Cultuurmethoden om de limiet van detectie en overleving in transportmedia van Campylobacter Jejuni in menselijke fecale specimens te bepalen

De moeilijkheid van Campylobacter cultuur heeft geremd fundamentele studies, zoals hoe weinig bacteriën nodig zijn om ziekte te produceren. Deze gecombineerde analytische en gekunstelde monsters die hier worden gebruikt, kunnen dit probleem aanpakken. Deze techniek maakt het mogelijk klinische relevante symptomen van patiënten te correleren met een positief fecale cultuurresultaat en voor het eerst een daadwerkelijk aantal bacteriën.

Leren hoeveel bacteriën correleren met ziekte zal diagnostiek, een belangrijk doel voor detectie en een solide methode voor het vergelijken van virulentie tussen stammen of soorten Campylobacter. Campylobacter cultuur is eenvoudig, maar het vereist een snelle en georganiseerde voorbereiding om kwantitatieve levensvatbaarheid te behouden. Er is ook een aanzienlijk oordeel nodig om de Campylobacter kolonies te identificeren tussen concurrerende fecale flora op een bord.

Voordat u begint met een C.jejuni- of C.coli-cultuur, trek je handschoenen, een labjas en veiligheidsbril aan en plaats je een wegwerpbeschermend laken in een ontsmette laminaire stroomveiligheidskap. Met behulp van steriele techniek streep elke gehydrateerde of ontdooide bacteriële voorraad op een Campylobacter specifieke agar plaat en plaats de plaat op 37 graden Celsius gedurende 48 uur in een anaerobe pot met een microaerobe atmosfeer gas genereren zakje. 24 uur later, losjes bedekken een fles BHI bouillon en plaats de kolf in een nieuwe anaerobe pot met een zakje dat een microaerobe omgeving zal produceren voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius.

De volgende ochtend gebruik maken van drie milliliter van de pre-verminderde bouillon en een inenten lus om de starter plaat van Campylobacter cultuur schrapen. Breng de drijfmest over in een steriele buis en inenting van de resterende 97 milliliter van de voorgearmde bouillon met de drie milliliter geschraapte drijfmest. Plaats de bouillon in de pot met het gaszakje en broed de cultuur uit op 37 graden Celsius en 115 omwentelingen per minuut op een schuddende couveuse gedurende 48 tot 72 uur, totdat de cultuur een optische dichtheid bereikt op 600 nanometer van niet groter dan 4.

Om het aantal bacteriën in deze zuivere voorraadcultuur vast te stellen, voert acht 10-voudige verdunningsreeksen van 100 microliter bouillon uit in 900 microliter van verdunning. Met behulp van steriele beplating kralen, verspreid 100 microliter van de een keer 10 tot de negatieve vijfde tot de 10 tot de negatieve zevende verdunning op dubbele pre-verminderde Campylobacter specifieke platen en etiket platen met de verdunningsconcentratie voor het plaatsen van de platen in een tweede anaerobe pot met een gas genererende zakje voor 48 tot 72 uur bij 37 graden Celsius. Aan het eind van de groeiperiode selecteert platen met tussen 30 tot 300 kolonies voor het tellen.

Na het tellen gebruik de tellingen om de kolonievormende eenheden per milliliter van de cultuur van de voorraadbouillon volgens de formule te bepalen. Het is van cruciaal belang dat de analytische kolonie tellingen nauwkeurig zijn als dit ten grondslag ligt aan alle stappen met behulp van spiked fecale pool. Onmiddellijk na beplating voor het tellen zoals aangetoond, meng gelijke volumes van bouillon en Campylobacter negatieve fecale pool en maak negen daaropvolgende tweevoudige verdunningen in negatieve fecale pool, het toevoegen van een controleplaat met bouillon met geen Campylobacter aan de fecale pool om te helpen bij het identificeren van de niet-Campylobacter kolonies.

Streep 10 microliter van elke Campylobacter ontlasting verdunning op dubbele pre-verminderde Campylobacter specifieke agar platen en incubeer de platen in anaerobe pot met een gas genererende zakje op 37 graden Celsius gedurende ongeveer 48 uur. Aan het einde van de incubatie visueel onderzoeken de gestreepte platen voor kolonies die lijken op die van pure Campylobacter culturen. Om te bevestigen dat de kolonies zijn eigenlijk Campylobacter selecteer meerdere Campylobacter zoals kolonies voor gram vlekken en visualiseren een dun gestreept gebied door licht microscopie met behulp van een olie onderdompeling lens om gram-negatieve gebogen, spiraal, of sigaar vormige kleine bacteriën te identificeren.

Een negatieve controleplaat zonder toegevoegde Campylobacter is belangrijk voor het helpen om andere fecale flora te identificeren. Overweeg de laatste verdunning die een visuele Campylobacter-achtige gram-negatieve kolonie bevat de grens van cultuurdetectie. En gebruik de formule om de kolonievormende eenheden per milliliter van de positieve verdunning in gekunsteld klinisch fecale specimen te berekenen.

Om de levensvatbaarheid van Campylobacter opgeslagen in transport medium mix een milliliter van Campylobacter bouillon cultuur met een milliliter van negatieve fecale pool te bepalen en voor te bereiden 10 dubbele tweevoudige seriële verdunningen in negatieve fecale pool. Verder verdunen elke verdunning op een extra een tot vier verhouding in Cary-Blair medium en bewaar de 20 verdunning buizen en een negatieve controle in Cary-Blair medium in cap buizen op twee tot acht graden Celsius voor 96 uur. Vanaf het tijdstip nul en om de 24 uur daarna streep 10 microliter aliquots van elke verdunning op Campylobacter selectieve agar platen en incubeer de platen op 37 graden Celsius gedurende 48 uur.

Aangezien er geen onafhankelijke methode is voor het vaststellen van nauwkeurige bacteriële getallen uit patiëntmonsters, kunnen twee gelijktijdige metingen worden uitgevoerd met één zuivere bacteriële voorraad. Een test wordt gebruikt voor de visuele detectie van Campylobacter kolonies van seriële verdunningen van de voorraad bacteriën in een fecale matrix, simuleren van klinische monsters. De andere test wordt analytisch gebruikt, kwantificeren van de kolonie vormende eenheden per milliliter aanwezig in dezelfde bacteriën voorraad cultuur gebruikt voor spiking.

Een belangrijke parameter voor succes is het identificeren van de pinpoint-grootte kolonies onder de concurrerende fecale flora, zoals geïllustreerd door deze representatieve plaat van spiked ontlasting cultuur. Hier kunnen typische gegevens van zeven onafhankelijke experimenten worden waargenomen. Gewoon het identificeren van kolonies die lijken op Campylobacter binnen de fecale culturen is niet genoeg.

Alle kolonies moeten worden bevestigd met gram vlek of meer geavanceerde methoden. We gebruiken een enzym immunoassay dat nauwkeuriger is dan cultuur om ongewone soorten zoals C.upsaliensis of C.lari te detecteren, die slecht groeien op standaard antibiotica die agar bevatten. Deze techniek legt een noodzakelijke basis voor het bestuderen van dingen zoals de niet-symptomatische rijtuig van Campylobacter en of hoge bacteriële belastingen een patiënt een hoger risico op ernstige gevolgen van Campylobacter infectie.

Draag altijd PPE bij het werken met bacteriën, die vaak besmettelijk zijn en gevaarlijk kunnen zijn, en met de negatieve fecale pool die onbekende ziekteverwekkers kan bevatten, zelfs wanneer ze worden verzameld van gezonde donoren.