderden kolonies op het membraan voor Synechocystis PCC 6803 en Synechococcus elongatus UTEX 2973. Zoals verwacht voor de sterke Pcpc560 promotor, de waarden voor genormaliseerde eYFP fluorescentie van de plaatlezer en eYFP fluorescentie per cel van de stroom cytometer waren hoog in vergelijking met de negatieve controle. Met zowel de plaatlezer als de stroomcytometer waren de fluorescentiewaarden hoger in Synechococcus elongatus UTEX 2973 dan in Synechocystis PCC 6803.

Zorg ervoor dat u incubeer voor de minimale tijd volgens welke stam u vervoeging.